Die Autoren bedanken sich bei der Università degli Studi di Milano für die Unterstützung von Eliana Di Cairano (Post-Doktorandenstipendium) und Stefania Moretti (Promotionsstipendium) bestätigen. Diese Arbeit wurde von der University Research Program PUR zu CP unterstützt Wir möchten Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Großbritannien, danke ich für das pHluorin bauen und Dr. Francesco Dotti für die Unterstützung bei der Datenanalyse und Silvia Marsicano für die technische Unterstützung.

1. Zellkultur und Transfektion <ol><li> SH-SY5Y-Zellkultur HINWEIS: Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der humanen Neuroblastom-SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-Zellen zu wachsen als eine Mischung von Floating-Cluster und adhärenten Zellen. Folgen Sie den Anweisungen im Protokoll (Zelldichte, Teilungsverhältnis, etc.) Berichtet, dass Zellen, die fest mit Glasabdeckung, die entscheidend für TIRFM ist angebracht wachsen. <ol><li> Vor dem Start unter laminaren Strömungs Biosicherheit, Kosmetik die gelegene Volumen sterilen Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) und Kulturmedium. <ol><li> Make 50 ml PBS mit Konzentrationen von 150 mM NaCl, 24 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. Faltenfilter filtrieren. </li><li> Make 50 ml Zellmedium von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), L-Glutamin ( 2 mM) undNatriumpyruvat (1 mM). Faltenfilter filtrieren. </li></ol></li><li> Komplett ausbauen Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS. </li><li> Inkubieren Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (6 cm Petrischale) für 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und nehmen Zellen mittels Pipette. </li><li> Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM und sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, 1 ml DMEM zum Pellet pipettieren und die Lösung auf und ab, um genügend Zellen in eine Einzelzellsuspension zu zerstreuen. </li><li> Splitten 1: 4 in einem neuen 6 cm Durchmesser Petrischale mit 3 ml Komplettmedium. Aufrechterhaltung von Zellen in Kultur in 6 cm Durchmesser Petrischalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Subkultur einmal pro Woche oder wenn sie 80 abgedeckt - 90% der Fläche. </li></ol></li><li> SH-SY5Y Zellen Beschichtung für die Bildgebung <ol><li> Für TIRFM Experimenten PlatteZellen auf Glasabdeckungen. Beschäftigen Glasabdeckungen mit 0,17 ± 0,005 mm Dicke und einer 1,5255 ± 0,00015 Brechungsindex. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Deckgläser wie folgt: <ol><li> Saubere Glasabdeckungen mit 90% Ethanol, O / N. </li><li> Gründlich sie in destilliertem Wasser (drei Änderungen destilliertes Wasser). Chemische Glasabdeckungen in einem Trockenschrank. </li><li> Platz erstreckt sich in Petrischalen aus Glas und sterilisieren im vorgeheizten Backofen bei 200 ° C für 3 Stunden. </li></ol></li><li> Der Tag vor der Transfektion, legen jedes Deckglas in einem 3,5 cm Petrischale, 1 ml Kulturmedium und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Trypsinieren Zellen wie in den Schritten 1.1.3 beschrieben - 1.1.5 Aussetzung des Zellpellets in 1 ml Vollmedium und zu zählen. Berechnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension in zu jeder Petrischale hinzufügen, um 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung. Optimale Bedingungen für Zellwachstum und effiziente Transfektion wird diese Dichte erforderlich. Bei 37 ° Cin einer 5% CO 2 -Inkubator O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection von Polyethylenimin (PEI) ANMERKUNG: Um synaptischen Vesikeln Dynamik visualisieren pCB6-Vektor, der synapto-pHluorin verwendet. Die synapto-pHluorin durch Fusion im Leseraster mit einem pH-empfindlichen Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 16 und der Vesikelmembran Synaptobrevin 2. Das Konstrukt wurde ausgiebig verwendet, um synaptische Vesikel Eigenschaften innerhalb Neuronen 9 untersuchen erzeugt. <ol><li> Vor dem Beginn der Transfektion machen 10 ml der folgenden Lösungen. Bewahren Sie die Lösungen maximale als 1 Monat. <ol><li> Machen Sie eine 150 mM NaCl-Lösung. Einstellen auf pH 5,5 mit 0,01 N HCl. </li><li> Machen Sie eine PEI-Lösung bei 10% Polyethylenimin (PEI, 25 kDa linear) in 150 mM NaCl-Lösung. Der pH der Lösung steigt auf 8,8. Einstellen des pH auf 7,8 mit 0,01 N HCl. </li></ol></li><li> 24 h nach der Beschichtung, entfernen Sie das Medium und erfrischen mit 1,5 mlVollmedium. Halten der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Unter laminaren Strömungs Biosicherheit Schrank in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, werden 3 ug Plasmid-DNA zu 25 &amp; mgr; l von 150 mM NaCl-Lösung und 100 ul der PEI-Lösung pro 3,5 cm-Petrischale. </li><li> Vortex für 10 sec, dann Inkubieren der DNA / PEI-Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Die DNA / PEI Mischung Vorsichtig in die Petrischale mit Deckgläser mit den Zellen und schütteln, um das Reagenz gleichmäßig verteilt in der Petrischale. </li><li> Nach 4 Stunden ändern das Medium und Inkubation der Zellen O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Führen Imaging Experimente 24-48 h nach der Transfektion. </li></ol></li></ol> 2. Cell Imaging von Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) <ol><li> Imaging-Setup <ol><li> Führen TIRF Bilderzeugung mit der in Figur 1 beschriebenen Aufbau. Es umfasst eine motorisierte invertiertenMikroskop (Figur 1, Einschub A), die Laserquelle (Figur 1, Einschub B) und der TIRF-Schieber (Figur 1, Einschub C). Erreichen Sie TIRFM Beleuchtung durch eine hohe numerische Apertur (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) 100X Öl, Immersionsobjektiv. </li><li> Für TIRFM Beleuchtung, verwenden ein mit mehreren Leitungen (458/488/514 nm) 100 mW Argonionenlaser. Verwendung eines Monomode-Faser, führen das linear polarisierte Laserlicht in den Strahlengang, über den TIRF-Schieber. Legen Sie die TIRF-Schieber in die Leuchtfeldblendenebene des reflektierten Lichtstrahlengang. <ol><li> Für Weitfeldbeleuchtung, schließen Sie das Mikroskop mit einer herkömmlichen Quecksilber-Kurzbogenlampe HBO weißes Licht. Eine polarisationserhaltende Doppelprisma in dem Schieber sichert die gleichzeitige Kombination TIRF Beleuchtung und weißem Licht. </li></ol></li><li> Filtern Sie das Laserlicht mit einem Anregungsfilter (Bandbreite 488/10 nm) auf einer Filterscheibe, in den Laserpfad eingeführt montiert. Beschäftigeneine hohe Geschwindigkeit, softwaregesteuerte, Auslöser, um eine schnelle Regelung der Laserbeleuchtung ermöglichen. Für pHluorin Analyse, montieren ein Bandpass 525/50 nm Emissionsfilter. Digitalbilder (512 x 512 Bildpunkte) auf einer gekühlten Schnelle CCD-Kamera mit der Bild ProPlus Software. </li></ol></li><li> Das Erreichen TIRF-Beleuchtung (Bild 2) <ol><li> Schalten Sie den Laser, der Computer, die Kamera, das Filterrad und die Shutter-Controller; Dann warten Sie 20 Minuten vor dem Start des Experiments als die Laser benötigen, um sich aufzuwärmen und zu stabilisieren. </li><li> Vor Bildgebung, machen die günstigen Volumen der folgenden Lösungen. <ol><li> Make 50 ml Krebs (KRH) Lösung bei 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) (gepuffert pH 7,4), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose. </li><li> Make 10 ml KCl-KRH-Lösung (pH 7,4) bei 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (pH 7,4 gepuffert), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose. </li></ol></li><li> Glasabdeckung mit transfizierten Zellen und setzen Sie sie in das entsprechende Imaging-Kammer. Setzen Sie die Kammer und fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung in der Mitte des Glases. </li><li> Öl hinzufügen über das Ziel. Legen Sie die Imaging-Kammer auf der Bühne des Mikroskops und positionieren Sie das Ziel unter dem Deckglas. Positionieren Sie die Schutzabdeckung über der Probe. </li><li> Im Epifluoreszenz-Modus, den Schwerpunkt auf das Deckglas (obere Oberfläche), und wählen Sie transfizierten Zellen in der Kammer Zentrums. Markieren Sie die Zellen, deren Fluoreszenzsignal eindeutig mit einer Belichtungszeit von unter 80 ms aufgezeichnet. </li><li> Unter Software-Steuerung, um TIRF-Beleuchtung schaltet in den Live-Modus. </li><li> Um die TIRF-Konfiguration eingestellt, überprüfen Sie die Position des Strahls, der aus dem Objektiv austritt, auf der Probenabdeckung (2B). Wenn der Strahl in der Mitte des T positionierter Objektivlinse (2A, links), ist ein Ort in der Mitte des TIRF Probenabdeckung sichtbar (2B, links) und die Zelle in Epifluoreszenz-Modus abgebildet (mehrere Fokusebenen, hohe Hintergrundfluoreszenz, 2C, links) . </li><li> Um den Grenzwinkel zu erreichen, bewegen Sie den fokussierten Punkt in Y-Richtung (vorwärts oder rückwärts; 2B, Mitte) mit dem Winkel Einstellschraube am TIRF-Schieber (Abbildung 1C). Wenn der Strahl konvergiert auf der Probenebene in einem Winkel größer als dem kritischen Winkel (2A, rechts), der Punkt verschwindet, und eine gerade, dünne, konzentriert Linie zeigt sich in der Mitte der Probenabdeckung (2B, rechts). </li><li> Zur Feinabstimmung der TIRF Winkels verwenden Sie den Zellprobe (2C). Beobachten der Fluoreszenzbild auf dem Video, in diesem Stadium, ist ein Epifluoreszenz ähnliches Bild immer noch sichtbar. Sanft, bewegen Sie die Schraube bis TIRF conBedingung erzielt: nur eine optische Ebene der Zelle im Fokus ist (dh der Plasmamembran in Kontakt mit dem Deckglas), führt dies zu einem flachen Bild mit hohem Kontrast (2C, rechts). </li></ol></li><li> Probenabbildung <ol><li> Stellen Sie den Single-Channel-Zeitraffer-Experiment. Zur Minimierung Bleichen, erfassen Sie das Bild mit niedrigen Belichtungszeit und hoher Verstärkung. Entsprechende Belichtungszeiten zwischen 40 bis 80 ms. Erwerben Sie Bilder mit einem 1 - 2 Hz Abtastfrequenz. Vesikel Kinetik besser gewürdigt Abtastung mit höherer Frequenz (10 Hz) sein. Die regelmäßige Zeit der Beobachtung ist in der Regel 2 min. </li><li> Fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung und Rekordzellen in TIRFM Modus. Dies ist der Ruhezustand. Speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der gleichen Zelle und Rekord unter den gleichen Bedingungen von ruhenden (Laserleistung, Belichtungszeit, Rahmennummer). Nach fünf Bilder, fügen Sie 500 ul von KCl-KRH-Lösung und halten KCl in der Kammer.Dies ist der stimulierte Zustand; speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse und Datenverarbeitung ANMERKUNG: Um Bilder zu analysieren, haben Makros im Labor entwickelt wurde, die auf bestehenden Funktionen der Bildanalyse-Software; ähnliche Makros sind online verfügbar (URL in der Tabelle der Materialien und Geräte zur Verfügung gestellt). <ol><li> Die Fluoreszenzintensität quantifiziert <ol><li> Verwenden Sie ein &quot;Sequence Fluoreszenzintensität&quot; Makro für Fluoreszenzintensität Quantifizierung in einer Region of Interest (ROI) des Bildes, im Laufe des Films. </li><li> Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern. Zum Makro-Menü und wählen Sie &quot;Sequence Fluoreszenzintensität. Im Fenster &quot;Analyse&quot; wird &quot;wählen Sie den ROI&quot;. </li><li> Wählen Sie eine der Auswahlwerkzeuge im Menü, um die ROI erstellen. Platzieren 3 ROIs in Bereichen der Zellmembran ohne Flecken (Hintergrund ROI). Beschäftigen this &quot;Hintergrund ROI&quot;, um das Bleichen zu bewerten und die Schwelle für die Fusion Ereignisanalyse (3A) eingestellt. </li></ol></li><li> Photobleichen Korrektur und Schwellenwertbestimmung (3B) <ol><li> Um das Ausbleichen zu bewerten, öffnen Sie die Fluoreszenzintensität Reihen &quot;Hintergrund ROIs&quot; (Abbildung 3Ba). Normalisieren der Fluoreszenzintensitätswerte in jedem Rahmen in die Ausgangsintensitätswert (F0) (F / F0) (Abbildung 3Bb). Der Mittelwert der Werte. </li><li> Markieren Sie die Durchschnittswerte und erstellen Sie ein Liniendiagramm mit den Diagrammmenüoptionen. </li><li> Aus der Datenanalyse-Menü wählen Sie &quot;Trendlinie&quot;, um den Plot-Analyse Dialog zu öffnen. Wählen Sie die Art der Regression. Stellen Sie &quot;exponentiellen&quot; Regression. Wählen Sie dann &quot;Display Gleichung auf Diagramm&quot;. Im Grafik-Fenster, erscheint das Exponentialgleichung und die Parameterwerte werden automatisch zugewiesen, (Abbildung 3Bc </strong&gt;). </li><li> Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen wie folgt: Fn (korrigiert) = Fn / exp (n * a) Fn = experimentellen Fluoreszenzintensität gemessen am Rahmen n; n = Anzahl der Rahmen; a = Bleichfaktor (Konstante der Rate der Intensitätsverlust durch Photobleaching zum Ausdruck bringen; &#160; Abbildung 3Bd). </li><li> Um den Grenzwert einzustellen, öffnen Sie eine normierte und korrigiert &quot;Hintergrund ROI&quot;, Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzsignal und dessen Standardabweichung (SD). Der Mittelwert plus 3 SD stellt die Schwelle (Abbildung 3BE). Verwenden Sie diese Schwelle für die Datenanalyse. </li></ol></li><li> Auswahl der Fusionsereignisse mit einem halbautomatischen Verfahren <ol><li> Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern mit Bildanalyse-Software. Tragen Sie eine Gauß-Filter auf den aktiven Bildsequenz. </li><li> Analysieren Sie Bilder mit der &quot;Zählen von Objekten&quot; oder ein Makro, das die Auswahl erlaubteines Objekts, dessen Bildpunkte haben mittlere Fluoreszenz-Intensität in einem definierten Bereich. Stellen Sie die Intensität Bereich manuell mit Hilfe der Schwellenwertfunktion (gehen Sie auf die Bar-Menü, zu setzen Maßnahme → Schwelle den Bereich von Interesse hervorheben). Eine angemessene Schwelle von 30% gegenüber dem lokalen fluoreszierenden Hintergrundsignal. </li><li> Anwenden eines Makros &quot;Filter-Objekte&quot;, um nur die Objekte, die die folgenden Kriterien aus: <ol><li> Bewerben Bereiche Option (min und max einschließlich) für Aspekt. Aspekt berichtet das Verhältnis zwischen der Hauptachse und der Nebenachse der Ellipse entspricht dem Objekt. Aspect ist immer ≥1. Angemessene Werte min = 1, max = 3. </li><li> Bewerben Bereiche für Durchmesser. Durchmesser zeigt die durchschnittliche Länge der Durchmesser gemessen bei zwei Grad-Intervallen Verbinden von zwei Konturpunkte und durch den Schwerpunkt des Gegenstandes. Stellen Sie den Bereich in Pixel (oder um, wenn mit einem kalibrierten System). </li><li> Definieren Sie die optimale Reichweite in preliminary Experimente: Wählen Sie manuell die Punkte von Interesse und messen ihrem Durchmesser mit dem Grundstück Profilfunktion. </li></ol></li><li> Wählen Sie &quot;Anzeigeobjekte&quot;: ausgewählte Objekte werden dem TIRFM Bild (4B) überlagert erscheinen. </li><li> Umfassen in der Analyse nur die Punkte, die eine kurze (1-3 Frames) zeigen transiente Erhöhung der Fluoreszenzintensität, unmittelbar gefolgt von einem deutlichen Verlust des Signals (transient spots) gefolgt. Beschäftigen die Kreisauswahl um eine ROI etwa ein Punktdurchmesser radial um die ausgewählten Vesikel / Spots (experimentell ROIs) erstellen. Führen Sie diesen Schritt manuell. </li><li> Mit den ausgewählten ROIs, die Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität jeder ROI innerhalb des Films. </li></ol></li><li> Datenanalyse (3C-D) <ol><li> Exportieren Sie den Zeitverlauf der Fluoreszenzänderungen in jedem &quot;experimentellen ROI&quot; in eine Tabellenkalkulation gemessen; (Abbildung 3DA). Normalisieren der Intensitätswert in jedem Rahmen in die Ausgangsfluoreszenzintensität (F / F0), (Abbildung 3dB). </li><li> Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen, wie in Schritt 3.2.4 (Fig 3Dc) berichtet. </li><li> Um die Gesamtzahl der Fusionsereignisse (Peak-Zahl), die Zeit jedes Fusion auftritt (Peakbreite) und die Amplitude der Fluoreszenz-Peak (Spitzenhöhe und AUC) berechnet gelten logische Funktionen mit Tabellenkalkulation oder Mathematik-Pakete. Ein Beispiel für eine Fusion Ereignisanalyse mit logischen Formeln ist in Abbildung 3Dd und 3De wiesen. </li><li> Angenommen, die Zunahme der Fluoreszenzintensität der den Schwellenwert (durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität ± 3SD) als Vesikelfusion an die Plasmamembran und die resultierende Spitzen als Fusionsereignis. </li><li> Berechnen der Peakbreite als Differenz zwischen dem letzten und dem ersten X-Wert jedes Peaks. Multiplizieren Sie diesen Wert für 1 / (Sampling-Frequenz). Betrachten Sie diesen Wert einist die Zeit der Fusion von Vesikeln und Haftung an der Plasmamembran vor Vesikel Wieder Versauerung und Recycling (Abbildung 3Dd). </li><li> Berechnen der Gesamtzell-AUC als eine Summe von Werten über dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Nettofluoreszenzänderung während der Aufnahmezeit aufgrund der spontanen (Urlaub) oder hervorgerufen (stimuliert) synaptische Aktivität. </li><li> Berechnen der Peakhöhe als die Differenz zwischen der maximalen y-Wert jeder Spitze und dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Hinweis auf die Fusionstyp (Einzel vs. gleichzeitige / fortlauf Fusion oder transiente vs. Vollfusion). </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für Bild und analysieren Vesikel Dynamik in sezernierenden Zellen, unter Verwendung von fluoreszierenden cDNA-kodierten Vektoren und TIRFM. Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Bildgebung durch TIRFM sind die Auswahl des Zellmodell und Zelltransfektion mit genetisch codierte optische Anzeigen von Vesikel-Freisetzung und Recycling. TIRFM ist ideal für wachsende Zellen haft auf eine Glasabdeckung und ausreichend eben, um eine stabile Darstellung von M...

Chemische synaptische Übertragung zwischen Neuronen ist ein Hauptmechanismus der Kommunikation im Nervensystem. Es beruht auf der Freisetzung von Neurotransmittern durch einen dynamischen Zyklus Vesikelfusion Auslagern in der präsynaptischen Seite. Viele der Proteine ​​in Vesikel Dynamik beteiligt identifiziert worden sind; jedoch ihre spezifischen Beitrag zum Phänomen bleibt zu klären 1. Unser Verständnis teilweise durch die Tatsache, dass die am häufigsten verwendeten Assays zur exo / Endozytose nicht immer am besten geeignet beschränkt. Mehrere Studien zu Vesikelfusion bezogenen und Dynamik setzen auf elektrophysiologischen Techniken. Diese Technik sorgt für eine optimale zeitliche Auflösung und ist ausgezeichnet für die Untersuchung der anfänglichen Fusion von Bläschen an der Plasmamembran aber nicht erkennen viele der molekularen Mechanismen, die präsynaptischen Funktion unterstützen. Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite stellt die feinste morphological Beschreibung jeder einzelnen Schritt, aber der dynamische Aspekt der Veranstaltung können nicht erfasst werden, weil Proben müssen, um fest zu analysieren werden. Das Aufkommen von neuen optischen Aufzeichnungstechniken 2,3, in Kombination mit den Fortschritten in Fluoreszenzmolekularsonden Entwicklung 4-6, ermöglicht die Visualisierung der Exozytose Prozessen in lebenden Zellen, wodurch ein neues Maß an Informationen über die synaptische Struktur und Funktion. Erste Studien genutzt aktivitätsabhängigen Styrylfarbstoffe (FM1-43 und verwandte organische Farbstoffe) 7,8. State-of-the-Art-bildgebenden Verfahren eingesetzt werden pH-sensitive Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) zu Lumen Vesikel Proteine ​​9 angebunden. Diese Sonden werden in der Regel aus, wenn in den Vesikeln aufgrund der geringen luminale pH vorliegenden geschaltet. Nach der Fusion mit der Plasmamembran, die Vesikelinnenraum zur neutralen Extrazellularraum der pH Einstrahlung<html> abrupt, entlastet den Protonenabhängige Abschrecken pHluorin und das Fluoreszenzsignal schnell angezeigt. Da die Änderung in pHluorin schneller ist als die Fusionsereignis, durch Messen der Fluoreszenz zunimmt, kann Vesikelfusion mit der Membran gemessen und analysiert werden. Da Oberflächen pHluorin-markierte Moleküle Endozytose werden, danach kehrt das Fluoreszenzsignal auf Basisniveau, also das gleiche Konstrukt kann auch Vesikel Recycling 9 Überwachung verwendet werden. Während die Vesikel-markierten pH-Sensor sorgt für die Visualisierung nur dieser Vesikel, die wirklich verschmelzen mit der Plasmamembran wird Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung benötigt, um im Detail zu beschreiben die Schritte in den exo / endozytischen Prozesse. Die optische Technik, die die notwendigen räumlichen und zeitlichen Auflösung bietet, ist Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), eine Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie 10. &quot;&gt; Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckglas und der Probe. Wenn der Lichtpfad des Glasdeckglas mit einem Einfallswinkel größer als der kritische Winkel erreicht auftritt, wird das Erregungslicht nicht in die Probe übertragen, aber ist vollständig zurückreflektiert wird. Unter diesen Bedingungen wird ein evaneszentes Licht-Wellenformen an der Grenzfläche und breitet sich in dem Medium mit geringer optischer Dichte (der Probe). Da die Intensität des abklingenden Feldes nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Schnittstelle (mit einer Eindringtiefe von etwa 100 nm) nur die Fluorophore in unmittelbarer Nähe vom Deckglas angeregt werden, während diejenigen, die weiter vom Rand entfernt liegen nicht. In Zellen, die mit GFP-Konstrukten transfiziert, entspricht diese Tiefe, um Proteine ​​auf der Plasmamembran exprimiert oder vesikuläre Strukturen nähert sie. Als Fluorophore im Zellinneren nicht erregt werden, wird die Hintergrundfluoreszenz minimiert, und ein Bild mit einem sehr hohen Signal / Hintergrund-Ratteio 11 gebildet. Mehrere Eigenschaften machen TIRFM die Technik der Wahl für die Überwachung von Vesikeln Dynamik. Die perfekten Kontrast und die hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht die Detektion von sehr niedrigen Signalen, die aus einzelnen Vesikeln. Chipbasierte Bildaufnahme in jedem Frame bietet die zeitliche Auflösung erforderlich sind, um hochdynamische Prozesse zu erkennen. Schließlich ist die minimale Exposition von Zellen gegen Licht an jedem anderen Flugzeug in der Probe reduziert stark Phototoxizität und ermöglicht langlebige Zeitrafferaufnahme 12. Datenanalyse bleibt die größte Herausforderung und entscheidender Aspekt dieser Technik. Der einfachste Weg, Vesikelfusion überwachen ist die Ansammlung von fluoreszenten Reporter-Proteine ​​auf der Zelloberfläche zu messen, über die Zeit 13. Als Fusions erhöht, Nettofluoreszenzsignal steigt auch. Allerdings kann diese Methode den Prozess zu unterschätzen, insbesondere in großen Zellen und in Ruhebedingungen,weil Endozytose und Bleichen Prozesse versetzt den Anstieg in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Bläschen Exocytose. Ein alternatives Verfahren besteht darin, jede einzelne Fusionsereignis 14 zu folgen. Dieses letztere Verfahren ist sehr empfindlich und kann wichtige Informationen über den Fusionsmechanismen offenbaren. Es erfordert jedoch die manuelle Auswahl der einzelnen Ereignisse, weil vollständig automatisierte Verfahren, um Vesikel zu verfolgen und die Fluktuation der Fluoreszenzsignale zu registrieren sind nicht immer verfügbar. Die Beobachtung der Vesikel Dynamik erfordert Sampling-Zellen mit einer hohen Frequenz. Dies erzeugt eine große Menge von Daten, die kaum manuell analysiert werden kann. Der Vorschlag der vorliegenden Arbeit ist es, die TIRFM bildgebendes Verfahren zur Überwachung der basale und stimulierte Freisetzung von Neurotransmittern in der SH-5YSY Neuroblastom-Zelllinie zu optimieren und zu beschreiben, Schritt-für-Schritt wird eine im Labor entwickelt Verfahren, um Daten zu analysieren, sowohl bei Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1414">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Equipment</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:371px;"></td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">491912-9850-000</td>
			<td>inverted microscope 
			<a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Multiline Argon Laser Lasos 77</td>
			<td style="width:199px;">Lasos</td>
			<td style="width:119px;">00000-1312-752</td>
			<td>multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser 
			<a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser">http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser</a></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:259px;">Laser TIRF slider</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">423681-9901-000</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html">http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">100x Objective</td>
			<td style="width:199px;">Zeiss</td>
			<td>421190-9900-000</td>
			<td>Oil, NA 1.45 Alpha-Plan 
			<a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;p=us&amp;f=o&amp;a=v&amp;m=a&amp;id=421190-9900-000&amp;ss=1">https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&#38;p=us&#38;f=o&#38;a=v&#38;m=a&#38;id=421 
			190-9900-000&#38;ss=1</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">CCD Camera RetigaSRV Fast 1394&#160;</td>
			<td style="width:199px;">QImaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf">http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html">http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Software</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image ProPlus 6.3 Software</td>
			<td style="width:199px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination 
			<a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP">http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Excel</td>
			<td style="width:199px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses 
			<a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/">http://office.microsoft.com/it-it/excel/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 4.00&#160;</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>statistical analysis 
			<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tirfm and ph-sensitive gfp-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in sh-sy5y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis

Synaptischen Vesikeln frei Neurotransmitter an chemischen Synapsen durch einen dynamischen Zyklus der Fusion und den Abruf. Überwachung synaptische Aktivität in Echtzeit und sezieren die verschiedenen Schritte von exo-Endozytose auf Einzel Vesikel Ebene sind entscheidend für das Verständnis der synaptischen Funktionen in Gesundheit und Krankheit. Genetisch kodierte pH-sensitive Sonden direkt an synaptischen Vesikeln und Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) gezielte bieten die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich sind, um Vesikel Dynamik zu folgen. Das abklingende Feld durch interne Totalreflexion erzeugt wird, kann nur Fluorophore in einer dünnen Schicht (&lt;150 nm) über der Glasdeckel an dem Zellen anhaften platziert erregen, genau dort, wo die Verfahren der exo-Endozytose erfolgt. Die entstandenen Bilder mit hohem Kontrast sind ideal geeignet für Vesikel Tracking und quantitative Analyse von Fusions Veranstaltungen. In diesem Protokoll, SH-SY5Y menschlichen neuroblastoma Zellen werden als ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung an der Single-Vesikel Ebene durch TIRFM aufgrund ihrer flachen Oberfläche und der Gegenwart verteilt Vesikel vorgeschlagen. Die Verfahren zum Züchten von SH-SY5Y als adhärente Zellen und zur Transfektion von ihnen synapto-pHluorin vorgesehen sind, sowie als ein Verfahren, TIRFM und Bildgebung auszuführen. Schließlich wurde eine Strategie mit dem Ziel, zu wählen, zu zählen und zu analysieren Fusion Ereignissen an Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen dargestellt. Um das Bildgebungsverfahren und Datenanalyse-Ansatz zu validieren, die Dynamik des pHluorin-markierten Vesikel unter Ruhe analysiert und stimuliert (depolarisierenden Kaliumkonzentrationen) Bedingungen. Membrandepolarisation erhöht die Frequenz der Fusionsereignisse und verursacht eine parallele Erhöhung des Nettofluoreszenzsignals im ganzen Zelle aufgezeichnet. Single-Vesikel Analyse zeigt Modifikationen Fusionsereignis Verhalten (erhöhte Spitzenhöhe und Breite). Diese Daten legen nahe thbei Kalium-Depolarisation nicht nur induziert eine massive Freisetzung von Neurotransmittern, sondern auch verändert den Mechanismus der Fusion von Vesikeln und Recycling. Mit dem geeigneten fluoreszierenden Sonde kann diese Technik in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt werden, um die Mechanismen der konstitutiven und stimulierte Sekretion sezieren.

Die beschriebenen TIRF Bildgebung und Datenanalyse-Verfahren sollen die Vesikel Dynamik in zellulären Systemen zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Signalmolekülen und Medikamente auf Fusionsereignisse und Neurotransmitter-Vesikel Dynamik 17 zu bestimmen. Mit GFP-markierten Plasmamembranproteinen hat die TIRFM Analyse eingesetzt worden, um die konstitutive Handel mit GFP-markierten Glutamattransporter in Gliazellen und Epithelzellen 18,19 charakterisieren. </...

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TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Aufrufe.  Università degli Studi di Milano. This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.

Serie: TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Dorsal Root Ganglien Isolation und Primärkultur Neurotransmitter-Freisetzung zu studieren

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized cells use this process to execute vital body functions such as insulin secretion from &#946; cells and neurotransmitter release from chemical synapses. Owing to its physiological significance, exo-/endocytosis has been one of the most studied topics in cell biology. Many tools have been developed to study this process at the gene and protein level, because of which much is known about the protein machinery participating in this process. However, very few methods have been developed to measure membrane lipid turnover, which is the physical basis of exo-/endocytosis.
This paper introduces a class of new fluorescent lipid analogs exhibiting pH-dependent fluorescence and demonstrates their use to trace lipid recycling between the plasma membrane and the secretory vesicles. Aided by simple pH manipulations, those analogs also allow the quantification of lipid distribution across the surface and the intracellular membrane compartments, as well as the measurement of lipid turnover rate during exo-/endocytosis. These novel lipid reporters will be of great interest to various biological research fields such as cell biology and neuroscience.

This protocol presents a fluorescence imaging method that uses a class of pH-sensitive lipid fluorophores to monitor lipid membrane trafficking during cell exocytosis and the endocytosis cycle.

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes depend on the advances of growth cones that located at the tips of neurites. Axonal growth cones generate driving forces by sensing their local microenvironment and modulating cytoskeletal dynamics and actin-adhesion coupling (clutch coupling). Decades of research have led to the identification of guidance molecules, their receptors, and downstream signaling cascades for regulating neuronal migration and axonal guidance; however, the molecular machineries required for generating forces to drive growth cone advance and navigation are just beginning to be elucidated. At the leading edge of neuronal growth cones, actin filaments undergo retrograde flow, which is powered by actin polymerization and actomyosin contraction. A clutch coupling between F-actin retrograde flow and adhesive substrate generates traction forces for growth cone advance. The present study describes a detailed protocol for monitoring F-actin retrograde flow by single speckle imaging. Importantly, when combined with an F-actin marker Lifeact, this technique can quantify 1) the F-actin polymerization rate and 2) the clutch coupling efficiency between F-actin retrograde flow and the adhesive substrate. Both are critical variables for generating forces for growth cone advance and navigation. In addition, the present study describes a detailed protocol of traction force microscopy, which can quantify 3) traction force generated by growth cones. Thus, by coupling the analyses of&#160;single speckle imaging and traction force microscopy, investigators can monitor the molecular mechanics underlying growth cone advance and navigation.

To advance, growth cones must exert traction forces against the external environment. The generation of traction forces is dependent on actin dynamics and clutch coupling. The present study describes methods for analyzing actin dynamics, clutch coupling and traction forces for growth cone advance.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...