Der Hochdurchsatz-Screening-Calciumfluoreszenz-Dual-Additions-Assay ermöglicht die Identifizierung neuartiger niedermolekularer Liganden eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der durch die intrazelluläre Calciumkaskade signalisiert. Der Hauptvorteil des Dual-Additions-Assays ist der Nachweis von Agonist und Antagonist HTS in einem einzigen Assay mit den gleichen Zellen, vorausgesetzt, das Fluoreszenzsignal dauert zwei Minuten. Diese Methode kann auf jeden GPCR angewendet werden, der durch die Calciumkaskade signalisiert, zu der der größte Teil der Arthropoden-Neuronen-Peptidfamilie, eines GPCRs, gehört.
Für die Reproduzierbarkeit des Assays ist es wichtig, die Zelldichte, die Injektionsgeschwindigkeit und die Konzentration des bekannten Agonisten für die zweite Auflage zu optimieren. Das Verfahren wird von Bianca Henriques-Santos, Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Der Calciumfluoreszenztest wird eingeleitet, indem das verbrauchte Medium aus dem T-75-Kolben entnommen wird, der drei Zellen mit 70 bis 90 % konfluentem BMLK enthält.
Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%igem Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure oder EDTA ablösen und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie acht Milliliter selektives Medium hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Milliliter.
Vor dem Zentrifugieren der Zellsuspension bei 1000 x g für drei Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter F-12K-Medium, das 1% fötales Rinderserum oder FBS und 400 Mikrogramm pro Milliliter G418-Sulfat enthält. Um die Zelldichte der Suspension für eine weitere Verdünnung zu bestimmen, mischen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in 20 Mikroliter 0,4% Trypanblau und laden Sie dann 20 Mikroliter Gemisch in eine Zellzählkammer, um von einem Zellzähler auf Zelldichte abgelesen zu werden.
Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem gleichen F-12K-Medium und füllen Sie das Endvolumen auf 15 Milliliter bei einer Dichte von viermal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter auf. Zur Aussaat der Zellen in der Poly-D-Lysin- oder PDL-kodierten 384-Well-Platte. Geben Sie 25 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension mit einem Liquid-Handling-System in 384 Vertiefungen der Platte.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid im befeuchteten Inkubator. Am nächsten Tag drehen Sie die 90%ige konfluente 384-Well-Platte schnell um. Um das verbrauchte Medium zu entfernen und zwei- bis dreimal vorsichtig auf sterile Papiertücher zu tupfen, um die gesamte Flüssigkeit von der Platte zu entfernen.
Führen Sie die nächsten Schritte im weichen Dämmerlicht im Inneren der Biosicherheitswerkbank durch. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter des Beladungsfarbstoffs in jede Vertiefung mit einem Liquid-Handling-System hinzu, indem Sie 12,5 Mikroliter in jede Vertiefung mit einer Aspirations- und Dosiergeschwindigkeit von 3,8 Mikrolitern pro Sekunde dosieren. Wiederholen Sie diesen Pipettierschritt, um ein Endvolumen von 25 Mikrolitern in jeder Vertiefung zu erreichen.
Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Umgebungslicht zu schützen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-befeuchteten Inkubator für 30 Minuten. Nach dem Äquilibrieren der abgedeckten Platte für weitere 30 Minuten sind die Zellen bereit für das Hochdurchsatz-Screening oder HTS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Arzneimittelplatte bei 1200 x g in einer Plattenzentrifuge für eine Minute.
Die 10-fache Agonisten-Peptidlösung von Rhimi-K-1 wird in ein autofreundliches 150-Milliliter-Reservoir überführt. Klicken Sie im Plattenleser auf Protokolle verwalten. Wählen Sie dann im Endpunkt-Fluoreszenzintensitätsprotokoll die Option Flow Forte pre-read aus, klicken Sie auf Messung starten, um das Hintergrundsignal für den gesamten HTS-Assay zu messen.
Setzen Sie die Zellplatte in das Plattenlesegerät ein. Klicken Sie in der Instrumententafel auf eine zufällige Vertiefung auf der Platte und dann auf neue Fokushöhe. Klicken Sie auf Fokusanpassung.
Klicken Sie auf Verstärkungseinstellung. Weisen Sie ihm 5 % bis 10 % des maximal messbaren Fluoreszenzwerts zu. Klicken Sie auf Anpassung starten.
Klicken Sie auf Messung starten, um die gesamte Platte für das Hintergrundfluoreszenzsignal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) zu lesen. Klicken Sie während des Lesens der Platte auf den aktuellen Status, um den Messwert in Echtzeit anzuzeigen. Für den Dual-Addition-Assay pipettieren Sie 10 Mikroliter der Arzneimittellösung dreimal mit dem Liquid-Handling-System auf und ab und saugen 1,5 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Arzneimittelplatte mit einer Aspirationsgeschwindigkeit von 1,0 Mikrolitern pro Sekunde ab.
0,5 Mikroliter der Verbindungen werden in den Zellassay gegeben, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren in 0,2%igem Dimethylsulfoxid oder DMSO zu erreichen. Nach Zugabe der Screening-Verbindungen wird die Assay-Platte sofort in den Plattenleser eingesetzt. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung.
Entsorgen Sie einen Mikroliter Arzneimittellösung, der in den Deponien verbleibt, indem Sie die Deponien in ein 150-Milliliter-Abfallreservoir mit etwa 50 Millilitern DPBS eintauchen. Inkubieren Sie die Screening-Verbindungen mit den Zellen für insgesamt fünf Minuten, einschließlich der Zeit im Plattenleser in der Biosicherheitswerkbank bei ausgeschaltetem Licht. Als nächstes werden drei Mikroliter des Agonistenpeptids Rhimi-K-1 aus dem Reservoir in die Testplatte gegeben, wobei das Liquid-Handling-System mit 384 12,5-Mikroliter-Spitzen verwendet wird.
Legen Sie die Platte sofort in den Plattenleser. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung. Berechnen Sie den Z'-Faktor für die Qualitätskontrolle jedes Plattenassays manuell.
Wählen Sie die Treffermoleküle manuell aus den Heatmaps auf der Online-HTS-Datenplattform aus und berechnen Sie die normalisierte prozentuale Aktivierung oder NPA und inhibitorische Aktivität oder I0 für die Agonistentreffer und Antagonistentreffer. Zur Demonstration dieses HTS-Assays wurde eine hauseigene Wirkstoffplatte SAC2-34-6170 verwendet, die aus 320 zufälligen kleinen Molekülen besteht. Das HTS hatte eine ausgezeichnete Assay-Qualität mit einem Z'-Faktor von 0,7, was widerspiegelt, dass die Assay-Qualität unabhängig von den getesteten Verbindungen ist.
Es ist wichtig, die Platte sofort nach der Zugabe des Agonisten zu lesen, da das Fluoreszenzsignal nur von kurzer Dauer ist. Nach diesem Verfahren sollte das identifizierte Treffermolekül durch Dosis-Wirkungs-Assays validiert und in Zellen getestet werden, die den Ziel-GPCR nicht exprimieren, um Off-Target-Treffer auszuschließen.
