Dieses Protokoll kann verwendet werden, um verschiedene Bewegungen bei Insekten, Funktionen von Insektenproteinen und Wechselwirkungen zwischen Virus und Vektorinsekt in vivo zu untersuchen. Diese Methode ist effizient und informativ. Die Strukturen des Insektendarms und der Hilfszellen werden bei der Betrachtung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie deutlich sichtbar.
Das Verfahren wird von Dr. Lu Zhang aus unserem Labor demonstriert. Übertragen Sie zunächst nicht-virulifere Insekten aus Bechergläsern auf frisches südliches Reisschwarzstreifen-Zwergvirus (SRBSDV), infizierte Reispflanzen, die mit einem insektensicheren Netz bedeckt sind, für einen zweitägigen Viruserwerbszeitraum. Sammeln Sie dann die Insekten in Glasbechern mit frischen Reissämlingen.
Sammeln Sie die Insekten nach zwei Tagen mit einem manuellen Aspirator aus den Glasbechern zur Dissektion und Exzision des Darms. Bereiten Sie 0,01 molare PBS, 4% Paraformaldehyd und 2% Triton X-100 vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Verwenden Sie einen Pipetter, um 100 Mikroliter PBS auf einen Objektträger zu legen und den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops zu legen.
Verwenden Sie einen manuellen Absauger, um die SRBSDV-infizierten Erwachsenen aus den Glasbechern zu sammeln und sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis zu legen, um die Insekten zu lähmen. Übertragen Sie einen gelähmten Erwachsenen mit dem Bauch nach oben in die 100 Mikroliter PBS auf dem Objektträger. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Körper festzuklemmen, und entfernen Sie den Kopf mit einer anderen Pinzette.
Klemmen Sie mit einer Pinzette die Seiten des Abdomens fest und klemmen Sie den Ovipositor oder das Kopulationsorgan des Schwanzes mit dem anderen Satz fest, dann ziehen Sie vorsichtig an der intersegmentalen Membran eines Bauchsegments, um den Darm langsam im Bauch freizulegen. Reißen Sie die Membran weiter weg und ziehen Sie nach und nach den gesamten Darm aus dem Bauch. Ziehen Sie vorsichtig den Schwanz ab, der mit dem Ende des Darms verbunden ist, um den gesamten Darm zu entfernen.
Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in das Röhrchen und waschen Sie den Darm mit einer Pipette gründlich. Verwenden Sie einen Pipetter, um 100 Mikroliter PBS auf einen Objektträger zu legen und den Objektträger auf den Tisch eines optischen Mikroskops zu legen.
Verwenden Sie einen manuellen Aspirator, um die SRBSDV-infizierten Nymphen aus Glasbechern zu sammeln und sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zu legen, das auf Eis gelegt wird, um die Insekten zu lähmen. Übertragen Sie eine gelähmte Nymphe mit dem Bauch nach oben in die 100 Mikroliter Puffer auf dem Objektträger. Nehmen Sie den Schwanz der Nymphe ab, klemmen Sie dann den Insektenkörper fest, um ihn sanft zu fixieren, und klemmen Sie den Kopf mit dem anderen Paar fest.
Ziehen Sie den Kopf vorsichtig vom Körper weg, während Sie seine Befestigung am Darm beibehalten, so dass sich der Kopf vom Körper löst, der Darm jedoch immer noch am Brustkorb und am Bauch befestigt ist. Während die Pinzette den Körper immer noch festklemmt, verwenden Sie das andere Paar, um den Kopf vorsichtig zu bewegen und den Darm allmählich herauszuziehen. Lösen Sie den Darm vom Kopf, um einen intakten Darm zu erhalten, ohne den Körper zu schädigen.
Legen Sie die herausgeschnittenen Eingeweide in ein Röhrchen. Geben Sie PBS in das Röhrchen und saugen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Pipette ab, um den Darm gründlich zu waschen. Bereiten Sie die Antikörper und das Einlagemedium wie im Textmanuskript beschrieben vor.
Legen Sie die frisch herausgeschnittenen und PBS-gewaschenen WBPH-Eingeweide in 100 Mikroliter 4%paraformaldehyd in ein 200-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie die Paraformaldehydlösung nach zwei Stunden durch 200 Mikroliter PBS. Entfernen Sie nach 10 Minuten das PBS, um Paraformaldehyd zu entfernen, und wiederholen Sie den PBS-Waschschritt zweimal.
Fügen Sie nach zwei PBS-Wäschen 200 Mikroliter des nichtionischen Waschmittels Triton X-100 hinzu, um die Proben bei Raumtemperatur zu permeabilisieren. Entfernen Sie den Triton X-100 nach 30 Minuten und waschen Sie das restliche Waschmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Verdünnen Sie die markierten Antikörper eins bis 50 mit 50 Mikrolitern Bullenserumalbumin.
Geben Sie die verdünnten Antikörper in das Röhrchen und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie am Morgen nach dem Entfernen des Antikörpers das verbleibende Antikörperverdünnungsmittel mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Verdünnen Sie einen Mikroliter DyLight 633-Phalloidin mit 50 Mikrolitern PBS und geben Sie 50 Mikroliter verdünntes Phalloidin für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur in das Röhrchen.
Waschen Sie das verbleibende Phalloidin nach dem Entfernen von Phalloidin gründlich mit drei 10-minütigen Wäschen mit PBS ab. Geben Sie einen Tropfen des DAPI-haltigen Trägers auf einen Objektträger. Übertragen Sie die Eingeweide auf das Medium und legen Sie das Deckglas vorsichtig über die Probe, ohne Blasen zu bilden.
Die repräsentative konfokale Laserscanning-Aufnahme von herausgeschnittenen WBPH-Eingeweiden von Erwachsenen nach Markierung mit Phalloidin zeigte drei Abschnitte: Vorderdarm, Mitteldarm und Hinterdarm. Unter diesen ist der Mitteldarm die erste Infektionsstelle von SRBSDV. Die einschichtige Epithelzellstruktur des Darms erleichtert die Untersuchung der zellulären Lokalisierung von Insektenproteinen und der Kolokalisierung von Virus- und Insektenproteinen.
Hier sind herausgeschnittene WBPH-Eingeweide mit DyLight 488-markierten Anti-VAMP-7- und SRBSDV-Virionen mit DyLight 549-markierten Anti-SRBSDV-Antikörpern dargestellt. Es wurde gezeigt, dass VAMP-7- und SRBSDV-Virionen im Zytoplasma kolokalisiert sind, was darauf hindeutet, dass VAMP-7 eine Rolle bei der Virusübertragung in vivo spielen könnte. Permeabilisierte Eingeweide sollten nach der Inkubation mit Luciferin-konjugierten Antikörpern gründlich gereinigt werden, um den Hintergrund und die unspezifische Bindung zu reduzieren.
Dies ist eine zuverlässige Methode, um die Lokalisierung von Viren, anderen Krankheitserregern und Insektenproteinen in Insekten zu untersuchen. Es bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen der Beziehung zwischen Krankheitserregern und Insekten.
