Die Methode zur entomopathogenen Pilzisolierung ist wichtig für die Entwicklung mikrobieller Bekämpfungsmittel. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um hochvirulenzreiche entomopathogene Pilzisolate aus den Bodenproben zu isolieren und auszuwählen. Diese Technik umfasst drei Zinken des Pathogenitätsscreenings und kombiniert den Thermotoleranz- und Konidienproduktionstest, um die effektive Konidienzahlrangfolge zu erstellen.
Die Methode kann helfen, hohe Virulenz und vielversprechende entomopathogene neue Pilzisolate für die Kommerzialisierung auszuwählen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die biologische Kontrolle, es könnte auch verwendet werden, um die entomopathogenen Pilzisolate zu entdecken, um die Wechselwirkung zwischen Schädlingen und entomopathogenen Pilzen zu untersuchen. Das Verfahren wird von Yao-Chia Liu und Nian-Tong Ni, Masterstudentin aus meinem Labor, demonstriert.
Beginnen Sie mit der Entnahme der Bodenprobe, indem Sie einen Zentimeter des Oberflächenbodens entfernen und dann den Boden in der Tiefe von fünf bis 10 Zentimetern von jeder Probenahmestelle mit einer Schaufel sammeln. Nachdem Sie die Details jeder Probenahmestelle aufgezeichnet haben, sammeln und lagern Sie 100 Gramm Bodenprobe in einer Plastiktüte bei Raumtemperatur, um das Pilzisolierungsprotokoll innerhalb von drei Stunden durchzuführen. Um die potenziellen entomopathogenen Pilze oder EPF zu isolieren, fügen Sie 100 Gramm der Bodenprobe in einen Plastikbecher hinzu und legen Sie fünf Tenebrio molitor-Würmer bei Raumtemperatur im Dunkeln für zwei Wochen auf die Oberfläche des Bodens, wobei die Larvensterblichkeit und Mykose täglich beobachtet und aufgezeichnet werden.
Halten Sie die tote Larve bis zwei Wochen in der Tasse für die Pilzisolierung. Nach zwei Wochen die toten Insekten auf eine saubere Bank bringen und mit einem sterilen Zahnstocher die Konidien sammeln. Um die Primärkultur von Pilzen zu erhalten, streifen Sie die gesammelten Konidien auf einem viertelstarken Sabouraud-Dextrose-Agarmedium oder SDA in einer 55-Millimeter-Platte, um sieben Tage lang bei 25 Grad Celsius zu inkubieren.
Am achten Tag werden alle Primärkulturpilze auf einer 55-Millimeter-SDA-Platte mit Viertelstärke in einer Laminar-Flow-Haube erneut rekubiert, bevor Sie die Kultur sieben Tage lang bei 25 Grad Celsius inkubieren, um einzelne Pilzkolonien zu erhalten. Beim ersten Pathogenitätsscreening legen Sie fünf Tenebrio molitor-Larven bei 25 Grad Celsius direkt auf die Oberfläche jeder reinen Pilzkulturplatte. Nachdem Sie die Mykose und Mortalität 10 Tage lang beobachtet und aufgezeichnet haben, wählen Sie die Pilzisolate für die weitere Analyse aus.
Um den zweiten Virulenztest durchzuführen, ernten Sie die Konidien jedes Pilzisolats durch Wirbeln für eine Minute und zählen Sie die Anzahl der Konidien mit einem Hämozytometer. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie die Konidiensuspension auf eine Konzentration von ein mal 10 bis zu den 1/7 Konidien pro Milliliter in einer 0,03% igen Tensidlösung ein, bevor Sie 10 Mikroliter Pilzsuspension auf eine 55-Millimeter-SDA-Platte mit Viertelstärke verteilen, um sieben Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln zu wachsen. Legen Sie am achten Tag fünf Tenebrio molitor-Larven direkt auf die Oberfläche jeder reinen Pilzkulturplatte und versiegeln Sie die Platten mit Parafilmfilm, um sie zu inkubieren, während Sie die Mykose und Mortalität wie zuvor beschrieben beobachten.
Nachdem Sie den zweiten Virulenztest in dreifacher Ausfertigung für jedes Pilzisolat wiederholt haben, wählen Sie die Isolate aus, um einen dritten Virulenztest für den Zielschädling wie Spodoptera litura durchzuführen. Sammeln Sie etwa einen Quadratmillimeter EPF von der siebentägigen SDA-Platte in Viertelstärke, um die genomische Pilz-DNA mit einem Pilz-Genom-DNA-Extraktionskit zu extrahieren. Als nächstes amplifizieren Sie den pilzinternen transkribierten Spacer oder die ITS-Region durch PCR der DNA-Probe nach dem im Textmanuskript beschriebenen PCR-Programm.
Nachdem Sie das PCR-amplifizierte Produkt durch einen kommerziellen Sequenzierungsdienst sequenziert haben, verwenden Sie den NCBI BLAST, um in der NCBI-Datenbank nach ähnlichen Pilzen zu suchen und die relative Pilzart für die phylogenetische Analyse auszuwählen. Richten Sie die verschiedenen Sequenzen aus und trimmen Sie den konservierten Sequenzbereich manuell mit GeneDoc. Führen Sie die phylogenetische Analyse basierend auf den Methoden der minimalen Evolution, der Nachbarverbindung und der maximalen Wahrscheinlichkeit durch.
Um die Morphologie der Pilze zu untersuchen, erfassen Sie das Wachstum der Pilzkulturkolonie sieben Tage lang mit einer Kamera und zeichnen Sie das Wachstum, die Form: flauschig oder fest und die Farbe der Kolonien auf. Um die Konidien in Konidiophoren zu beobachten, kratzen Sie Konidien aus der Reinkultur-Pilzkolonie mit einer Impfschleife und übertragen Sie die Sporen auf einen Glasobjektträger mit 0,1% Tween 80-Lösung. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Agarblock der Pilzkolonie zu schneiden, und übertragen Sie dann den Agarblock auf einen Glasträger und fügen Sie die 0,1% Tween 80-Lösung hinzu, um die meisten überschüssigen Konidien auf Agar abzuwaschen.
Als nächstes bedecken Sie den Objektträger mit einem Abdeckzettel für die lichtmikroskopische Beobachtung der Konidien. Messen und notieren Sie die Breite und Länge der Konidien und Konidiophoren, um den Unterschied zwischen verschiedenen Pilzisolaten zu vergleichen. Ordnen Sie einen konidialen Produktionstest an, indem Sie das ausgewählte Pilzisolat auf viertelfestem SDA-Medium bei etwa 25 Grad Celsius im Dunkeln für 10 Tage kultivieren.
Anschließend wird eine Milliliter-Konidialsuspension des Pilzisolats in 0,03%iger Tensidlösung hergestellt, gefolgt von einer Einstellung der Konzentration auf ein mal 10 bis zu den 1/7 Konidien pro Milliliter wie zuvor beschrieben. Nach Zugabe von drei Tröpfchen von 10 Mikrolitern konidialer Suspension auf einer viertelfesten SDA-Platte die Kultur bei 25 Grad Celsius im Dunkeln für sieben, 10 und 14 Tage inkubieren, um die Sporulation von Pilzen zu zählen. Lösen Sie zu jedem Zeitpunkt einen Fünf-Millimeter-Agarblock mit einem Korkbohrer von der Mitte der Kolonie und übertragen Sie den Block in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter 0,03% Tensidlösung enthält.
Nachdem Sie die Röhre bei 3.000 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur für 15 Minuten gewirbelt haben, verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Konidien zu zählen. Für den Thermotoleranzassay wird das ausgewählte Pilzisolat kultiviert und einmalig 10 zu den 1/7 Konidien pro Milliliter Suspension wie zuvor dargestellt hergestellt. Nach dem Wirbeln die Konidialsuspension in einem trockenen Bad bei 45 Grad Celsius für verschiedene Zeitintervalle erhitzen.
Nach der Hitzeeinwirkung fügen Sie zu jedem Zeitpunkt drei Tröpfchen von fünf Mikrolitern Konidialsuspension auf eine 55-Millimeter-SDA-Platte mit Viertelstärke auf und inkubieren die Platten dann 18 Stunden lang bei etwa 25 Grad Celsius. Um die Keimrate zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der gekeimten Konidiensporen mit fünf zufällig ausgewählten Feldern unter dem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Berechnen Sie die Gesamtzahl der effektiven Konidien oder ECN unter Verwendung der Formel und berechnen Sie dann die Hauptkomponentenanalyse oder PCA von Pilzstämmen, wie im Manuskript beschrieben.
Wählen Sie die leistungsstärksten Pilzstämme basierend auf ECN oder PCA aus, um den Virulenztest von Zielschädlingen durchzuführen. Im zweiten Virulenztest wurde die Virulenz der 26 Pilzisolate gegen Tenebrio molitor Mehlwürmer beurteilt. Für den Virulenztest gegen Spodoptera litura wurden 12 Pilzisolate mit hoher Pathogenität ausgewählt.
Um die taxonomischen Positionen der Pilze besser zu verstehen, wurden 26 Isolate aus dem ersten Pathogenitätsscreening einer molekularen Analyse basierend auf der ITS-Region unterzogen. Durch die Reinigungsmethode der pilzmorphologischen Beobachtungen konnten die Strukturen von Konidiophoren mit 0,1%Tween 80 Lösung deutlich gesehen werden. Die Farbe, Form und Anordnung der Konidien wurden durch mikroskopische Beobachtungen der Konidienkolonie untersucht.
Das ECN kombiniert Konidienproduktions- und Thermotoleranzdaten jedes EPF. Die hohe Lebensfähigkeit eines Pilzstammes wurde beobachtet, wenn der ECN-Wert hoch war. Außerdem wurde eine gute Koordination zwischen dem PCA und dem ECN aufgedeckt, was darauf hindeutet, dass das ECN zur Bewertung der Hierarchie der rentabilitätsbezogenen Parameter verwendet werden könnte.
Das Pathogenitätsscreening, das die Pilz-DNA extrahiert und das Pilzisolat kultiviert, ist wichtig für das Verfahren. Mit Hilfe der ECN-Berechnungsformel können die idealen intern pathogenen Pilze ausgewählt werden. Die Kombination verschiedener Insektenarten, wie z. B. Wachsmotte und Mehlwurm, um die entomopathogenen Pilze aus den Bodenproben zu ködern, könnte die Vielfalt der entomopathogenen Pilze erhöhen.
Die Mikroorganismenvielfalt des Bodens ist ein sehr interessantes Thema während der Anwendung dieses Protokolls. Es könnte auch in Zukunft über dieses Protokoll weiter untersucht werden.
