Diese Methode kann bei der Untersuchung von Membranproteinen wie Transportern und Kanälen helfen. Die Informationen über den Substratumsatzbeimgang beim Vergleich der Proteinaktivität und Spezifität und der unterschiedlichen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie potenzielle Verschiebungsschwankungen und chloridfreie Pufferbedingungen minimiert.
Und erhöht die Präzision der Umsatzpreisbestimmung durch genauere Membranpotenzialmessungen deutlich. Sammeln Sie die Elemente für die ersten Schritte. Dazu gehören zwei mikrokapillare Pipettenspitzen, eine scharfe Klinge und ein Schiebesattel.
Für die Elektrode haben Silberdraht, Sandpapier und eine drei Molkaliumchlorid-Lösung zur Hand. Darüber hinaus haben Ethanol und Wasser für die Reinigung und eine GLEICHstrom-Stromversorgung. Arbeiten Sie mit den beiden Mikropipettenspitzen.
Beginnen Sie mit der Spitze, die den Puffer enthält. Platzieren Sie die zweite Spitze neben der ersten. Bewegen Sie die zweite Spitze, so dass, wenn es eingefügt wird, sein schmaler Teil mindestens fünf Millimeter in den schmalen Teil des ersten teilt.
Markieren Sie die Position, an der der erste Puffer mit der Spitze angefügt wird. Verwenden Sie dann den Bremssattel, um die Länge der Mikro-Agar-Salzbrückenelektrode zu messen. Verwenden Sie die Klinge, um die Spitze auf die entsprechende Länge zu schneiden.
Reinigen Sie die Schnittfläche mit Ethanol, gefolgt von Wasser. Als nächstes erhalten Sie eine Länge von etwa acht Zentimeter Silberdraht für die Elektrode. Reinigen Sie den Draht auf Tüchern mit Ethanol gefolgt von Wasser.
Nach der Reinigung verwenden Sie Sandpapier, um die Oberfläche auf einer Länge von einem Zentimeter an einem Ende zu glätten. Dieser Draht mit seinem geglätteten Ende ist bereit, elektrochemisch beschichtet zu werden. Setzen Sie das geglättete Ende in die Kaliumchloridlösung, wobei das andere Ende mit einem Gleichstromnetzteil für die Beschichtung verbunden ist.
Wenn Sie beschichtet sind, trennen Sie die Elektrode und reinigen Sie sie mit Wasser. Nach dem Trocknen bestimmen Sie die Länge, die es ermöglicht, die Mikrokapillarspitze so tief wie möglich zu durchdringen. Schneiden Sie die Elektrode von der unbeschichteten Seite auf die entsprechende Länge.
Nun, um eine Salzlösung mit Agarose vorzubereiten. In einem Wasserkolben Kaliumchlorid auflösen und mit einem Magnetrührer beim Mischen unterstützen. Nach dem Entfernen des Rührers Agarose in den Kolben geben.
Nehmen Sie den Kolben in eine Mikrowelle und erhitzen Sie ihn, um die Agarose bei etwa 100 Grad Celsius zu schmelzen. Nehmen Sie es heraus, um visuell zu überprüfen, ob die Agarose vollständig aufgelöst ist. Sobald die Agarose pipette 10 Mikroliter langsam in die Mikrokapillare gelöst wird, um Luftblasen zu vermeiden.
Es ist wichtig, die Agarsalzlösung sorgfältig in die Mikrokapillarspitze zu pipetten, insbesondere bei hohen Agarkonzentrationen. Wenn nicht richtig gemacht Luftblasen sind leicht in der Spitze und Block elektrischen Fluss produziert. Nach dem Entfernen der Spitze aus der Pipette drücken Sie die Elektrode hinein.
Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in die Salzlösung eindringt. Wenn sich die Elektrode bei Raumtemperatur befindet, stecken Sie sie in eine Referenzelektrode in einen Verstärker. Stützen Sie die Referenzelektrode, so dass sie in einen Kunststoffbehälter mit einem Milliliter Puffer abgesenkt werden kann.
Als nächstes tauchen Sie die Salzbrückenelektrode in die Lösung ein. Wenden Sie eine Spannung an, und überprüfen Sie, ob eine Stromantwort vor dem Fortfahren erfolgt. Wenn der Test erfolgreich ist, trennen Sie die Elektroden.
Bei Bedarf die Salzbrückenelektrode aufbewahren, indem Sie sie in eine dreimolare Kaliumchloridlösung tauchen. Als Nächstes bereiten Sie den Puffer mit Kunststoffspitze vor. Nehmen Sie eine Mikrokapillarspitze und identifizieren Sie einen Punkt zwei Zentimeter vom schmalen Teil entfernt.
Verwenden Sie einen Heizdraht, um das Rohr um 90 Grad an dieser Position zu biegen. Mit einem scharfen Messer schneiden Sie das Rohr fünf Millimeter vom Gebogenen. Reinigen Sie den Bereich, der mit Ethanol geschnitten wurde, gefolgt von Wasser.
Bevor Sie fortfahren, verwenden Sie ein Lichtmikroskop mit einer Skala, um den Durchmesser des Lochs an der Spitze zu messen. Als nächstes bewegen Sie die Pipette in der Nähe eines Behälters mit Lösungsmittel und einem anderen Puffer. Drei Mikroliter des Lösungsmittels in die und aus der Spitze pipette.
Als nächstes füllen Sie die Messspitze mit drei Mikroliter Puffer. Holen Sie nun die Salzbrücke aus der Kaliumchloridlösung. Stecken Sie die Messspitze mit dem Puffer an die Salzbrückenelektrode.
Schließen Sie die Salzbrückenelektrode und die Referenzelektrode an einen Verstärker an. An dieser Stelle die Salzbrückenelektrode in der Pufferlösung mit der Referenzelektrode aufhängen. Eine Darstellung der Konfiguration für das Experiment ist in diesem Schaltplan.
Während des Experiments bildet sich die Membran am Ende des Puffers, der eine Pipette enthält. Sammeln Sie Daten, um die Membrankapazität zu finden. Dazu wird ein dreieckiges Wechselspannungssignal verwendet, um eine rechteckige Wechselstromantwort zu erzeugen.
Als Nächstes finden Sie die Leitfähigkeit und Spannung bei Nullstrom. Automatisieren Sie die Anwendung einer Spannungsrampe im Bereich von minus 50 bis 50 Millivolt und erfassen Sie den Strom. Passen Sie eine lineare Funktion an die Daten an.
Die Steigung ist die Leitfähigkeit, der x-Intercept ist die Spannung bei Nullstrom. Entfernen Sie nach Getaner die Messspitze von der Salzbrücke. Füllen Sie eine neue Messspitze mit Puffer, passen Sie sie an einen anderen pH-Wert an, um einen Protonengradienten über die Membran einzurichten.
Stellen Sie den Versuchsaufbau mit einer neuen Messspitze und Elektroden wieder her, um die Messungen zu wiederholen. Hier sind repräsentative Stromspannungsaufzeichnungen in Gegenwart eines pH-Gradienten. Und in Ermangelung eines pH-Gradienten.
Die Linien stellen eine lineare Anpassung an die Daten dar. Die Verschiebung des x-Achsen-Schnittpunkts für die verschiedenen pH-Werte wird durch die Nernst-Gleichung vorhergesagt. Diese Daten stellen die Verschiebung des Membranpotentials rechtzeitig für eine Standard-Silberchloridelektrode in Weiß und die Mikro-Agar-Salzbrückenelektrode in Schwarz dar.
Die Agar-Salzbrückenelektrode war stabiler mit einer maximalen Verschiebung von weniger als fünf Millivolt über 300 Sekunden Messung. In dieser Darstellung der Potentialverschiebung als Funktion des pH-Gradienten verhalten sich die beiden Elektroden bei zunehmendem pH-Verlauf deutlich unterschiedlich. Die Protonenumschlagsrate kann für die beiden Elektrodentypen gefunden und verglichen werden.
Hier sind Protonenumsatzzahlen, die für das mitochondriale Entkopplungsprotein ein UCP1 ermittelt werden, das von der Salzbrückenelektrode im Vergleich zu einer Standardelektrode gemessen wird. Es gibt auch Daten für ähnlich vorbereitetes UCP3. Die Raten erscheinen mit der Agar-Salzbrückenelektrode präziser.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Elektrode in die Agarsalzlösung eindringt. Die Salzbrücke muss auch in die Pufferlösung eintauchen. Stellen Sie schließlich sicher, dass die Agarsalzlösung keine Luftblasen enthält.
