Diese Methode liefert neue Informationen darüber, wie infektiöse Konidien entomopathogener Pilze in Massenproduktion hergestellt werden können, um wichtige Insektenschädlinge in kommerziellen Agrarökosystemen zu bekämpfen, angesichts der aktuellen Situation, in der die meisten Insektizide aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer toxischen Wirkung auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit auslaufen. Die Technik beschreibt das Verfahren, mit dem die optimale Ausbeute von EPF-Konidien während der Massenproduktion sichergestellt wird. Die Methode ist hilfreich für die integrierte Schädlingsbekämpfung und biologische Bekämpfung, indem sie Einblicke in die Wirksamkeit von massenproduzierten Konidien für das großflächige Management von schädlichen Insektizidresistenz-Insektenschädlingen in den Agrarökosystemen bietet.
Dieses Verfahren wurde von Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe und Professor Antoinette Paula Malan entwickelt und demonstriert. Erhitzen Sie einen Liter destilliertes Wasser und schalten Sie die Hitze aus, bevor Sie den Siedepunkt erreichen. Fügen Sie nun 30 Gramm Glukose, vier Gramm Kaliumphosphat dibasisch, 20 Gramm Hefeextrakt, 15 Milliliter Maissteillikör hinzu und bringen Sie den Inhalt zwei bis drei Minuten lang sanft zum Kochen.
Gießen Sie insgesamt 100 Milliliter des Mediums in neun verschiedene 250-Milliliter-Kolben. Legen Sie einen Wattestopfen auf jeden Kolben und bedecken Sie die Watte mit Aluminiumfolie als Stopfen. Autoklavieren Sie das Medium in den Kolben für 55 Minuten bei 121 Grad Celsius.
Lassen Sie später das Medium in den Kolben abkühlen und fügen Sie dem Medium in jedem Kolben 10 Milligramm pro Milliliter Streptomycin hinzu. Sammeln Sie zwei bis drei bakterielle Schleifen von Pilzkonidien aus zwei bis drei Wochen alten Pilzkulturplatten für beide EPF-Isolate. Übertragen Sie die Pilzkonidien auf jeweils 100 Milliliter flüssige Medien in den 250-Milliliter-Kolben unter sterilen Bedingungen und verschließen Sie die Kolben.
Inkubieren Sie die flüssigen Kulturkolben bei etwa 25 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 140 U / min für drei Tage und stoppen Sie die Inkubation, sobald die Kulturen Anzeichen einer hohen Trübung mit pilzlichem Blastosporenwachstum zeigen. Um eine mögliche bakterielle Kontamination durch die Kulturen zu erkennen, ziehen Sie nach 24 Stunden Inkubation eine 100-Mikroliter-Probe aus jedem Flüssigkulturkolben und eine Platte auf drei SDA-Platten pro Isolat. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei einer kontrollierten Temperatur von plus oder minus 25 Grad Celsius.
Verwenden Sie ein kleines Polyvinylchlorid-Abfallrohr, um einen Hals für den Gärbeutel am offenen Ende des Autoklavbeutels zu erstellen, und verwenden Sie Autoklavband, um das Rohr zu sichern. Schließen Sie das Rohr mit einem sterilen Wattestopfen, um einen ausreichenden Gasaustausch während der Gärung zu ermöglichen. Verwenden Sie parboiled langkörnigen weißen Reis als festes Substratmedium für die Blastosporen von Metarhizium pinghaense und Metarhizium robertsii.
Für jeden Gärbeutel ein Kilogramm Reis und 300 Milliliter steriles destilliertes Wasser hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig den Inhalt der Gärbeutel. Legen Sie sie in äußere Autoklavenbeutel in aufrechter Position und autoklavieren Sie sie bei 121 Grad Celsius für 55 Minuten.
Lassen Sie die Substrate nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen etwa 45 Minuten abkühlen. Entfernen Sie den Verschluss jedes der flüssigen Kulturkolben von Metarhizium pinghaense und Metarhizium robertsii unter einer laminaren Strömung und flammen Sie den Rand jedes Kolbens für 10 Sekunden an. Gießen Sie 100 Milliliter flüssige Kulturen in die Gärbeutel, indem Sie die Wattestopfen von ihren Hälsen nehmen.
Setzen Sie die Baumwollstöpsel wieder auf und bedecken Sie die Oberseite des Halses der Tasche mit chirurgischem Papier, das mit einem Gummiband gesichert ist. Drehen Sie den oberen Teil des Beutels und mischen Sie den Inhalt des Beutels, indem Sie das Substrat durch Massage schütteln und manipulieren. Inkubieren Sie die Beutel bei etwa 25 Grad Celsius, indem Sie das Substrat in den Beuteln abflachen, um die Bildung dicker Betten zu verhindern.
Zwei bis drei Tage nach der Impfung und Inkubation, wenn sichtbares Myzelwachstum und die Bindung des Substrats durch den Pilz aufgetreten sind, brechen Sie das Substrat in den Gärbeuteln auf, indem Sie den Inhalt der Beutel massieren. Nach der Fermentation die sporulierten Kulturen in 26 bis 30 Kilogramm schwere braune Papiertüten überführen und die Pilzkulturen 10 bis 12 Tage trocknen, bevor sie in Versuchen verwendet werden. Um die Zugfestigkeit der Papiertüten zu verbessern, schneiden Sie horizontal 1/3 des oberen Teils des Beutels ab und kleiden Sie den Boden des Beutels aus.
Zerbröckeln Sie das Substrat vorsichtig in jedem Gärbeutel. Schneiden Sie die Ecke jeder Tasche ab und übertragen Sie langsam die gesamte Kultur auf die Papiertüten durch den Raum, der durch die abgeschnittene Ecke übrig bleibt. Beschriften Sie jede Papiertüte, falten Sie sie zweimal über das obere Ende jeder Tasche und schließen Sie sie mit Klammern, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen.
Legen Sie die Beutel auf Drahttrockengestelle, um eine ordnungsgemäße, gleichmäßige Trocknung bei einer kontrollierten Temperatur von etwa 25 Grad Celsius und einer niedrigen Luftfeuchtigkeit von 30 bis 40% zu ermöglichen. Ernten Sie Pilzkonidien aus den Kulturen mit drei verschachtelten Sieben, die auf einer Auffangwanne montiert sind. Laden Sie die Trockenkulturprobe langsam auf das ETS-Netz Nummer 35 und das Sieb. Legen Sie einen Deckel auf das Sieb, um die Freisetzung von Pilzkonidien in die Luft zu verhindern.
Fügen Sie 10 bis 12 Glasmurmeln zu den Sieben hinzu, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu unterstützen und die Retention der Konidien im Sieb zu vermeiden, was zu einer verminderten Sporenausbeute führen kann. Kleben und versiegeln Sie die Siebverbindungen mit Elektroband. Legen Sie die Siebe auf einen Vibrationsschüttler, der mit einem klebrigen Pad ausgestattet ist, um die Auffangwanne und die Siebe für 20 bis 25 Minuten bei einer Bewegung von 560 bis 640 Vibrationen pro Minute zu sichern.
Entfernen Sie die Analysensiebe aus der Auffangwanne, sammeln Sie Konidien und lagern Sie die gesammelten Konidien in luftdichten und wasserundurchlässigen Reißverschlussbeuteln zur Langzeitlagerung. Durchschnittlich etwa 1,83 Gramm trockene Metarhizium robertsii conidia wurden aus dem Flockgerstensubstrat geerntet, während aus dem Substrat keine Metarhizium pinghaense gewonnen wurde. Für beide Metarhizium-Arten wurden keine trockenen Pilzkonidien aus dem Flockenhafersubstrat geerntet.
Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Arten von Metarhizium wurde in den geschätzten durchschnittlichen Konidien pro Gramm beobachtet, die aus den Reiskörnern geerntet wurden. Metarhizium robertsii hatte eine etwas höhere durchschnittliche Konidienzahl pro Gramm als Metarhizium pinghaense. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Arten von Metarhizium in der geschätzten Anzahl der Konidien auf dem verbrauchten Reissubstrat beobachtet.
Metarhizium pinghaense hatte jedoch etwas höhere Konidien auf dem Reissubstrat als Metarhizium robertsii Bei den beiden Arten von Metarhizium wird kein signifikanter Unterschied in ihrem Gesamtkonidienertrag aus den Reissubstratkulturen geschätzt. Metarhizium pinghaense produzierte jedoch einen etwas höheren Konidienertrag als Metarhizium robertsii, der einen niedrigeren konidiellen Ertrag produzierte. Der herausfordernde Teil dieser Technik ist die Substratkontamination durch Impfung mit einem kontaminierten Blastosporen-Inokulum.
Stellen Sie daher immer die Sterilität während der Arbeit sicher. Diese Demonstration hilft den Schülern, die Technik effizient zu reproduzieren, ohne ungeschickte Fehler, die zur Beendigung des gesamten Prozesses führen können.
