Diese Methode ermöglicht es uns, zu charakterisieren, welche Chemotherapeutika durch SAMHD1 hydrolysiert werden, und kann als Screening-Assay verwendet werden, um niedermolekulare Inhibitoren dieses Enzyms zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach und kostengünstig ist und eine große Menge an Informationen darüber liefert, wie verschiedene kleine Moleküle mit diesem Enzym interagieren. Das Verfahren wird von Miriam, einer Postdoktorandin aus der Gruppe, demonstriert.
Bereiten Sie zunächst den vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer vor, indem Sie Tween-20 und TCEP zu den Endkonzentrationen von 0,005 % bzw. 0,3 Millimolar hinzufügen. Bereiten Sie die EDTA-Stopplösung vor, indem Sie EDTA zu einer Endkonzentration von 7,9 Millimolar in einem vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer hinzufügen. Bereiten Sie Malachitgrün oder MG-Arbeitslösung vor, indem Sie 10 Teile MG-Stammlösung mit 2,5 Teilen 7%igem Ammoniummolybdat und 0,2 Teilen 11%Tween-20 mischen.
Mit einer Mehrkanalpipette werden die Testverbindungen in dem entsprechenden Lösungsmittel auf das 100-fache der Endkonzentration in einer durchsichtigen 96-Well-Platte aus Polypropylen mit rundem Boden verdünnt. Verdünnen Sie diese Verbindungen weiter auf das 25-fache der Endkonzentration mit vollständigem SAMHD1-Reaktionspuffer, um die endgültige Lösungsmittelkonzentration unter 1 % zu halten. Geben Sie fünf Mikroliter verdünnte Komponente in die entsprechenden Vertiefungen einer durchsichtigen 384-Well-Assay-Platte mit flachem Boden und wiederholen Sie den Vorgang mit reinen Lösungsmittel-Kontrollproben. Für die Enzym-Mastermix-Zubereitung werden das rekombinante humane SAMHD1-Protein und die rekombinante Pyrophosphatase in einem vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer auf das Vierfache der gewünschten Endkonzentration verdünnt.
Bereiten Sie den Aktivator oder das Substrat dGTP vor, indem Sie die Lösung in einem vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer verdünnen, um eine mikromolare Konzentration von 50 zu erreichen. In die Vertiefungen, die Verbindungsverdünnungen und die Lösungsmittelkontrolle enthalten, werden fünf Mikroliter SAMHD1-Pyrophosphatase-Mastermix und in die Nicht-Enzym-Kontrollvertiefungen fünf Mikroliter vollständiger SAMHD1-Reaktionspuffer gegeben. Geben Sie dann 10 Mikroliter dGDP-Lösung in alle Vertiefungen, um die Reaktion zu starten, und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Um die Reaktion zu stoppen, fügen Sie 20 Mikroliter EDTA-Stopplösung hinzu. Nach Zugabe von 10 Mikrolitern MG-Arbeitslösung zu allen Vertiefungen wird der Inhalt mit einem orbitalen Mikrotiterplattenschüttler gemischt und die Platte eine Minute lang bei 1000 x g zentrifugiert. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und lesen Sie die Absorption bei 630 Nanometern in einem Mikrotiterplatten-Reader ab.
Berechnen Sie die Standardabweichung der Positivkontrollvertiefungen und berechnen Sie dann den Mittelwert. Berechnen Sie in ähnlicher Weise für die Negativkontrollvertiefungen die Standardabweichung und dann den Durchschnitt. Die Berechnung des Z-Faktors ist ein Indikator für die Qualität des Assays.
Normalisieren Sie jeden Absorptionswert auf die Mittelwerte von Positiv- und Negativkontrollen. Festlegen der Positivkontrolle auf 100 % SAMHD1-Aktivität und der Negativkontrolle auf 0 % SAMHD1-Aktivität. Die SAMHD1-Aktivität ist eine Funktion der Substanzkonzentration und passt zu einer Dosis-Wirkungs-Kurve mit vier Parametern mit variabler Steigung, die die Bestimmung der halben maximalen Hemmkonzentration der Verbindung ermöglicht.
Verdünnen Sie die Nukleotidanalogien und den vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer auf das Vierfache der Endkonzentration und geben Sie fünf Mikroliter in die entsprechenden Vertiefungen einer 384-Well-Assay-Platte. Zur Herstellung des Enzyms SAMHD1 oder Pyrophosphatase-Mastermix wird das rekombinante humane SAMHD1-Protein und die Escherichia coli-Pyrophosphatase in einem vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration verdünnt. Stellen Sie nur Pyrophosphatase-Lösung her, indem Sie die rekombinante Escherichia coli-Pyrophosphatase auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration im vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer verdünnen.
In ähnlicher Weise werden die Aktivatoren GTP und dGTP alpha S hergestellt, indem die Substanz im vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer auf das Vierfache der Endkonzentration verdünnt wird. Geben Sie fünf Mikroliter des Aktivators, entweder GDP oder dGTP alpha S oder vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer, in die entsprechenden Vertiefungen einer 384-Well-Assayplatte, die die Nukleotidanaloga enthält. Beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter SAMHD1-Pyrophosphatase-Mastermix, Pyrophosphatase allein oder vollständigen SAMHD1-Reaktionspuffer in die entsprechenden Vertiefungen geben und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach Beendigung der Reaktion mit EDTA-Stopplösung werden 10 Mikroliter MG-Arbeitslösung in alle Vertiefungen gegeben. Sobald der Inhalt vermischt ist, zentrifugiert man die Platte eine Minute lang bei 1000 x g und inkubiert sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Messen Sie dann die Absorption bei 630 Nanometern.
Berechnen Sie die durchschnittlichen Absorptionswerte für die Reaktionsvertiefungen nur für die Pyrophosphatase, die den Hintergrundwert darstellen. Subtrahieren Sie dann den Hintergrundwert von den entsprechenden Vertiefungen in der SAMHD1- oder Pyrophosphatase-Reaktion. Abschließend werden die korrigierten Absorptionswerte für jedes Nukleotidanalogon mit Puffer-GTP- und dGTP-alpha-S-Bedingungen aufgetragen.
In der vorliegenden Studie stieg das Absorptionsmittel mit steigender Natriumphosphatkonzentration nach Inkubation mit Malachitgrün-Reagenz an und erreichte eine Sättigung bei 0,25 Millimol. Der lineare Nachweisbereich von Phosphat liegt zwischen 0,004 und 0,03 Millimolar. Die Notwendigkeit von Assay-Komponenten, eine messbare SAMHD1-Aktivität zu erreichen, wird veranschaulicht.
Weder SAMHD1 noch Pyrophosphatase allein konnten in Gegenwart von dGTP ein organisches Phosphat erzeugen. Wenn jedoch alle Assay-Komponenten vorhanden waren, wurde ein Anstieg des Signals beobachtet. Die für SAMHD1-Inhibitor-Verbindungen erhaltenen Dosis-Wirkungs-Kurven zeigten, dass steigende Konzentrationen die SAMHD1-Aktivität wirksam hemmen.
Hydroxyharnstoff hemmt die SAMHD1-Aktivität in vitro nicht, was durch eine unbeeinflusste SAMHD1-Aktivität mit steigender Hydroxyharnstoffdosis angezeigt wurde. Die dGTP-Bindung an beide allosterischen Stellen aktiviert SAMHD1 und ermöglicht die anschließende Hydrolyse dieses Nukleotids, während die anderen drei kanonischen dNTPs zuerst eine GTP-Aktivierung der ersten allosterischen Stelle benötigen, bevor sie die zweite allosterische Stelle binden und dann an der katalytischen Stelle hydrolysieren können. Für Nukleotidanaloga ist Clofarabintriphosphat ein Aktivator der allosterischen Stelle zwei und ein Substrat, da die Aktivität in Gegenwart von GTP beobachtet wird.
Während Cytarabintriphosphat nur in der Lage ist, die katalytische Stelle zu besetzen, da dGTP alpha S benötigt wird, um die Aktivität zu beobachten. Es wurde keine Aktivität mit Gemcitabintriphosphat beobachtet. Nach der Identifizierung von kleinen Molekülen, die SAMHD1 in diesem Assay hemmen, können physikalische Ansätze, wie z. B. thermische Verschiebungsassays, verwendet werden, um die Zielbindung zu untersuchen.
Die hier gezeigte Methode half uns zu verstehen, welche der Krebsmedikamente durch SAMHD1 hydrolysiert werden können, und dieses Enzym als potenzielles therapeutisches Ziel zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen zu etablieren.
