Das Protokoll, das Liz entwickelt hat, ermöglicht es uns, die Befruchtungsrate von Weißfliegen zu bestimmen. Die Anwendung dieser Technik wird unser Verständnis des Verhaltens und der Ökologie von Weißfliegen verbessern. Weißfliegen sind haplodiploid, so dass die Befruchtungsrate gleich dem Geschlechtsverhältnis bei Oviposition ist.
Dieses Protokoll ist nach unserem Wissen das erste für Weißfliegen beschriebene Protokoll und kann innerhalb von drei Stunden abgeschlossen werden. Um zu beginnen, machen Sie ein überdeckendes Loch in der Petrischale Abdeckung zu einfügen und die erwachsenen Weißfliegen zu entfernen. Richten Sie eine Feuchtigkeitskammer ein und gestalten Sie eine Sonde, indem Sie einen dünnen Stift in einem komfortablen Arbeitswinkel in eine geschmolzene Pipettenspitze einsetzen, um eine dünne Sonde zu bilden.
Optional längliche Glaspipettenspitzen mit Wärme für eine einfachere Handhabung von Whitefly-Eiern. Dann lassen Sie weibliche Weißfliegen auf einem sauberen Blatt oviposit, geschnitten, um auf Agar in einer Petrischale passen. Während der Whitefly-Oviposition, reinigen Sie ein Mikroskop-Dia mit Seife und Wasser.
Trocknen Sie es gut und dehnen Sie ein Stück Paraffinfilm über ein Ende, damit Flüssigkeiten Tropfen bilden und Eier leichter zu sehen sind. Um Eier zu dechorisieren, verwenden Sie eine Glas Pasteur Pipette, um Tropfen von 83%Natriumhypochlorit-Bleichlösung zum Paraffinfilm direkt vor der Entfernung von Erwachsenen und Ei-Sammlung hinzuzufügen. Bleichmittel und Eisessig sind beide ätzend.
Sie sollten mit Handschuhen in einer Kapuze oder gut belüfteten Bereich behandelt werden. DAPI ist auch reizend und sollte mit Handschuhen behandelt werden. Dann entfernen Sie die erwachsenen Weißfliegen aus dem Blatt und legen Sie das Blatt unter ein Mikroskop.
Heben Sie jedes Ei vorsichtig von seiner Basis, bis der Pedicel aus dem Blatt entfernt wird. Üben Sie auf vielen Eiern, bevor Sie dieses Protokoll ausführen. Heben Sie die Eier langsam von der Basis und heben Sie es vollständig aus dem Blatt, sobald Sie sehen können, dass das Ei Pedicel aus dem Blatt entfernt wird.
Zwei bis drei Eier auf jeden Tropfen Bleichmittel geben und 10 Minuten lang lassen. Um die Eier zu fixieren, verwenden Sie eine Glaspipette, um die Bleichmittel zu entsorgen. Dann Tropfen Eisessigsäure hinzufügen und drei Minuten warten.
Als nächstes entfernen Sie die Eisessigsäure und fügen Sie Tropfen von Clarkes Lösung hinzu. Warten Sie dann 10 Minuten, bis der größte Teil der Lösung verdampft ist. Tropfen von 70% Ethanol hinzufügen und 10 Minuten warten.
Um die Eier zu färben, entfernen Sie zuerst alle Rest-Ethanol. Dann tropfen von 1xPBS zu den Eiern hinzufügen, um den pH-Wert nahe sieben zu bekommen. Setzen Sie das Mikroskop in eine Feuchtigkeitskammer, um austrocknung zu verhindern.
Nach 30 Minuten entfernen Sie die 1xPBS und fügen Sie Tropfen von 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI hinzu. Setzen Sie das Mikroskop in eine dunkle Feuchtigkeitskammer und warten Sie mindestens 15 Minuten. Um Eier zu waschen, entfernen Sie zuerst die DAPI-Lösung.
Dann Tropfen von 1xTBST zu den Eiern hinzufügen. Entfernen Sie nach fünf Minuten die 1xTBST. Wiederholen Sie diese Wäsche zwei weitere Male für insgesamt drei Wäschen.
Nach der letzten Wäsche alle Eier aus dem Parafilm vorsichtig auf einen sauberen Teil des Mikroskopschlittens pfeifen. Entfernen Sie überschüssiges TBST und fügen Sie 20 Mikroliter Montagemedien hinzu. Schließlich legen Sie eine saubere Abdeckung Folie auf die Eier, versiegeln Sie die Abdeckung Schiebe mit klarem Nagellack für die langfristige Lagerung, und gehen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop bildgeben.
Die Eidechorionation gefolgt von dAPI-Kernfärbung ermöglichte die Zuordnung von Befruchtung und Embryosex, wenn sie mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurde. Der weibliche Vorkern befindet sich in der Nähe des Zentrums sowohl der befruchteten weiblichen Eizelle als auch der unbefruchteten männlichen Eizelle, und das Sperma ist nur als heller Streifen in der Nähe der Spitze des weiblichen Eises sichtbar. Eine Anwendung dieser Technik ist zu bestimmen, ob bakterielle Endosymbionte primäre Geschlechtsverhältnisse von Weißfliegen beeinflussen.
Zum Beispiel zeigten die primären Geschlechtsverhältnisse von Eiern, die von Rickettsia-infizierten und nicht infizierten B.tabici Whiteflies gelegt wurden, keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Geschlechtsverhältnis in den beiden Behandlungen. Was die bis ins Erwachsenenalter aufgezogenen Eier betrifft, so wurden ähnliche Ergebnisse für Rickettsia-infizierte und nicht infizierte Erwachsene beobachtet, was zumindest in dieser Studie keine Hinweise auf eine höhere Befruchtungsrate von Rickettsia-infizierten Frauen lieferte. Mit diesem Protokoll kann man feststellen, ob interspezifische Spermien Eier befruchten können.
Wenn keine Befruchtung beobachtet wird, könnte man wieder aufstehen und schauen, ob Spermien während der Paarung übertragen werden, indem man in die Spermaa des Weibchens schaut. Wenn es zu einer Befruchtung kommt, könnte man das Geschlechterverhältnis von Erwachsenen mit der Befruchtungsrate vergleichen, um die Lebensfähigkeit der Entwicklung hybrider Nachkommen zu bestimmen.
