Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug für die funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae durch genetische Veränderung der Genexpression in raumzeitlicher kontrollierter Weise. Das binäre System ermöglicht Flexibilität in experimentellen Ansätzen zur phänotypischen Charakterisierung der Transgenexpression, auch wenn schwere Fitnesskosten induziert werden. Dieses System kann zur phänotypischen Charakterisierung von Genen verwendet werden, die möglicherweise an der Insektizidresistenz, der Übertragung von Krankheitserregern oder solchen beteiligt sind, die in genetischen Kontrollmethoden eingesetzt werden.
Fraser Coleman, ein Forschungstechniker, wird helfen, dieses Verfahren zu demonstrieren Beginnen Sie mit dem Sammeln von Puppen mit einem Drei-Milliliter-Pasteur-Pipett aus Kunststoff, bei dem das Ende auf eine klare flache Schüssel geschnitten wird, die für die Verwendung mit einem Stereomikroskop geeignet ist. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Wassers um die Puppen. Schalten Sie die Leuchtstofflampe ein und lassen Sie sie aufwärmen.
Betrachten Sie die räumlich-zeitlichen Farbmuster eines Ausdrucks und eines Verhältnisses verschiedener Phänotypen, die beim Screening auf fluoreszierenden Marker erwartet werden. Wählen Sie den gewünschten Filter am Fluoreszenzsteroskop aus und prüfen Sie, ob ein farbiger Lichtstrahl sichtbar ist, der auf die Mitte der Bühnenplatte gerichtet ist. Zentrieren Sie unter weißem Licht die Puppen im Sichtfeld und bringen Sie sie in den Fokus.
Schalten Sie das weiße Licht aus und verwenden Sie den Feinfokus, um den Bereich der Puppen, der den interessierenden Phänotyp mit einem sichtbaren fluoreszierenden Muster trägt, in den Fokus zu rücken. Verwenden Sie einen feinen Detailpinsel, um die Puppen vorsichtig zu drehen und die Analpaddel so zu bewegen, dass die äußeren Genitalien identifiziert werden können. Separate Puppen basierend auf markanten äußeren Genitalien.
Männchen haben eine lange Röhre, die aus dem letzten rückenförmigen Segment etwa auf der Hälfte der Länge der Analpaddel extrudiert. Die äußeren Genitalien der weiblichen Puppen sind wesentlich kürzer und verzweigen sich. Trennen Sie die geschlechtsspezifischen Puppen in Gruppen von 10 oder weniger in klaren 20-Milliliter-Röhren mit Wasser und versiegeln Sie die Röhren mit einem Wattebausch.
Aspirieren Sie die gewünschte Anzahl von männlichen und weiblichen Erwachsenen aus den Schläuchen in einen Käfig oder einen kleinen Eimer und achten Sie darauf, die Erwachsenen während dieses Transfers nicht zu beschädigen. Halten Sie das Kreuz fünf bis sieben Tage vor der Blutfütterung aufrecht. Am folgenden Tag können Eier gesammelt werden, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen.
Bauen Sie die Eiablagekammer zusammen und führen Sie vorsichtig 10 bis 15 blutverspeiste Weibchen hinein. Decken Sie die Eiablagekammer ab und lassen Sie sie 20 Minuten einwirken. Lösen Sie das 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen vorsichtig vom Eiablagetopf und achten Sie darauf, dass die Moskitos nicht freigesetzt werden.
Decken Sie den Topf ab und lassen Sie die Eier bis zum Entwicklungsstadium von Interesse reifen. Heben Sie Eier mit einem feinen Detailpinsel aus dem Topf auf und legen Sie sie auf Wasser in einen 40 Quadratmeter großen ausgegrabenen Glasblock. Entfernen Sie vorsichtig das Wasser mit einer Mikropipette aus dem Glasblock und decken Sie die Eier in 500 Mikroliter FAA ab.
Schwingen Sie sanft auf orbital shaker bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie die Eier 15 Mal gründlich mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren der FAA-Lösung zu entfernen. Mit einer 1000-Mikroliter-Mikropipette einen Milliliter destilliertes Wasser nach dem anderen hinzufügen und dann entfernen, wobei darauf zu achten ist, dass die Eier dabei nicht beschädigt werden.
Die fixierten Eier mit einem Milliliter Trpis-Lösung bedecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Eier beginnen nach fünf Minuten Inkubation blasse Flecken zu entwickeln und erreichen schließlich eine milchig-weiße Farbe, sobald sie geklärt sind. Spülen Sie die Eier 15 Mal gründlich mit destilliertem Wasser ab, um alle Spuren von Trpis-Lösung zu entfernen.
Die Expression von fluoreszierenden Markern, die vom 3xP3-Promotor angetrieben werden, wird in den Augen und ventralen Ganglien von Anopheles gambiae Puppen beobachtet. Die Verwendung verschiedenfarbiger Fluoreszenzmarker ermöglicht die Auswahl und das Screening von modifizierten Individuen, die verschiedene GAL4- und UAS-Komponenten tragen. Bei der Arbeit mit einem bipartiten GAL4-UAS-System ist es notwendig, Männchen und Weibchen aus verschiedenen Stämmen zu kreuzen, um Nachkommen zu erwerben, die sowohl die GAL4- als auch die UAS-Komponente tragen.
Die Differentielle Morphologie, die im männlichen und weiblichen äußeren Genital von Puppen beobachtet wird, wird für das Sexing verwendet. Ein Beispiel für eine nicht identifizierbare Puppe wird hier hervorgehoben. Die Entfernung des gesamten Wassers aus Puppen, wie auf der rechten Seite gezeigt, erhöht die Sexing-Schwierigkeit, da Analpaddel die Visualisierung von Genitalien verdecken.
Das zweigliedrige GAL4-UAS-System erlaubt die Modifikation der Genexpression auf kontrollierte raumzeitliche Weise. Dies kann visualisiert werden, indem die Oenozyten- und ubiquitären GAL4-Vier-Exprimationstreiberlinien mit der Responder-Linie UAS-mCherry überquert werden. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung eines bipartiten GAL4-UAS-Systems ist die einfache Untersuchung tödlicher Phänotypen bereits im Embryonalstadium.
Um dies zu tun, ist es notwendig, die innere Morphologie der Embryonen zu visualisieren. Die normalen morphologischen Merkmale, die in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung 12, 24 und 36 Stunden nach dem Legen beobachtet wurden, können nach Abschluss des Embryo-Clearing-Protokolls beobachtet werden. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Puppen und Eier nicht austrocknen dürfen.
Daher ist es wichtig, beim Entfernen von Flüssigkeiten schnell zu arbeiten. Die GAL4-UAS-Methode hat es uns ermöglicht, Gene, die an der Insektizidresistenz beteiligt sind, und solche mit potenziellen Anwendungen in Gene-Drive-Kontrollmethoden funktionell zu charakterisieren.
