We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit britischen Innenministeriums Ordnung unter Projektlizenznummer 60/4435 durchgeführt wie in den Animals (Scientific Procedures) festgelegten Gesetz (1986). Embryonen in bestimmten Entwicklungsstufen zu sammeln, wurden zeitlich Paarung bis O / N eingestellt. Uhr am Tag der Suche nach einer vaginalen Pfropfen wurde Embryonaltag (E) 0,5 bezeichnet. 1. Grundlagen zur Zeit E7.5 oder E8.5 Implantation Embryonen für die ex vivo Kultur <ol><li> Opfern die schwangere weibliche Mäuse durch Genickbruch. </li><li> Isolieren Sie die Gebärmutter mit einer Schere, hielt sie mit einer Pinzette und legen Sie in einem 30 mm-Schale mit M2 Medium gefüllt ist. </li><li> Vorsichtig zerreißen das Myometrium mit zwei Paaren von feinen Pinzette. </li><li> Abziehen der Decidua, darauf achten, daß die extra Hohlräumen durchstechen. </li><li> Entfernen Sie die Reichert-Membran durch Quetschen sie mit einer Pinzette und langsam trennt sie vom Embryo. </li><li> Überprüfen Sie die Embryonen unter einem PräpariermikroskopStereomikroskop, um sicherzustellen, dass der Dottersack, Amnion und ectoplacental Konus intakt sind. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere Schüssel M2 mit einer Pipette und auf ein 30 mm Kunststoff-Petrischale Deckel auf Eis (das &quot;Eis-Plattform &#39;) teilweise Chill Embryonen. </li><li> Falls erforderlich, speichern Embryonen in M2 auf einem Eis-Plattform für bis zu 1,5 Stunden, z. B. während der Medienherstellung oder die Manipulation von Kleinserien von ~ 3-4 Embryonen bei RT. Hinweis: Wiederherstellung und Dissektion der Nagetier-Embryonen im Detail zuvor 7,8,16 beschrieben. </li></ol> 2. Bereiten Sie die Embryokulturmedium <ol><li> Frisch tauen entweder im Handel erhältlichen Rattenserum (siehe Glanville-Jones et al. 13 für Daten) oder Rattenserum in-house nach Copp und Cockroft 16, die Wärme wurde für 30 min inaktiviert bei 56 C in 1 ml eingefroren vorbereitet Aliquots bei -80 ˚C Hinweis: Im Handel erhältliches Rattenserum akzeptabel<html> Kulturzeiten von 24-36 h, obwohl Serum in-house hergestellt ist, in unserer Erfahrung, eine überlegene Kultur für Zeiträume von bis zu 48 Stunden. </li><li> Frisch Vorbereitung eines Überschusses (z. B. 10 ml) von definierten Nahrungsergänzungsmittel, die aus Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat. </li><li> Berechnen Sie das Volumen des Kulturmediums, die je nach der Anzahl der Embryonen von jeder Stufe, die gehen zu kultiviert werden, erforderlich ist (siehe Abschnitt 3). Mischen Sie die Rattenserum mit den definierten Ergänzungen machen 50% Kulturmedium (1: 1 (v / v) Rattenserum: definiert Ergänzungsmittel) und / oder 75% Kulturmedium (3: 1 (V / V) Rattenserum: definiert Ergänzungen). </li><li> Übergeben Sie die Embryokulturmedium durch ein 0,45 um-Filter und fügen Sie 10.000 IE / ml Penicillin und 10 ug / ml Streptomycin. Anmerkung: frisch aufgetauten L-Glutamin und Natriumpyruvat Lösung ist entscheidend für die Entwicklung des Embryos während der ex vivo-Kultur. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Ex-vivo-Kulturbedingungen für die verschiedenen Embryonalstadien <ol><li> Für E7.5 Embryonen: statische Kultur unter Verwendung von 4-Well-Platten in einem Inkubator mit 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C für 24 h zugeführt. Kultur bis zu zwei Embryonen pro Vertiefung in 1 ml 50% Kulturmedium. </li><li> Für E8.5 Embryonen: Verwenden Sie ein Rollergeräte 8 Drehen bei 35 U / min Einbeziehung kontinuierlichen Begasung mit 5% CO 2 in Luft bei 37 ° C während 24 Stunden (1 ml 50% Kulturmedium pro Embryo). </li><li> Für E9.5 Embryonen: Verwenden Sie ein Rollergeräte bei 35 Umdrehungen Dreh mit 5% CO 2, 40% O 2 55% N 2 bei 37 ° C zugeführt / min Einbeziehung Gasen für 24 Stunden (1 ml von 75% Kulturmedium pro Embryo). Hinweis: Kultur Embryonen innerhalb von 3 Stunden nach der euthanizing die Mäuse als längere Zeiträume in M2 Entwicklung nachteilig beeinflussen. Siehe Copp und Cockroft 16 für das Verfahren der ex vivo Embryokultur. </li></ol> 4. Grafting kultivierten Zellen in E7.5 oder E8.5 Maus Embryonen <ol><li> Körperlich kratzen EpiSCs, die ubiquitär GFP exprimieren, aus einer 6-Well-Kulturplatte mit einem 20-200 ul Pipettenspitze und legen Sie sie in einem 30 mm-Schale mit den Embryonen Hinweis: Um Zellklumpen in den Embryonen einzusetzen, sollten die Zellen physikalisch statt verschrottet Trypsin behandelt werden. </li><li> Befestigen Sie eine handgezogen Pfropfen Kapillare zu dem Ansaugrohr, eine Mund-Pipette zu machen. </li><li> Saugen Sie vorsichtig den Mund Pipette auf eine oder mehrere Zellklumpen von der Größe&gt; 20 Zellen in den Pfropfen Kapillare zu ziehen. </li><li> Vorsichtig ausblasen die Zellen, um große Klumpen teilweise zu dispergieren. </li><li> Wählen Sie einen Zellklumpen enthält ~ 10-20 Zellen und saugen in die Pfropfen Kapillare wieder, indem sie es in der Nähe der Öffnung der Kapillare. Achten Sie darauf, um die Zellklumpen in die und aus der Kapillare wiederholt zu bewegen, Break-up in kleinere Stücke zu vermeiden. </li><li> Halten Sie den Embryo lose an Ort und Stelle mit einer Pinzette und legen Sie die PfropfenKapillare in dem interessierenden Bereich eine Öffnung zu schaffen. </li><li> Die Klumpen vorsichtig zu vertreiben aus dem Pfropfen Kapillare, so dass die kurze Kette von 10-20 Zellen im Embryo eingereicht. </li><li> Wiederholen Transplantation Verfahren für die gewünschte Anzahl von Embryonen. Verwenden Chargengrößen von 3-4 Embryonen für die Bequemlichkeit. </li><li> Verlassen Embryonen in der gleichen Gericht aus M2-Medium, Bild die veredelten Embryonen mit Hilfe eines Fluoreszenzverbindung Binokular mit Kamera, halten Abbildungszeit auf ein Minimum, um die Exposition der Embryonen zu hohe Licht und Hitze zu vermeiden. Anmerkung: Bestimmen Aufnahmezeiten empirisch, da diese von den technischen Daten der Kamera und Mikroskop sowie der Art und der Fluoreszenzintensität des Fluorophors ab. </li><li> Übertragen des Embryos in einem pastette mit einem minimalen Volumen von M2-Medium auf voräquilibriert Kulturmedium (siehe Abschnitt 3) unmittelbar nach der Bilderzeugung. Hinweis: die Morphologie der Embryonen Sorgfältig prüfen nach der Transplantation. Nur Kultur der INTACt Embryonen. </li></ol> 5. Handmade Elektroporation Materialien und Geräte-Setup (Bereiten Sie die folgenden im Vorfeld der Elektroporation Experimente): <ol><li> Für die DNA-Spritzen Pipetten: Ziehen DNA-Spritzen Pipetten unter Verwendung einer horizontalen Mikropipette Abzieher. Spritzen Pipetten sollten eine feine Spitze haben mit einer Öffnung von weniger als 10 &amp; mgr; m zu Gewebeschäden bei der Injektion von DNA in den embryonalen Hohlräumen zu vermeiden. </li><li> Für Glaskapillare Elektroporation: Verwenden Sie ein Mikroschmiede, um die Öffnung der DNA-Spritzen Pipetten zu einem Innendurchmesser von entweder 20 oder 30 &amp; mgr; m geschnitten. Zellschäden zu vermeiden, wenn die Kapillare in Kontakt mit der Embryo zur Elektroporation, muss die Spitze der Glaskapillare sauber geschnitten und enthält scharfe Bruchkanten werden. </li><li> Für handgemachte Kapillare Elektrode (Anode) (Abbildung 1): Legen Sie eine 0,2 mm Durchmesser Platindraht in eine Elektroporation Glaskapillare mit einer festen Öffnung 20 oder 30 &amp; mgr; m Durchmesser, um die Auserwählten zu konzentrierenric Strom und liefern die Plasmid-DNA in einem kleinen Bereich von Interesse in dem Embryo. </li><li> Für handgemachte L-förmigen Elektrode (Kathode) (Abbildung 1): biegen, eine 0,2 mm Durchmesser Platindraht Schaffung einer &quot;L&quot; -Form, mit dem horizontalen Teil des &quot;L&quot; in der Umgebung von 1 mm in der Länge. </li><li> Befestigen Sie jede Platinelektrode mit einer dünnen isolierten Draht und fügen diesen in einer Mikroinjektionsnadelhalter durch Isolierband abgedeckt. </li><li> Montieren Sie die Nadelhalter auf Standard-Mikromanipulation Instrumentenhalter. </li><li> Der Stromkreis wird, wie in Abbildung 1 dargestellt: eine Verbindung der Kapillare Elektrode an die Anode der Stromversorgung; Verbinden der L-förmigen Elektrode an die Anode des Multimeters; verbinden die Kathode der mulimeter mit der Kathode der Stromversorgung. </li></ol> 6. Die Elektroporation E7.5 oder E8.5 Maus Embryonen <ol><li> Füllen Sie die Elektroporation Glaskapillare mit PBS in ca. 1-2 mm von oben und legen Sie die straiGHT Platinelektrode (Anode) in die Glaskapillare bis er den Boden der Kapillare erreicht. </li><li> Anker die L-förmige Elektrode (Kathode), die auf der Oberfläche einer 30 mm Petrischale mit PBS gefüllt. </li><li> Übertragen Sie den Embryo aus M2-Medium in das PBS-gefüllten Elektroporation Gericht. </li><li> Legen Sie die Injektionsnadel aus seitlichen Epiblast in die Amnionhöhle des Embryos. Mit Hilfe eines pneumatischen pico Pumpe, injizieren DNA-Lösung (pCAG-Cre: GFP oder pCAG-GFP 1-1,5 ug / ml mit 0,01% grüne Lebensmittelfarbe Farbstoff) in den Hohlraum, bis er vollständig gefüllt ist. Für E7.5-E8.5-Embryonen, ist kleiner als 5 &amp; mgr; l DNA-Lösung für einen Embryo erforderlich. Unter Verwendung der grünen Farbstoff als Indikator, achten Sie darauf, um den Embryo platzen. </li><li> Vorsichtig Position des Embryos zwischen den Elektroden und bewegen Sie die Kapillare Elektrode an den genauen Ort, wo die DNA zu liefern ist. Hinweis: Die Ausrichtung des Embryos ist abhängig von der Region, in der die DNA elektroporiert werden. </li><li> ElectropoBewerten des Embryos unter Verwendung von 200 Volt (V) in 6 Pulse, jeder von 50 ms Dauer mit einem 1 sec Intervall zwischen jedem Impuls. </li><li> Übertragen Sie die Embryo voräquilibriert Kulturmedium unmittelbar nach der Elektroporation. Falls gewünscht, wiederholen Sie den Vorgang für die nächste Embryo. Hinweis: Fügen Sie das Kulturmedium in einen sterilen Behälter und legen Sie sie in der Kulturbrutschrank vor, ins Gleichgewicht des Mediums. </li><li> Um nach der Kultur erkennen elektroporierten Zellen 2 h, übertragen Sie die Embryonen auf eine saubere 30 mm Petrischale von M2 Medium unter Verwendung eines pastette. Bild die Embryonen wie in Schritt 5.9 mit Hilfe eines Fluoreszenzverbindung Binokular. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen wieder in Kultur unter Verwendung eines pastette unmittelbar nach der Bildgebung. </li><li> Um tote Zellen durch Elektroporation verursacht werden, färben die Embryonen mit einem weitErythrozytenMembran undurchlässig Kernfarbstoff (1: 200 in Embryokulturmedium) bei 37 ° C für 10 min 2 h nach der Elektroporation (Optional) </li><li> Um die elektroporierten Zellen zu zählen, fixieren Sie die embryos in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 2-4 h bei 4 ° C, zu Verschmutzung des Ringes mit einem ultravioletten oder fernen Rot fluoreszierende Kerngegenfärbung und Bild die Embryos unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Optional). Hinweis: Embryonale Wachstum wird beeinträchtigt, wenn zu lange in PBS. Daher sicherstellen, daß die Zeit, die jeder Embryo elektroporieren minimiert wird (&lt;5 min pro Embryo). </li></ol>

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The authors have no conflicts of financial or other interest to declare.

Pfropfung Der entscheidende Schritt für die Zelltransplantation Experimenten ist das Einfügen eines zusammenhängenden Reihe von Zellen im Idealfall in einer einzigen Aktion, um Zerfall der Klumpen zu vermeiden. Diese Technik erfordert etwas Übung, bei der Kontrolle der Mundpipette. Wenn Spenderzellen übernehmen und in der Host, wird deren Derivate im Embryo zu zerstreuen. Um weiter zu bestimmen, ob die dispergierten Donor abgeleiteten Zellen differenzieren in geeigneter Weise in den Wirt können die Immunfärbung auf den Embryo Abschnitten durchgeführt werden. Wenn Spenderzellen nicht mit dem Host-Umgebung kompatibel ist, sie entweder nicht erkannt werden kann (wie sie aus dem Embryo ausgestoßen) oder bilden nicht eingebauten Klumpen in den Embryonen nach Kultur. Wenn beide dispergierten Zellen und Zellklumpen wurden beobachtet, kann dies darauf hinweisen, dass zu viele Zellen wurden gepfropft und übermäßige Spenderzellen, die nicht mit umgebenden Wirtszellen in Wechselwirkung treten können in Folge Klumpenbildung. In diesem Fall müssen zusätzliche Transplantate enthalteneine geringere Anzahl von Zellen durchgeführt werden. Die Haupteinschränkung der Zellen Pfropftechnik ist, dass es nicht möglich ist, die vollständige in vivo Potential von Zellen, da Maus ex vivo Kultur über einen längeren Zeitraum als 48 Stunden nicht erreicht worden zu bestimmen. Wenn jedoch mit ultraschallgesteuerten Zellinjektion kombiniert wird, kann es möglich sein, kultivierten Zellen der Embryos in utero zu übertragen. Um zusammenzufassen, Zelltransplantation Experimente sind weit verbreitet in unserer Gruppe verwendet und haben uns wertvolle Hinweise auf die In-vivo-Potenzial der verschiedenen Zelltypen 4,21,22 gegeben. Es ist eine Technik allgemein anwendbar, um die in vivo Potential von in vitro gezüchteten Zellen in der frühen Postimplantationsembryonen beurteilen. Elektroporation Obwohl in dieser Studie haben wir nur gezeigt haben, dass es effizienter, die Kapillare Elektroporation Technik zu verwenden, um das Epiblast Ziel, it ist ebenfalls möglich, absichtlich Ziel anderen Keimschichten wie Entodermzellen. Der entscheidende Schritt für die Kapillare Elektroporation Technik ist es, die Zeit für jedes Embryos (&lt;5 min pro Embryo) elektroporieren minimieren, da PBS ist sehr nachteilig für die frühe Mausembryonen. Obige hat unsere Daten zeigen, dass in den meisten Bereichen in der Embryonen, Elektroporation keinen Einfluss auf die Embryowachstum. Jedoch Elektroporation im Knoten verursachte abnormale Entwicklung und führte zum vorzeitigen Tod des Embryos. Dies ist aufgrund einer Beschädigung oder zum Tod der Zellen, die wichtige Signalstellen 23 bilden wahrscheinlich. Daher würden diese Region müssen bei dieser Technik vermieden werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass, wie in der Ergebnisse Abschnitt erwähnt, während Epiblast oder Primitivstreifen Zellen wurden gezielt einige Entodermzellen wurden elektroporiert. Dies kann sein, weil DNA erreicht Endoderm durch Spalten unter dem Ektoderm Epithel. Endoderm aus Epithelzellen besteht und in unserer Erfahrung these Zellen haben eine höhere Neigung zur Aufnahme DNA. Deshalb wird, wenn die Anwendung dieser Technik zum Schicksal Mapping, ist es wichtig zu ermitteln, welche Zellen zunächst aufnehmen DNA. Es sei auch bemerkt, dass, obwohl pCAG-GFP und pCAG-Cre werden: GFP Plasmide können effizient unter Verwendung der in dieser Studie gezeigt Elektroporationsparameter geliefert werden kann, kann die Effizienz anderer DNA-Konstrukte variieren kann und keine individuelle Optimierung. Veränderungen in der DNA-Konzentration, die Elektroporation Spannung oder der Anzahl von Impulsen kann gemacht werden, wenn Plasmide werden als schwierig zu transfizieren sind. Zusammenfassend kann unsere verbesserte kapillare Elektroporation System effizient und reproduzierbar liefern GFP oder Cre: GFP Plasmide in sehr wenigen Zellen im Embryo mit begrenzter Zelltod. Da diese Methode nicht teuer oder hoch spezialisierte Ausrüstung erfordern, kann es von großem Nutzen für die Zell Tracking-Studien oder bei der Prüfung der Auswirkungen der ektopische Expression oder bedingte Löschen o seinf Gene in frühen Embryonen, wird, wenn die Elektroporation in Embryonen mit floxed bedingte mutierten Allelen durchgeführt. Daher bietet diese Elektroporationstechnik eine nützliche funktionelle Werkzeug für das Verständnis auf einer Zelle-für-Zelle-Basis die Rollen von zell intrinsischen Faktoren im Zusammenhang mit der Wildtyp-embryonalen lokalisierten Umgebungen.

Zellkultur wurde in großem Umfang in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Embryonalen Stammzellen der Maus (WSR) und Epiblast-Stammzellen (EpiSCs) kann in alle drei Keimblätter in vitro zu differenzieren und sind ein nützliches Modell für die Zelldifferenzierung in der frühen Säugetierembryogenese. Die Ableitung dieser Zelllinien wurde eine Chance für in-vitro-Manipulation und detaillierte Untersuchung der lokalisierten Signalwege und Transkriptions Netzwerke, die während der frühen embryonalen Musterbildung eröffnet. Jedoch bleibt es wichtig, die in vivo Relevanz der Manipulationen in der Kultur durchgeführt bestimmen. Die In-vivo-Potenzial der Präimplantationsdiagnostik Embryonen gewonnenen Maus WSR hat durch die Einführung sie zurück in Präimplantationsembryonen (Morulae oder Blastozysten) 1 bewertet. Allerdings EpiSCs, die die Epiblastzellen in Postimplantationsembryonen darstellen kann nicht effizient in Präimplantationsembryonen 2,3 integrieren. Unsere previouns Erkenntnisse haben gezeigt, dass EpiSCs effizient zu erzeugen, Chimären und dazu beitragen, den Keimblättern, wenn sie in der Implantation Embryonen 4 gepfropft. Daher ist der beste Weg, um die in vitro gezüchtete Zellen zu bewerten, um sie in ihre entsprechenden Umgebung in vivo einzuführen. Elektroporation ist ein weit verbreitetes Verfahren, um exogene Moleküle in Zielzellen sowohl in vivo und in vitro-Experimenten zu liefern. Elektrische Energie kann eine große Anzahl von Poren in der Zellmembran, die exogene Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), um die Zellen eintreten kann generieren. Eine der größten Herausforderungen für diese Technik ist es, eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen mit hoher Effizienz Elektrotransfektion 5,6 kombinieren. Für die Elektroporation von Nukleinsäuren in embryonalem Gewebe, vergoldete Elektroden am häufigsten verwendet worden, so dass Targeting von Zellen in einem breiten Raumbereich 7-9. Um eine loca erreichenlized Gentransfer, eine nadelförmige Elektrode wurde verwendet, um eine Brenn elektrischen Feldes 10,11 zu erzielen. Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigten die Autoren, dass nach der Elektroporation 30-60 Zellen hatte die DNA aufgenommen konstruieren 11. Dennoch scheint es, daß genau Anpassung der Anzahl der elektroporierten Zellen nach wie vor schwierig mit fester Breite Elektrode. Die Kapillare Elektroporation Technik wurde verwendet, um Plasmide zu einzelnen Zellen 12-14 zu liefern. Jedoch hat diese Technik nicht für die Elektroporation von Plasmiden, Embryonen ex vivo angewendet. In jüngerer Zeit hat eine Mikrovorrichtung lokal elektroporieren wenige distalen visceralen Entodermzellen (weniger als 4 Zellen) in der frühen Postimplantationsmausembryonen 15 gemeldet. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob dieses Gerät effizient Ziel Ektoderm und Mesoderm ex vivo. In dieser Studie beschreiben wir zwei neue Verfahren zur zellulären und Gen-Funktion in der frühen Post bewerten-Implantation Embryonen. Wir zuerst zeigen, wie man in vitro kultivierten Zellen in definierten Stellen in der frühen Mausembryonen zu pfropfen, um ihre in-vivo-Potenzial zu bewerten. Die Integration der transplantierten Zellen und deren Nachkommen, die alle durch eine genetische Markierung (beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) markiert sind, können durch Immunfärbung von Gewebe spezifische Proteine ​​untersucht werden. 4 Zweitens beschreiben wir ein verbessertes Verfahren, um genau zu liefern DNA lokalisierte Stellen in den Embryo mittels Elektroporation. Anstatt eine nadelförmige Elektrode, legten wir einen dünnen Draht in einem spitzen Glaskapillare, und zeigen, dass diese Modifikation kann die DNA auf eine kleine Zahl von Zellen mit hoher Effizienz und begrenzte liefern Zelltod. Darüber hinaus zeigen wir, dass durch die Verwendung von Glaskapillaren mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen, können wir die Anzahl der elektroporierten Zellen zu steuern. Deshalb glauben wir, diese Methode kann von großem Nutzen sein, um frühen embryonalen Musterbildung Studie mit kleinen Zahlen of Zellen.

<table><tbody><tr><td>Forceps</td><td>Dumostar</td><td>T5390</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope system with fluorescence&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope with a digital camera</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX61</td><td></td></tr><tr><td>Inverted confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11397863</td><td></td></tr><tr><td>30mm Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo scientific</td><td>179820&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2 medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes&amp;nbsp;</td><td>NICHIRYO</td><td>Nichipet</td><td></td></tr><tr><td>tips&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>685280</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>SANYO</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Roller culture apparatus&amp;nbsp;</td><td>BTC Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters 0.45&amp;micro;m, sterile&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>non-essential amino acids (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30549.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Gas Cartridge for Portable Meker Burner</td><td>COLEMAN&amp;nbsp;</td><td>COLEMAN 250</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>640798</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&amp;nbsp;</td><td>De Fonbrune</td><td>BS030301</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic pico pump&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 square wave pulse generator&amp;nbsp;</td><td>BTX</td><td>45-0002</td><td></td></tr><tr><td>Green food coloring dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C.I. 42053</td><td></td></tr><tr><td>A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye</td><td>Biotium</td><td>40060-T</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-Cre:GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#13776&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#16664</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Excel</td><td>XL830L</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators&amp;nbsp;</td><td>Leitz&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2mm diameter platinum wire&amp;nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>E404-2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Chicken IgY, HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2428</td><td></td></tr><tr><td>Liquid DAB+ Substrate Chromogen System&amp;nbsp;</td><td>Dako</td><td>K3467</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>A far-red fluorescence nuclear counterstain</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for precisely localized transfer of cells or dna into early postimplantation mouse embryos

Manipulation und Kultur der frühen Maus-Embryonen ist eine leistungsstarke und dennoch weitgehend ausgelastet Technologie Steigerung des Werts von diesem Modellsystem. Umgekehrt Zellkultur wurde in großem Umfang in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Es ist jedoch wichtig, festzustellen, ob in vitro kultivierten Zellen wirklich in vivo Zelltypen zu repräsentieren. Pfropfen Zellen in Embryonen, gefolgt von einer Bewertung ihrer Beteiligung bei der Entwicklung ist eine nützliche Methode, um das Potential von in vitro kultivierten Zellen zu bestimmen. In dieser Studie beschreiben wir ein Verfahren zum Pfropfen von Zellen in einem definierten Ort der frühen Postimplantationsmausembryonen, gefolgt von der ex vivo-Kultur. Außerdem stellen wir einen optimierten Elektroporationsmethode, die Glaskapillaren verwendet bekanntem Durchmesser, die eine genaue Lokalisierung und Anpassung der Anzahl von Zellen Empfangen exogene DNA sowohl mit hohen Transfektionseffizienz und niedrige Zelltod. Diese Techniken, die keine sp erfordernecialized Geräte, übertragen experimentelle Manipulationen der Gastrulation und frühen Organogenese stufigen Mausembryo möglich, kann Analysen Einsatz in kultivierten Zellpopulationen und die Wirkung der genetischen Manipulationen in situ auf die Zelldifferenzierung.

Pfropfung EpiSCs die ubiquitär exprimieren EGFP (r04-GFP aus E6.5 Ektoderm abgeleitet und C2, die in vitro aus mESCs abgeleitet) 4 manuell von der Kulturschale abgeschabt und in verschiedene Stellen von E7.5-Embryonen (2A) gepfropft. Die Embryonen wurden ex vivo kultiviert und nach 24 Stunden analysiert. Die Verteilung von Spenderzellen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Wenn Spenderzellen aufgenommen, vermehren sie und ihre Derivate innerhalb der Host-Embryonen (2B) dispergiert. Es wurde beobachtet, daß Transplantate enthalten 10-16 Zellen effizient in den Wirts Embryonen (2A und 2B) eingearbeitet, jedoch Pfropfung mehrere Zellen nicht in besseren chimaerism führen. Stattdessen erzeugt transplantierten Zellen unincorporated Klumpen (2C und 2D). Elektroporation Einssess die Effizienz unserer Elektroporationssystem lieferten wir GFP-exprimierenden Plasmiden (pCAG-GFP und pCAG-Cre: GFP) auf bestimmte Websites im Embryo. In Übereinstimmung mit einer früheren Studie 11 wurden GFP + Zellen in Embryonen nachgewiesen 1-2 Stunden nach der Elektroporation (2E und 2G). Wenn distalen Epiblastzellen am späten Primitivstreifen Stadium Embryos wurden durch Elektroporation, trugen markierten Zellen zu neuronalen Ektoderm nach 24 Stunden in Kultur (Abbildung 2E und 2F). Dieses Ergebnis entspricht auch den bekannten Schicksal Karten Epiblastzellen in Gastrulation Embryonen 17. Ähnlich wird, wenn das GFP-Expressionsplasmid wurde in Primitivstreifens an E8.5 (2-5 Somiten) elektroporiert, GFP + -Zellen zu paraxialen Mesoderms (2G und 2H), im Einklang mit bekannten Schicksal Karten der späten Primitivstreifens 18 beigetragen . Außerdem beobachteten wir, Beitrag zu allen drei Keimschichten aus elektroporierten Zellen (2I-K),was darauf hindeutet, dass die Elektroporation Verfahren nicht das Zellverhalten in vivo beeinträchtigen. Allerdings haben wir auch festgestellt, dass, während Epiblast (E7.5) oder Primitivstreifen Zellen (E8.5) wurden gezielte, einige Entodermzellen wurden elektroporiert (3C und Tabelle 1). Einer der Hauptvorteile der Verwendung eines Kapillar-Elektrode ist, daß die Anzahl der elektroporierten Zellen gesteuert werden kann, einfach durch Ändern des Durchmessers der Öffnung aus. Um die Anzahl der elektroporierten Zellen zu bestimmen, wurden die Embryos 2 Stunden nach der Elektroporation fixiert und in Wholemount auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet wird. Die Anzahl der GFP + -Zellen wurde manuell in den konfokalen z-Stapel gezählt. Tabelle 1 zeigt, dass für eine bestimmte Stufe, wodurch die Öffnungsgröße der Glaskapillare 20 bis 30 &amp; mgr; m führt zu DNA-Aufnahme durch mehrere Zellen. Wenn eine einzelne Öffnungsgröße zwischen Stufen (E7.5 gegen E8.5) verglichen wird, wurden mehr Zellen gefunden, um in einer späteren Stufe der Elektroporation werden. Dieser Effekt kann durch eine höhere Konzentration an DNA, die in der Amnionhöhle zu E8.5 sein. Weil die DNA-Lösung wurde mit dem grünen Lebensmittelfarbstoff gemischt werden, kann man die grüne Farbe zu verwenden, um die DNA-Konzentration in der Amnionhöhle zu beurteilen. Im Mikroskop, ist es klar, dass, wenn sie mit E8.5-Embryonen verglichen wird, ist die grüne Farbe nach der DNA-Injektion in den Hohlraum des E7.5-Embryonen viel leichter. Obwohl die gleiche Konzentration an DNA-Lösung wurde in E7.5 und E8.5-Embryonen injiziert, war mehr DNA-Lösung in der Amnionhöhle von Embryos E8.5, um es vollständig zu füllen, weil sie in der Größe größer sind. Nach dem Zurückziehen der Injektionsnadel, gibt es immer eine gewisse Leckage der DNA-Lösung aus der Amnionhöhle und da das Einstichloch ist im Vergleich zu der Größe der Amnionhöhle früher Embryonen größer ist, ist es wahrscheinlich, dass es proportional mehr Leck von E7.5 als E8.5 Embryonen, die zu einem niedrigeren DNA-Konzentration. Die unterschiedliche Anzahl transfizierterZellen können auch durch die unterschiedlichen Durchmesser oder induzierten Transmembranspannung (ITV) Schwellen der Zellen in den verschiedenen Phasen ist. Ein Nachteil der Elektroporation ist die zugehörige Zelltod. Ähnlich wie die traditionellen vergoldet oder nadelförmigen Elektroden, die Elektroporation unter Verwendung eines Kapillar-Elektrode veranlasst den Zelltod. Nach der Elektroporation erschien der Zielregion in der Farbe dunkler im Vergleich zu benachbarten Regionen (3A und 3B), was anzeigt, dass ein gewisser Grad des Zelltods ist in diesem Bereich aufgetreten ist. Die Anzahl der toten Zellen durch das Elektroporationsverfahren verursacht wird, weiter zu bestimmen, wurden die Embryos mit einem fluoreszierenden Zellmembran undurchlässige Kernfarbstoff gefärbt. Die Kerne der toten Zellen mit einer membran undurchlässigen fernen Rot-Fluoreszenz-Farbstoff markiert. Die Färbung bestätigt, dass diese Kapillare Elektroporationstechnik bewirkt nur eine kleine Anzahl von toten Zellen in der Nähe der Elektroporation Website (3D und Table 1). Uns ist aufgefallen, dass, obwohl abgestorbenen Zellen an der Elektroporation Website erscheinen, sind auch GFP + -Zellen und toten Zellen exklusivsten voneinander (Abbildung 3E und 3F). Wenn darüber hinaus der Schwanzseiten Epiblasts bei E8.5 wurde mit pCAG-GFP und einer Glaskapillare Öffnung von 20 um, eine große Zahl von GFP + -Zellen elektroporiert wurde nach 48 Stunden in Kultur (Figur 3G und 3H) detektiert. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe am GFP + -Zellen nachgewiesen 2 h nach der Elektroporation sind noch lebensfähig bei der weiteren Kultur. Wir hat die Anzahl der GFP + -Zellen nach 24 Stunden ex vivo Kultur. Sechs Embryos wurden mit pCAG-GFP bei E7.5 elektroporiert, mit einer Kapillaröffnung von 20 um Durchmesser. 107 ± 31 (Mittelwert ± Standardabweichung) GFP + Zellen / Embryos festgestellt wurden. Da zu Beginn der Kultur (2 h) wurden 9-Zellen im Durchschnitt pro Embryo elektroporiert ( <s<html> trong&gt; Tabelle 1), bedeutet dies, dass elektroporierten Zellen unter 3-4 Spaltungen innerhalb 2 Stunden. Der durchschnittliche Zellverdopplungszeit von E7.5 bis E8.5-Embryonen ist etwa 6-7 h in allen Zellen mit Ausnahme derjenigen, in der ventralen Knoten 19,20. Dies legt nahe, dass die Elektroporation Verfahren nicht das normale Zellwachstum zu behindern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schaltungsdiagramm der Elektroporation Setup. Der Embryo enthaltenden DNA-Lösung in ihrer Amnionhöhle wurde zwischen den beiden Elektroden angeordnet ist. Strom bei den gewählten Parametern wurde durch eine Rechteckimpulsgenerator (Netzteil) zur Verfügung gestellt. Ein Multimeter in Serie, um den elektrischen Strom, der den Embryo zu detektieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Verteilung der gepfropften oder elektroporierten Zellen in Wirts Embryonen. (AH) GFP-Fluoreszenz Overlays (grün) auf Hellfeld Bilder Wholemount Embryonen (Graustufen) (A) 10-16 GFP + EpiSCs wurden in den distalen Bereich einer späten gepfropften -streak Stadium Embryo. (C) Eine größere Klumpen von GFP + EpiSCs wurde in den distalen Bereich einer Halbserie Stadium Embryos gepfropft. (B und D) Die Verteilung der EpiSCs abgeleiteten Zellen (grün) in den Host-Embryonen (in gezeigt A und C) nach 24 Stunden in Kultur. (B) GFP + -Zellen in den Wirtsembryo dispergiert, was auf korrekte Integration der Spenderzellen. (D) Pfropfen größeren Zellklumpen in Folge nicht eingebauten Klumpenbildung in den Wirtsembryo. (EK) pCAG-Cre: GFP-Plasmid ele<html> in bestimmten Bereichen des Wildtyp-Embryonen ctroporated. Elektroporation den distalen Bereich eines frühen Knospenstadium Embryo (E) oder des Primitivstreifens eines 2-5 Somiten Stadium Embryos (G) führte zu GFP + -Zellen in diesen Regionen zu 2 Stunden nach dem Eingriff. (F und H) die Verteilung von GFP + -Zellen in den Wirtsembryos nach 24 Stunden in Kultur und zeigt, daß elektroporierten Zellen tragen zur Neuroektoderm (schwarzer Pfeil) (F) und paraxialen Mesoderms (weißer Pfeil) (H). (IK) DAB Immunfärbung für die GFP + -Zellen zeigt, daß die elektroporierten Zellen Vorrücken in Neuroektoderm (I) geben kann, Mesoderm (J) und Endoderm (J und K) nach 24 Stunden in Kultur. Maßstabsbalken (AH) = 250 &amp; mgr; m; Maßstabsbalken (IK) = 100 um. Hinweis: 1A und 1B aus unserer früheren Veröffentlichung 4 abgedruckt.href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53295/53295fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verteilung der GFP + -Zellen und toten Zellen in den Embryonen nach der Elektroporation (AC) pCAG-Cre:. GFP-Plasmid in die Schwanzseiten Epiblastzellen eines E8.5 elektroporiert (2-5 Somiten-Stadium) Embryo (Kapillaröffnung Größe :. 20 um) (A) 2 h nach der Behandlung zeigte die Zielregion eine dunkle Farbe (weißer Pfeil) im Vergleich zu anderen Teilen des Embryos. Einschub zeigt eine Vergrößerung der Elektroporation Region. (B) Bildhellfeld (Graustufen) überlagert mit dem grün fluoreszierenden Kanal, der die elektroporierten Zellen (grün). (C) Ein konfokales z-Scheibe zeigt, dasszwei Entodermzellen (grün) nahm auch das Plasmid, wenn die Schwanzseiten Epiblastzellen wurden gezielt. . Die Zellkerne werden in Rot (DF) pCAG-Cre gezeigt: GFP-Plasmid wurde in der kaudalen Seite des Knotens eines E8.5 Embryo elektroporiert (Kapillaröffnung Größe: 30 um). Der Embryo wurde 2 Stunden lang kultiviert. Elektroporierten Zellen sind grün und tote Zellen rot dargestellt. (D) Die Elektroporation Bereich sowohl GFP + Zellen sowie tote Zellen enthält. Der Bereich, in dem weiße Box wurde in einem konfokalen Mikroskop analysiert. Manuelles Zählen der z-Stapel zeigte, dass es 33 GFP + -Zellen und 23 toten Zellen in diesem Bereich. Nur zwei Zellen waren sowohl für beide Fluorophore positiv. (E und F) XYZ Ansicht eines konfokalen z-Scheibe von der weißen Box Region D, welche GFP + -Zellen getrennt von den toten Zellen sind. Die Zellkerne sind blau dargestellt (G und H) pCAG-Cre:. GFP-Plasmid wurde in einigen cel elektroporiertls im kaudalen Seiten Epiblast eines E8.5 Embryonen (Kapillaröffnung: 20 &amp; mgr; m) und abgebildet nach zwei (G) und 48 (H) Stunden ex vivo Kultur Hinweis: (H) Der Embryo wurde in zwei nach der Kultur getrennt. Kopf und Herz Regionen wurden entfernt. Maßstabsbalken (A, B, D, G und H) = 250 um; Maßstabsleiste (C, E und F) = 100 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Durchmesser der Öffnung des Kapillarrohrs </td><td> Embryonalstadium </td><td> Elektroporation Effizienz: nein. Embryonen GFP + Zellen nach 2h / gesamte Anzahl enthält. der Elektroporation Embryonen (Nr. GFP + Embryonen, die in der Regel nach 24 oder 48 Stunden-Kultur entwickelt) </td><td> Durchschnittliche Anzahl der GFP + -Zellen pro Embryo ± Standardabweichung (n = Nr. Der untersuchten Embryonen) </td><td> Anzahl derGFP + endodermalen Zellen pro jedem Embryo ± Standardabweichung (n = Nr. Der untersuchten Embryonen) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 7/9 (7) </td><td> 9 ± 3 (n = 4) </td><td> 4 ± 2 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E7.5 (LS-LB) </td><td> 13/15 (12) </td><td> 17 ± 2 (n = 4) </td><td> 6 ± 1 (n = 4) </td></tr><tr><td> 20 um </td><td> E8.5 (2-5 Somiten) </td><td> 12/13 (10) </td><td> 21 ± 4 (n = 4) </td><td> 11 ± 4 (n = 4) </td></tr><tr><td> 30 um </td><td> E8.5 (2-5 Somiten) </td><td> 2/2 (2) </td><td> 33 und 26 (n = 2) </td><td> 14 und 16 (n = 2) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Electroporation Effizienz pCAG-Cre: GFP-Plasmid in Maus-Embryonen. Abkürzung: LS, spät Primitivstreifen Stufe; LB: späten Knospenstadium. Die Embryonen werden nach inszeniertDowns und Davies 12

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Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.3K Aufrufe.  School of Biological Sciences, University of Edinburgh. We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

Serie: Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neurowissenschaften

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetik

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.

Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. ...

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Biologie

Utero-tubal Embryo Transfer and Vasectomy in the Mouse Model

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects of epigenetic alterations originated during preimplantation development on subsequent fetal development and adult health. The use of an effective and consistent embryo transfer technique is crucial to enhance the generation of genetically modified animals and to determine the effect of different treatments on implantation rates and survival to term. Embryos at the blastocyst stage are usually transferred by uterine transfer, performing a puncture in the uterine wall to introduce the embryo manipulation pipette. The orifice performed in the uterus does not close after the pipette has been withdrawn, and the embryos can outflow to the abdominal cavity due to the positive pressure of the uterus. The puncture can also produce a hemorrhage that impairs implantation, blocks the transfer pipette and may affect embryo development, especially when embryos without zona are transferred. Consequently, this technique often results in very variable and overall low embryo survival rates. Avoiding these negative effects, utero-tubal embryo transfer take advantage of the utero-tubal junction as a natural barrier that impedes embryo outflow and avoid the puncture of the uterine wall. Vasectomized males are required for obtaining pseudopregnant recipients. A technique to perform vasectomy is described as a complement to the utero-tubal embryo transfer.

Utero-tubal embryo transfer uses the utero-tubal junction as a barrier to prevent the embryo outflow that may occur when performing uterine transfer. Vasectomized males are required to obtain pseudopregnant recipients for embryo transfer. Both techniques are discussed.

Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

The transfer of preimplantation embryos to a surrogate female is a required step for the production of genetically modified mice or to study the effects ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...