Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung und Anwendung einer neuen pH-empfindlichen fluoreszierenden Lipidsonde, die spezifisch für Zellmembranen ist und es Forschern ermöglicht, Exo und Endozytose in lebenden Zellen zu überwachen. Die meisten früheren Reporter über Membranprotein basierend auf pH-empfindlichem grünem Fluoreszenzprotein, das indirekt ist. Als Lipidmimetikum integriert sich ND6 in die Zellmembran und berichtet so getreu über den Lipidmembrantransport.
Die ND6-Sonde wird nur fluoreszierend, wenn sie in eine biologische Membranumgebung eingebettet ist. Die Fluoreszenzintensität dieser Sonde korreliert mit der Protonierung und Deprotonierung der Piperazinkopfgruppe. Daher fluoresziert es bei niedrigerem pH-Wert viel stärker.
Exozytose und Endozytose sind ubiquitäre Prozesse, die der Sekretion und Aufnahme vieler Signalmoleküle zugrunde liegen. Daher kann ND6 verwendet werden, um einige grundlegende Fragen der Zellbiologie und der biomedizinischen Wissenschaften zu untersuchen. Haley, Oliver und Jonathan, Studenten aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Bildgebungskammer, die eine Temperaturregelung und einen Lösungseingang für die Fluoreszenzbildgebung lebender Zellen ermöglicht. Richten Sie ein programmierbares Gerät ein, um die Perfusionslösungen umzuschalten und den elektrischen Stimulus zu definierten Zeitpunkten während der Bildgebung abzugeben. Wiegen Sie eine angemessene Menge ND6 ab.
Lösen Sie es in Dimethylsulfoxid auf und lassen Sie es bei Raumtemperatur auflösen. Dann beschallen Sie die Lösung kurz. Filtern Sie die Rohöllösung mit einem 0,22-Mikrometer-Filter, um große Farbstoffaggregate zu entfernen.
Bestimmen Sie mit einem herkömmlichen oder Mikrovolumen-Spektralphotometer die Farbstoffkonzentration bei 405 Nanometern. Vor der Anwendung die Stammlösung mit der Badlösung auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen. Bewahren Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.
Geben Sie ND6-Stammlösung in der Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter in das Kulturmedium und inkubieren Sie es, um endozytierte Membrankompartimente, wie z. B. Endosomen, ubiquitär zu markieren. Um das Ausmaß der Markierung synaptischer Vesikel zu reduzieren, unterdrücken Sie die spontane neuronale Aktivität pharmakologisch. Nach selektiver Markierung synaptischer Vesikel, wie im Manuskript beschrieben, montieren Sie das Deckglas mit den Zellen in der Bildgebungskammer.
Schließen Sie den Temperatursensor, den Perfusionseingang und die Vakuumspitze an die Bildgebungskammer an. Stellen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf etwa 0,2 Milliliter pro Sekunde ein und beginnen Sie mit der Perfusion der vorgewärmten normalen Tyrodelösung, die NBQX und DAP5 enthält, um überschüssiges ND6 in der Kultur zu entfernen. Passen Sie den Fokus an und suchen Sie das entsprechende Sichtfeld mit gesunden und gut verteilten Neuronen, die verbundene Neuriten tragen.
Vermeiden Sie Bereiche, die ungelöste Dikolloide enthalten. Versuchen Sie, ND6-geladene Zellen mit unterschiedlichen Belichtungszeiten zu fotografieren, um die besten Bildgebungseinstellungen zu ermitteln. Richten Sie das Stimulations- und Perfusionsprotokoll, das Rahmenintervall und die Gesamtdauer anhand der Informationen im Textmanuskript ein.
Starten Sie die Bildaufnahme, begleitet von synchronisierter Stimulation und Perfusion. Überwachen Sie die Stimulation und den Lösungsaustausch während der Bildgebung. Stoppen Sie die Perfusion, nachdem die Bildgebung beendet ist.
Entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie die Bildgebungskammer für den nächsten Versuch. Sichern Sie alle Bilddateien und erstellen Sie eine elektronische Kopie. Wählen und öffnen Sie das Analyseprogramm für die Datenextraktion.
Öffnen oder importieren Sie einen Bildstapel in das Analyseprogramm. Verwenden Sie nach dem Generieren einer binären Maske die Funktion "Partikel analysieren" mit entsprechender Flächengröße und Zirkularität, um Bereiche von Interesse oder ROIs anzufordern, die Zellmembranen, Endosomen, Lysosomen oder synaptischen Boutons entsprechen. Wählen Sie vier Hintergrund-ROIs in zellenfreien Bereichen innerhalb des Sichtfelds aus.
Speichern Sie dann alle ausgewählten ROIs. Richten Sie alle Frames innerhalb der ND6-Zeitraffer-Bildstapel aus. Legen Sie das erste Bild als Referenz fest, und richten Sie den Rest mit einer starren Registrierung daran aus, wodurch Artefakte aufgrund von XY-Drift verringert werden.
Speichern Sie dann die ausgerichteten Bildstapel. Wenden Sie die gespeicherten ROIs auf ausgerichtete ND6-Bildstapel an. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität der ND6-Fluoreszenz für jeden ROI in jedem Frame des Bildstapels.
Exportieren Sie dann die Ergebnisse zur statistischen Analyse. Berechnen Sie die mittlere Intensität der Hintergrund-ROIs, um das Basisrauschen zu erhalten, das von allen ausgewählten ROIs subtrahiert wird. Mittelung der drei höchsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung der Tyrodlösung von pH 5,5, um die maximale Fluoreszenzintensität zu erhalten, die für die Normalisierung als 100 % definiert ist.
Mittelwerten Sie die drei niedrigsten durchschnittlichen Intensitäten für jeden ausgewählten ROI während der Anwendung von 50 Millimol Ammoniumchlorid, um die minimale Fluoreszenzintensität festzulegen, die für die Normalisierung als 0 % definiert ist. Berechnen Sie die relativen Fluoreszenzänderungen für jeden ROI basierend auf seinen eigenen 0%- und 100%Intensitäten. Leiten Sie mittlere Fluoreszenzänderungen, Änderungskinetiken und andere Werte oder Diagramme aus einzelnen ROI-Daten ab.
Hellgrün fluoreszierende Punkte entlang der neuronalen Fortsätze waren sichtbar, nachdem die neuronalen Zellen mit ND6 beladen wurden. Eine starke Korrelation zwischen den Fluoreszenzintensitäten von ND6 und FM464 deutete ebenfalls auf eine synaptische Vesikelfärbung durch ND6 hin. Es wurde eine Abnahme der ND6-Fluoreszenz als Reaktion auf elektrische Stimulation und Stimulation mit hohem Kaliumgehalt beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich ND6 in der synaptischen Vesikelmembran befindet und dass das synaptische Vesikellumen während der Freisetzung neutralisiert wird.
Unter einer umfassenden elektrischen Stimulation reduzierte die M-beta-CD-Behandlung die durch ND-Bildgebung gemessene synaptische Vesikelfreisetzung und -entnahme signifikant, was darauf hindeutet, dass Membrancholesterin die Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel erleichtert. Baf A1 verhinderte die Erholung der ND6-Fluoreszenz nach der Stimulation, indem es die Wiederansäuerung der gewonnenen synaptischen Vesikel akut blockierte. Grundlegendes Verständnis der Fluoreszenzmikroskopie ist ein Muss.
Eine sorgfältige Planung physiologischer Bedingungen zur Unterstützung der Lebendzellbildgebung ist sehr wichtig. Es ist entscheidend, die Konzentration der ND-Stammlösung genau zu bestimmen. Wenn möglich, messen Sie die Stammlösungskonzentration vor jedem Gebrauch erneut.
Bitte halten Sie es von direkter Sonneneinstrahlung fern, um ein Ausbleichen von Fotos und eine Zersetzung der Sonde zu vermeiden.
