Eine direkte Reprogrammierung zur Erzeugung von Melanozyten wurde berichtet. In verschiedenen Studien werden jedoch verschiedene Transkriptionsfaktoren verwendet. In diesem Protokoll haben wir die Anzahl der Transkriptionsfaktoren validiert und reduziert, immer noch mit höherer Reprogrammierungseffizienz.
Wir haben ein direktes Reprogrammierungssystem eingerichtet, um Melanozyten mit nur drei Transkriptionsfaktoren, Mitf, Sox10 und PAX3, zu erzeugen, und das Kultursystem modifiziert, um es stabiler und robuster zu machen. Wie man funktionelle Melanozyten regeneriert, ist eine wichtige Frage, die helfen kann, Therapieeinschränkungen für Depigmentierungskrankheiten wie Vitiligo anzugehen. Die richtige Neuprogrammierung bietet eine Perspektive Unsere Technik hat die Eigenschaften von Komfort, starker Bedienbarkeit und Stabilität, die leichter zu fördern und zu wiederholen ist.
Um mit der Produktion des konzentrierten Lentivirus zu beginnen, werden die 6 HEK-293T-Zellen 1,5 mal 10 Mal in eine 60-Millimeter-Schale gepresst und die Zellen mit normalem Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultiviert. Nach 24 Stunden der Inkubation, wenn die HEK-293T-Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entfernt haben, ersetzen Sie das Medium durch DMEM, das 2% FBS enthält, und fügen Sie die frisch zubereitete Transfektionskomplexmischung tropfenweise zu den Zellen hinzu.
Mischen Sie die flüssige Mischung vorsichtig. Nach Ablauf von acht Stunden wechseln Sie das Zellmedium mit 3,5 ml normalem Medium. Sammeln Sie den Virusüberstand nach 24 und 48 Stunden.
Als nächstes mischen Sie die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Virusüberstände und zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Führen Sie dann den gesammelten Überstand durch 0,45-Mikron-Filter, um das Filtrat in einem sterilen 50-ml-Konusrohr zu sammeln. Konzentrieren Sie den filtrierten Virusüberstand durch Zentrifugation auf 6.000 xg bei vier Grad Celsius über Nacht.
Stellen Sie nach dem Fertig sicher, dass das Viruspellet am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist. Gießen Sie den Überstand langsam aus. Zum Auflösen des Viruspellets im normalen Medium mit einem mal 100-Volumen*Volumen des Virusüberstandes.
Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um vorsichtig auf und ab zu pipettieren, bis eine homogene 100x konzentrierte Virusmischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus in die Mikrozentrifugenröhrchen, um es bei 80 Grad Celsius zu lagern. Platte 1 mal 10 bis die 5. HEK-293T Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Kultivieren Sie diese Zellen mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden fügen Sie 0,1 bis 0,2 Mikroliter des 100x fluoreszierenden konzentrierten Virus zu jeder Vertiefung hinzu. Gefolgt von der Zugabe von vier Nanogramm pro Mikroliter des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung.
Etwa acht bis zwölf Stunden nach der Infektion mit dem Virus das Medium durch das normale Medium ersetzen. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion waschen Sie das Geschirr mit 1 ml sterilem PBS, um die toten Zellen zu entfernen. Dann trypsinisieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte bei Raumtemperatur.
Zentrieren Sie die Platte bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem ml PBS und fügen Sie die Zellsuspension zu einem fünf ml Polystyrol-Rundbodenrohr hinzu. Legen Sie dann das Rohr in das Durchflusszytometer, um die Probe zu analysieren.
Zur direkten Reprogrammierung von Fibroblasten beschichten Sie eine Vertiefung einer Zellkulturplatte mit sechs Well mit 1 ml 0,1%iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur. Nach 15 bis 30 Minuten, wenn der Brunnen vollständig mit der Gelatine bedeckt ist, aspirieren Sie 0,1% Gelatinelösung. Als nächstes Platte 5 mal 10 bis zur 4. Maus embryonale Fibroblasten oder MEFs, in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, die mit 0,1% Gelatine beschichtet ist, und die Zellen über Nacht mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultivieren.
Nach 24 Stunden, wenn die MEFs eine Konfluenz von 40 bis 50% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch das normale Medium. Als nächstes schmelzen Sie das gefrorene, konzentrierte Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus mithilfe der Gleichung und addieren Sie dann das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren zu jedem Bohrloch entsprechend dem berechneten Volumen.
Fügen Sie vier Mikrogramm pro ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels in die Vertiefung hinzu. Betrachten Sie es als Tag Null der Lentivirus-Infektion. Am ersten Tag, nach 8 bis 12 Stunden Infektion, ersetzen Sie das Medium, das das Virus enthält, durch das frische normale Medium, während Sie 0,5 Mikrogramm pro ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.
Ersetzen Sie am zweiten Tag, 48 Stunden nach der Infektion, das überstehende Medium allmählich durch das Reprogrammierungsmedium. Ändern Sie ein Viertel des gesamten mittleren Volumens, bevor Sie drei mikromolare CHIR99021 hinzufügen. Wechseln Sie vom dritten bis zum siebten Tag je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie es schrittweise durch einen höheren Anteil an Reprogrammiermedium ersetzen, um innerhalb von fünf Tagen auf das komplette Reprogrammiermedium umzusteigen.
Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Verdauungsenzym für drei Minuten bei Raumtemperatur. Wenn etwa sechzig Prozent der Zellen nach oben geschwommen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das normale Medium hinzufügen, das Zweifache des Volumens des Verdauungsenzyms. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-sterilen konischen Röhrchen, um bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium wieder suspendieren. Wenn Sie fertig sind, plattieren Sie die resuspendierten Zellen in einer 60-Millimeter-Sterilschale. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator.
Nach achtundvierzig Stunden Lentivirus-Infektion in HEK-293T-Zellen wurde der Erfolg der konzentrierten Lentivirus-Produktion durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP oder durch Durchflusszytometrie bewertet. Der Titer des konzentrierten Virus war bei 10 bis zur 8. TU / ml hoch. Während der direkten Reprogrammierung der Fibroblasten änderte sich die Zellmorphologie allmählich zu länglichen Zellsynapsen und vergrößerten Zellkernen.
Die Zellen alterten jedoch nach dem zwanzigsten Tag zunehmend. Die Entfernung der Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3 oder Sox10 führte zum Schweigen der Expression der melanozytären Gene Tyr, Tyrp1 und Mlana, was auf den größten Einfluss auf die Umwandlung von Fibroblasten in Melanozyten hinweist. Daher war die Expression von melanozytären Genen, die durch die direkte Programmierung mit drei Transkriptionsfaktoren induziert wurden, im Vergleich zu sechs Transkriptionsfaktoren höher.
Zur Identifizierung von MEF-induzierten Melanozyten oder iMels, der Expression von melanozytären Markern, wurde TYRP1 und DCT mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Melanin-spezifischen Färbemethoden wie DOPA und Masson-Fontana-Färbung positive Ergebnisse. Die 293T-Zellen sollten gleichmäßig verteilt sein.
Auch die Zugabe von Transfektionsmischung zu Zellen muss sanft erfolgen, um zu verhindern, dass die Zellen schweben. Das Protokoll ist stabil und praktisch und kann verwendet werden, um andere Arten von Zellen neu zu programmieren. Es wird erwartet, dass es eine Referenz und eine Strategie für die direkte In-vivo-Reprogrammierung der Melanozytenregeneration in der zukünftigen Medizin liefern wird.
