Dieses Protokoll ermöglicht es uns festzustellen, ob Fehlsinnvarianten in menschlichen Genen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, die Proteinfunktion beeinflussen. Dies ist selbst mit modernsten Algorithmen rechnerisch schwer zu erreichen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Analyse von Missense-Varianten in menschlichen Proteinen mit einem In-vivo-System Drosophila melanogaster, das schneller und kostengünstiger als Wirbeltiermodellorganismen ist.
Der Nachweis, dass eine bestimmte Variante die Proteinfunktion direkt beeinflusst, trägt direkt zur Diagnose seltener Krankheiten bei und dient als Ausgangspunkt für die Analyse von Krankheitsmechanismen und potenziellen Therapien. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn Varianten untersucht werden, die mit seltenen Krankheiten in Verbindung stehen, aber es kann auf häufigere Krankheiten wie Autismus und Krebs angewendet werden. Die Identifizierung reproduzierbarer Phänotypen in Fliegen, die die Proteinfunktion widerspiegeln, kann eine Herausforderung sein.
Die Phänotypen können von Gen zu Gen variieren und subtil sein. Funktionelle Studien von Varianten in menschlichen Proteinen mit Drosophila können auf der Grundlage von Rettungsexperimenten oder Überexpressionsstudien durchgeführt werden. Vor Beginn des Verfahrens, sammeln Sie Informationen über das menschliche Gen von Interesse und seinen Modellorganismus Orthologs.
Um die Variantenfunktion durch Überexprimierung von Referenz- und Varianten-Humanproteinen im visuellen Flugsystem zu testen, erzeugen Sie transgene Fliegen, die referenz- oder variantenweise menschliche cDNAs unter der Kontrolle der Vorstrom-Aktivierungssequenz oder des UAS-Systems Gal4 ausdrücken. Um eine bestimmte Gal4-Linie auszuwählen, um die menschlichen Proteine in einem bestimmten Fliegengewebe auszudrücken, kreuzen Sie drei bis fünf jungfräuliche Weibchen aus der Gal4-Linie mit drei bis fünf Männchen aus jeder der transgenen Linien der UAS human cDNA in einzelnen Durchstechflaschen oder in Duplikaten. Übertragen Sie die Kreuze alle zwei bis drei Tage, um so viele Tiere wie möglich von einem einzigen Kreuz zu erhalten, und untersuchen Sie das geschlossene Tier unter einem Seziermikroskop, um Unterschiede zwischen der Referenz- und den Variantenstämmen zu identifizieren.
Wenn ein sichtbarer Defekt vorliegt, stellen Sie die Fliegen ab, um die Phänotypen zu dokumentieren. Um Fliegen zu erzeugen, um funktionelle Defekte im visuellen System zu testen, kreuzen Jungfrauenweibchen von der Rhodopsin-1-Gal4-Linie zu Männchen mit Referenz- oder Varianten-UAS-Human-cDNA-Transgenes, um die menschlichen Proteine auszudrücken, die an den Photorezeptoren R1 bis R6 in der Fliegennetzhaut von Interesse sind. Sobald die Fliegen zu schließen beginnen, sammeln Sie die Nachkommen in frische Fläschchen und geben Sie die Fläschchen zu einem Inkubator eingestellt auf die entsprechende experimentelle Temperatur für weitere drei Tage, damit das visuelle System reifen.
Am Ende der Inkubation, immobilisieren Sie die Fliegen mit einer geeigneten Anästhesie-Methode und kleben Sie sanft eine Seite jeder Fliege auf ein Glasmikroskop-Dia. Nach dem Aufstellen eines Elektroretinogramm-Rigs eine 1,2-Millimeter-Glaskapillare in einen Nadelzieher geben und das Kapillarrohr brechen, um zwei scharfe hohle konische Elektroden mit weniger als 0,5 MillimeterDurchmessern zu erhalten. Füllen Sie die Kapillaren mit 100 Millimolaren-Salzlösung, um Luftblasen zu vermeiden und schieben Sie die Glaskapillaren über die Silberdrahtelektroden.
Klemmen Sie die Kapillaren an Ort und Stelle und akklimatisieren Sie die Fliegen, um Dunkelheit für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur zu vervollständigen. Legen Sie am Ende der Behausung die Folie mit den Fliegen auf das Aufnahmegerät und bewegen Sie die Mikromanipulatoren, die die Referenz- und Aufzeichnungselektroden in der Nähe der Flugweite des Interesses tragen. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode, legen Sie vorsichtig die Referenzelektrode in den Thorax der Fliege, die die Nagelhaut durchdringt, und legen Sie die Aufnahmeelektrode auf die Oberfläche des Auges.
Achten Sie bei erfolgreichen Elektroretinogrammaufnahmen darauf, die Aufnahmeelektrode entsprechend mit Druck zu belasten, so dass sie ein kleines Grübchen verursacht, ohne in das Auge einzudringen. Wenn die Elektroden platziert sind, schalten Sie das Primärlicht für drei Minuten aus, um die Fliegen in die dunkle Umgebung zu akklimatisieren. Am Ende der Wiederakklimatisierungsphase öffnen und schließen Sie den Verschluss einmal pro Sekunde für 20 Sekunden, indem Sie die Elektroretinogramme von mindestens 15 Fliegen pro Dia pro Genotyp pro Zustand mit den gleichen Elektroden aufzeichnen.
Wenn die Aufnahmen von der Referenz und Variantenfliegen vollständig sind, vergleichen Sie die Elektroretinogramm-Aufnahmen aus der Referenz, Variante und Steuerung, um Unterschiede zu bewerten. Anschließend evaluieren Sie die Elektroretinogrammdaten auf Veränderungen bei Transienten, Depolarisation, Off-Transienten und Repolarisation. In diesem repräsentativen Experiment wurden überexpressionbasierte Studien für TBX2 durchgeführt, da die menschliche Referenz TBX2 nicht in der Lage war, das orthologe Fliegengen funktionell zu ersetzen, was rettungsbasierte Strategien unmöglich machte.
Wenn Referenz humanes TBX2 im sich entwickelnden Auge und Inteilen des Gehirns mit augenlosem Gal4 überexprimiert wurde, führt die Überexpression zu einer ungefähr 85%tödlichen Und signifikanten Verringerung der Augengröße. Im Gegensatz dazu ist die Variante Transgen weniger potent bei der Entstehung von Letalität und induziert einen kleinen Augen-Phänotyp mit dem gleichen Treiber unter identischen experimentellen Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die Variante die Proteinfunktion beeinflusst. Darüber hinaus verursacht die Überexpression eine signifikante Veränderung der Elektroretinogrammspur, wenn ein Referenz-Human-TBX2 in den Photorezeptoren mit Rhodopsin Gal4 überexprimiert wird.
Dieser Phänotyp ist milder, wenn das Variantenprotein exprimiert wird, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass die Variante des Interesses die Proteinfunktion in vivo beeinflusst. Es ist wichtig zu beachten, dass jedes Gen einzigartig ist, so dass es kein einziges Experiment gibt, das die Auswirkungen aller krankheitsassoziierten Varianten bewerten kann. Neben der Arbeit mit humanen cDNAs kann man auch feststellen, ob die Variante funktionelle Folgen hat, indem analoge Varianten in evolutionär konservierte Rückstände des orthologen Fliegengens eingeführt werden.
Mit dieser Methode haben wir in Zusammenarbeit mit dem Undiagnosed Disease Network und anderen Gruppen zu einer Reihe von Genentdeckungsstudien für menschliche Krankheiten beigetragen.
