Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die tRNA-Isopentenyl Transferase Activity In Vitro biochemisch zu charakterisieren. Diese Methode ist nützlich für den In-vitro-Nachweis und die Charakterisierung der tRNA-isopentenyltransferase Aktivität von gereinigten rekombinanten Enzymen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um einen einfachen und direkten Assay handelt, der verwendet wird, um eine kovalente RNA-Modifikation zu detektieren.
Obwohl diese Methode Einblicke in die tRNA-isopentenyl transferase Aktivität bietet, ist es potenziell anpassungsfähig für die biochemische Charakterisierung von breiten Spektrum oder RNA modifizierenden Enzymen. Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die gründliche Reinigung der Glasplatten, die zum Gießen des Gels verwendet werden. Waschen Sie die Platten mit Seife und Wasser, spülen Sie gut mit entionisiertem Wasser, und reinigen Sie dann die Platten mit Isopropanol und fusselfreien Tüchern.
Als nächstes montieren Sie die Platten und Abstandshalter. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um ein 100 Milliliter 20%Acrylamid, 7,5 Molarenharnstoff, 1x TBE-Gel herzustellen. 80 Milliliter Harnstoffgelkonzentrat, 10 Milliliter Harnstoffgelverdünnung und 10 Milliliter Harnstoffgelpuffer.
40 Mikroliter T-med und 800 Mikroliter frisch zubereitetes 10%Ammoniumpersulfat in die Mischung geben. Ziehen Sie die Gellösung in eine große Spritze und geben Sie die Gellösung zwischen den Glasplatten, die auf das Glas tippen, während Sie die Lösung ausgeben, um Blasenbildung zu verhindern. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur 30 Minuten erstarren.
Nachdem das Gel erstarrt ist, pflanzen Sie das Gel auf ein vertikales Gelgerät. Füllen Sie die oberen und unteren Pufferkammern mit 1x TBE. Zwei Stunden vor dem Laden des Gels, führen Sie das Gel mit 20 Milliampern für zwei Stunden vor, damit die Puffergrenze die kleinsten Oligonukleotide auslaufen lässt.
Bereiten Sie jede Reaktion für die RNA isopentenylation Assay in einem endigen Volumen von 17 Mikrolitern vor. Fügen Sie zu jeder Tube 50 Millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 Millimolar ATP, 5.8 Millimolar Magnesiumchlorid, 0,2 Millimolar DMAPP, 10 Einheiten RNase-Hemmer, 40, 000 CPM intern 32P beschriftet ERNA, 5,3 mikromolar Mod5 und 1,2 Millimolar 2-Mercaptoethanol. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Nach einer Stunde fällt Ethanol die RNase mit 2,5 Volumen von 100% Ethanol und 1/10 Volumen von 3,5 Mol-Natriumacetat pH 5,5 aus und platziert sie eine Stunde lang negativ 20 Grad Celsius über Nacht. Anschließend zentrieren Sie die RNA-Proben 20 Minuten lang bei 15, 400 g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie jedes RNA-Pellet mit 500 Mikrolitern 70%Ethanol.
Zentrifugieren Sie die Proben bei 15, 400 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und trocknen Sie die RNA-Pellets 15 Minuten lang an der Luft oder bis das gesamte Ethanol verdampft ist. Als nächstes wird jedes RNA-Pellet in 10 Mikrolitern von acht Molharnstoff wieder ausgesetzt.
Fügen Sie 150 Einheiten RNase T1 zu jeder Probe hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag zwei Mikroliter 6x Ladepuffer zu jeder Probe hinzufügen. 10 Mikroliter jeder RNA-Probe auf ein vorlaufendes, 20%Polyacrylamid, 7,5 Molharnstoffgel laden.
Führen Sie das Gel mit 25 Milliampere für zwei Stunden. Nach zwei Stunden die Elektrophorese anhalten und das Gel aus dem Gerät entfernen. Brechen Sie die Dichtung zwischen den beiden Glasplatten und entfernen Sie vorsichtig eine der Glasplatten mit dem Gel auf beiden Platten verbleiben.
Legen Sie eine Schicht Plastikfolie über das Gel und setzen Sie auf einem Phosphor-Bildschirm für drei Stunden. Dieses Protokoll erkennt zuverlässig die Isopentenylierung sowohl kanonischer als auch nichtkanonischer tRNA-Rückstände, die durch die S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5 modifiziert wurden. In diesem Beispiel wurde Tyrosin tRNA intern mit 32P-Adenosin beschriftet und Mod5 wurde mit RNase in Gegenwart oder Abwesenheit von DMAPP inkubiert.
Die RNAs wurden mit RNase T1 verdaut und auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgelöst. Mod5 modifiziert den vorhergesagten Rückstand in Gegenwart von DMAPP und wird durch das verschobene 10 Nukleotid angezeigt, dreifaches Adenosin, das Fragment an Nukleosidpositionen 36 bis 38 enthält, das Fragment in der Tyrosin-tRNA enthält. Das modifizierte Adenosin 37 befindet sich mit einem Sternchen angegeben.
In ähnlicher Weise, wenn die serine tRNA mit Mod5 und DMAPP inkubiert wird, wird eine vollständige Verschiebung der 10 Nukleotid-Dreifachadenosin beobachtet, die Fragment an Nukleosidposition 36 bis 38 enthält. Interessanterweise wird eine partielle Verschiebung eines sieben Nukleotidfragments beobachtet, das das dreifache Adenosin enthält, das Fragment an Nukleosidpositionen 36 bis 38 enthält, was darauf hindeutet, dass das dreifache Adenosin, das Fragment an Nukleosidposition 36 bis 38 Sequenz und Struktur enthält, für Mod5 in vitro aktivität möglicherweise nicht erforderlich ist. Einmal gemeistert wird diese Technik dauert zwei, vier bis sechs Stunden Tage, wenn es richtig durchgeführt wird.
Nun, wenn man dieses Verfahren versucht, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Integrität der RNA zu erhalten und zu überwachen, da der RNA-Abbau die RNA-Modifikation beeinträchtigen und die Dateninterpretation verwirren könnte. Nach diesem Verfahren könnten Mutationsstudien mit Ihrem Enzym von Interesse durchgeführt werden, um spezifische Rückstände oder Domänen zu bestimmen, die für die enzymatische Aktivität erforderlich sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, um zu sagen, tRNA-isopentenyl transferase Aktivitäten von prokaryotischen und eukaryotischen Enzymen.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Protokoll zum Nachweis der Isopentenyltransferase-Aktivität Ihres Enzyms von Interesse durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer richtigen PSA, die Verwendung einer angemessenen Abschirmung und die ordnungsgemäße Entsorgung von Radioaktivität sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
