Dieses Protokoll beschreibt die orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in die Blinddarmwand von immundefizienten Mäusen. Dieses Modell rekapituliert fortgeschrittene metastasierende Darmkrebserkrankungen. Das hier vorgestellte orthotope Darmkrebsmodell rekapituliert das klinische Szenario von fortgeschrittenen Darmtumoren und metastasierenden Erkrankungen bei Darmkrebspatienten, die nicht mit patienteneigenen Organoiden oder patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen untersucht werden können.
Ziehen Sie den Tumor aus einer euthanasierten Maus, indem Sie ihn vorsichtig mit einer Schere und einer Zange von der Haut und dem umgebenden Nicht-Tumorgewebe entfernen. Legen Sie die entnommenen Tumore bei vier Grad Celsius in PBS. Dissoziieren Sie die Tumore mit einer Klinge in einer 10 Zentimeter langen Kulturplatte, die einen Millimeter Medium enthält.
Die homogene dissoziierte Probe wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Geben Sie dann das Medium zu einem Endvolumen von fünf Millilitern hinzu. Geben Sie dann das Aufschlussmedium in das Röhrchen.
Stellen Sie das Röhrchen in einer 45-Grad-Position für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einen Zellkultur-Inkubator. Während der einstündigen Inkubation wird die Lösung alle 15 Minuten mit einer Fünf-Milliliter-Pipette gemischt. Nach der Inkubation fünf Milliliter Medium hinzufügen und gut mischen.
Anschließend wird die Lösung mit einem 100-Mikrometer-Zellsieb in einem sterilen 50-Milliliter-Röhrchen sortiert. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen bei 500g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern 1x RBC-Lysepufferlösung.
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann drei Milliliter Medium hinzu und mischen Sie die Probe. Bei 500g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand absaugen.
Resuspendieren Sie das Pellet mit fünf bis 10 Millilitern Medium und verwenden Sie einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen. Nachdem die Zellen 10 Minuten lang bei 500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden, resuspendieren Sie in 10 Millilitern PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und waschen Sie sie mit 10 Millilitern PBS.
Resuspendieren Sie das Pellet, um eine Konzentration von 20 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie es gut, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten. Bereiten Sie als Nächstes eine 29-g-Spritze für die Blinddarminjektion vor. Geben Sie 50 Mikroliter der Tumorzellsuspension in die Spritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze verbleiben.
Legen Sie die Spritze auf Eis. Sterilisieren Sie zunächst die Operationsstelle, indem Sie sie mit einem desinfizierenden Reinigungsmittel besprühen und abwischen. Enthaaren Sie dann den Bauch mit einem Maushaarentfernungsgerät.
Legen Sie die Maus in Rückenlage und desinfizieren Sie den Bauch, indem Sie sie mit Chlorhexidin oder Povidon-Jod schrubben. Machen Sie einen einen Zentimeter langen Längsschnitt über dem Unterbauch mit einer chirurgischen Schere. Trennen Sie die Haut vorsichtig zu den Seiten, um das Bauchfell freizulegen.
Machen Sie dann einen 0,5 bis einen Zentimeter langen Schnitt in der Bauchfellmembran, der ausreicht, um den Blinddarm zu exteriorisieren. Verwenden Sie eine vorgeschnittene sterile Gaze, um den Blinddarm vorsichtig von der Maus zu isolieren. Befeuchten Sie den Blinddarm während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung.
Immobilisieren Sie den Blinddarm, indem Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette festhalten, und führen Sie die Nadel dann oberflächlich in die Blinddarmwand ein. Injizieren Sie langsam das gesamte 50-Mikroliter-Volumen der Tumorzellsuspension. Dieser Vorgang dauert etwa 10 Sekunden.
Entfernen Sie nach der Injektion langsam die Nadel aus dem Blinddarm und üben Sie mit einem Watte-Applikator sanften Druck auf die Injektionsstelle aus. Reinigen Sie den Blinddarm mit Kochsalzlösung, um alle Ablagerungen zu entfernen und den Blinddarm wieder in den Bauch des Tieres zurückzuführen. Verschließen Sie das Bauchfell mit 5/0-Nähten und dann die Haut des Bauches mit 5/0-Nähten.
Orthotope CRC-PDX-Tumoren wurden im Darm von Mäusen beobachtet, denen Krebszellen von Patienten implantiert wurden. Die histologische Analyse durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung am Blinddarm zeigte das Vorhandensein von Tumorzellen. Die histologische Analyse ergab auch Lungenmetastasen und Lebermetastasen bei den implantierten Mäusen.
Mäuse mit orthotopen Tumoren wurden entweder mit dem Vehikel, dem Testmedikament oder dem Chemotherapeutikum Irinotecan behandelt. Die Analyse von Mikro-CT-Bildern zeigte, dass das Testmedikament im Vergleich zum Vehikel eine Reduktion des Tumorvolumens induzierte, die in Kombination mit einer Irinotecan-Behandlung weiter reduziert wurde. Dieses Modell wird dazu beitragen, die Biologie der Metastasierung in Darmkrebstumoren zu untersuchen.
