AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]). 1. Medienvorbereitung <ol><li> Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten TS-Medium (w / o FGF4 / Heparin): Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (Stammzellkultur-Qualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM ), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM). </li><li> Bereiten Sie TS-Medium mit FGF4 / Heparin (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (StammzellKulturqualität), Penicillin / Streptomycin (1x), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Vorbereitung TS-CM mit FGF4 / Heparin (TS-CM + F4H): 70% MEF Anlage TS Medium + 30% frisch hergestellten TS-Medium + 25 ng / ml FGF4, 1 &amp; mgr; g / ml Heparin. Anmerkung: FGF4 und Heparin werden direkt in die Medien unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. </li><li> Bereiten Sie Transfektionsmediums: Erweiterte DMEM, 2% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li><li> Bereiten Sie Virus-Produktionsmedium: Erweiterte DMEM, 5% (v / v) FBS (Stammzellkulturqualität), L-Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (1x). </li></ol> 2. murine embryonale Fibroblasten-Ableitung <ol><li> Set timed Paarungen wt 129S2SV Frauen mit und homozygote männlichen R26 :: rtTA Mäuse (Stamm Name; B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Am E13.5 Opfer Mäuse durch Genickbruch und zu isolieren primären murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) nach Standardprotokollen 8. Danach Platte Zellen aus einem Embryo auf einem 150-mm-Schale in MEF-Medien. </li><li> Sobald primäre MEF Kulturen Konfluenz auf 150-mm-Schalen erreichen, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS und 4 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung. Inkubieren Geschirr für 3 bis 4 min in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation zu überprüfen, ob Zellen von der Schale abgelöst einem inversen Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv) verwendet wird. 5 ml MEF Medien Trypsinierung zu stoppen und Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen sammeln. </li><li> Pool Zellsuspension aus mehreren Gerichten und sammeln in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifuge Zellsuspension für 3 min bei 200 xg und 10 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in FBS, enthaltend 10% (v / v) Dimethylsulfoxid. Frieren MEFs in Aliquots für die weitere Verwendung. Hinweis: Alternativ können Sie auch Wildtype primäre MEFs; jedoch muss eine zusätzliche lentiviralen Vektor exprimierenden rtTA zusammen mit den anderen lentiviralen Vektoren transduziert werden (zum Beispiel unter Verwendung des FUdeltaGW-rtTA Plasmid durch Maherali et al. 9). </li><li> Herstellung von MEF Anlage TS - Medium Hinweis: Vor der Umwandlung Experimente, MEF Anlage (CM) TS Medien vorbereitet werden muss, die für die Subkultur der einzelnen ITSC Linien erforderlich ist (beschrieben in Abschnitt 6). <ol><li> Plate 1 x 10 7 mitotisch inaktivierten MEF pro 150 - mm - Schale in MEF Medium auf gewünschte Anzahl an Gerichten. Inaktivieren MEFs durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 9 Gy. Hinweis: Die Ausbeute pro 150 mm Schale ca. 60 ml CM ist. </li><li> Der Tag nach der Plattierung, absaugen und MEF Medium verwerfen und 20 ml hinzufügen frisch TS-Medium hergestellt (ohne FGF4 / Heparin) auf jede Schale von mitotisch inaktivierten MEF und Ort Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Nach InkubationTS-Medium für drei Tage auf mitotisch inaktivierten MEF, sammeln Medium in 50 ml konischen Röhrchen. Filtermedium durch ein 0,2-um-Filter und fahren Sie mit 2.6.4. Ersetzen CM mit 20 ml frischem Medium TS zur Herstellung einer weiteren Charge von CM. Hinweis: Mitotisch inaktivierten MEF für CM Vorbereitung bis zu drei Mal verwendet werden. </li><li> Aliquotieren 35 ml gefiltertes CM in 50 ml konischen Röhrchen und bei -20 ° C bis benötigt. Nach dem Auftauen 15 ml frisch hergestellten TS-Medium um 70% TS-CM und lagern bei 4 ° C zu erhalten, für bis zu einem Monat. </li></ol></li></ol> 3. Lentivirale Vector Produktion in 293T-Zellen Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Vor der Umwandlung Experimente, lentivirale Vektoren für die Doxycyclin (DOX) abhängig Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2 und mCherry vorzubereiten. Für jede Lentiviren, Co-transfizieren mit 293T-Zellen diejeweiligen lentiviralen Transfervektor zusammen mit einem Verpackungs Plasmid und einem VSV-G-exprimierenden Plasmid Hülle (für Informationen Plasmid zu den Materialien siehe Tabelle). Hinweis: Für hilfreiche Informationen in Bezug auf die Produktion Virus Gavrilescu beziehen et al . 10. Obwohl es Retro Produktion beschreibt auch, allgemeine Bemerkungen in Bezug auf Qualität von 293T-Zellen und Plasmid-DNA sind wahr für Lentiviren Produktion. VORSICHT: Geeignete Sicherheitsmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn sie mit lentiviralen Vektoren und Arbeit Arbeit hat in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt werden. </li><li> Coat fünf 100 mm-Schalen mit Poly-L-Lysin (100 &amp; mgr; g / ml) Lösung, die durch Abdecken der Gerichte mit 5 ml der Lösung und Schaukel sanft Beschichtungslösung gleichmäßig verteilen. Die Schalen werden wieder in den Inkubator bei 37 ° C für 30 min. Nach 30 absaugen Beschichtungslösung min und spülen Geschirr einmal mit PBS. </li><li> Tafel 7 x 10 6 293T Zellen pro Schale in 10 ml 293T-Zellmedien, swirl Gerichte gleichmäßig Zellen und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C zu verteilen. </li><li> Am nächsten Morgen, Wachstumsmedium mit 5 ml Transfektionsmediums ersetzen. In 6 ul einer 1,000x Lager von Chloroquin-Lösung (25 mM) und Platz Gerichte wieder in den Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Inzwischen bereiten Transfektionsgemischs: <ol><li> Für jeden lentiviralen Vektor zwei 5 ml Reaktionsgefäße herzustellen, die mit A und B. </li><li> In 600 ul 2x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS) auf das Rohr A. </li><li> In Rohr B - Mix 61,5 ul CaCl 2 - Lösung (2 M), mit 18,5 ug lentivector DNA und 9,25 ug psPAX2 und 9,25 ug pMD2.G. Stellen Sie die Lautstärke auf 600 &amp; mgr; l mit sterilem Kulturqualität H 2 O. </li><li> In Lösung von Rohr B tropfenweise zu Rohr A während verwirbelt. Inkubieren Transfektion Mischung 15 min bei RT. </li></ol></li><li> In Transfektionsgemischs fallen sehr sorgfältig weise auf die vorbereiteten 293T-Zellen auf der 100-mm-Schale. EINfter 5 bis 6 h entfernen Medium und ersetzen mit 10 ml Virus-Produktionsmedium. Platzieren Geschirr wieder in den Inkubator bei 37 ° C. Hinweis: Seien Sie vorsichtig beim Entfernen und Ersetzen Medium, da leicht 293T-Zellen aus der Schale lösen. Medienwechsel 5-6 Stunden nach der Transfektion ist von entscheidender Bedeutung, da längere Exposition gegenüber Chloroquin auf die Zellen toxisch ist. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernen und zu entsorgen Medium und mit 7 ml Virus-Produktionsmedium ersetzen. </li><li> Am nächsten Morgen ernten die erste Charge von virushaltigen Medium. Absaugen Medium und sammeln sich in einem 15 ml konischen Röhrchen. Wieder 7 ml Virus-Produktionsmedium auf die Zellen hinzufügen. Shop virushaltige Medium im Kühlschrank, bis die zweite Partie am folgenden Tag geerntet wird. </li><li> Am nächsten Morgen die zweite Charge von virushaltige Medium absaugen es zu den 15 ml konischen Röhrchen, das die erste Partie Zugabe. 293T-Zellen können nun verworfen. Filter virushaltige Medium durch einen 0,45 &amp; mgr; m surfactant freie Celluloseacetat -Membran Filter. Aliquot filtriert, virushaltige Medium und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung. Anmerkung: Die Virusproduktion kann auch in 6-Well-Platten durchgeführt werden. Nach unten skalieren Volumen und Zellzahlen entsprechend. </li></ol> 4. Fibroblast Transduction mit 4 Faktoren und mCherry Steuervektor Hinweis: Alle Schritte werden in einem Biosafety Level 2-Anlage durchgeführt. <ol><li> Für eine schematische Darstellung der experimentellen Umriss siehe Abbildung 1. Auftauen eine aliquote Menge von primären rtTA-MEFs und 3,33 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well - Platte in einem Gesamtvolumen von 2 ml MEF Medien plattieren. Bereiten Sie mindestens 3 Vertiefungen und beschriften mit 4 Faktoren (4F), mCherry und Kontrolle. Hinweis: Alternativ können Wildtyp-MEFs verwendet werden, wenn ein rtTA exprimierenden lentiviralen Vektor zur lentivector Cocktail während 4,2 Schritt hinzugefügt wird. </li><li> Am folgenden Tag, nachdem die Zellen vollständig von cryopre erholtservation Ersetzen MEF Medien in den drei 6-wells mit 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) und 1 ml (Kontrolle) von Transduction Medien, respectively. Tauen Sie eine aliquote Menge von PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets und -mCherry Virus bei RT und fügen 100 ul jeder Virus enthaltenden Überstand (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) in den 4F gut. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA Virus auf das 4F Mischung enthaltende Überstand. </li><li> 100 l mCherry virushaltigen Medien auf die gut mit mCherry gekennzeichnet. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 &amp; mgr; g / ml in jede Vertiefung. Die Schale wieder in den Inkubator bei 37 ° C und Inkubation MEFs O / N mit virushaltigen Überstand. Hinweis: Bei Wildtyp-MEFs, reduzieren Volumen von vorplattiertes Medien von 100 &amp; mgr; l und fügen Sie zusätzlich 100 ul FUdeltaGW-rtTA virushaltige Überstand. </li><li> Am nächsten Morgen, sorgfältig entfernenvirushaltigen Medien und wasche dreimal mit 2 ml PBS. Schließlich 2 ml TS-Medien (ohne FGF4 / Heparin). Anmerkung: Transduzierte MEFs kann entweder direkt zur ITSC Induktionsexperimente verwendet werden, oder zur weiteren Verwendung eingefroren. </li></ol> 5. Fibroblast zu ITSC Conversion Hinweis: Alle Schritte werden im Laborraum zu Biosafety Level lizenziert 2 durchgeführt. <ol><li> Waschen Sie transduzierten MEFs zweimal mit 2 ml PBS und nach Zugabe von 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung sie im Inkubator inkubieren 3-4 min. Überprüfen Sie unter einem inversen Mikroskop für die ordnungsgemäße Ablösung der Zellen. <ol><li> Inactivate Trypsin von 1 ml Medium TS Zugabe. Übertragen die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 3 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 2 ml TS-Medium. Verwenden Sie die untransduzierten Kontrollprobe, die Zellen zu zählen. </li><li> Platte 4F-MEFs, mCherry-MEFs und untransduzierten Steuer MEFs jeweils in einer Dichte von 2 x 10 &amp; sup5 ;Zellen pro 100 mm Zellkulturschale in 10 ml TS-Medium, enthaltend 2 &amp; mgr; g / ml dox (TS-Medium + FGF4 / Heparin + DOX). </li><li> Alternativ führen transdifferentiation auf kleinere Gerichte. Platte 3,6 x 10 3 Zellen pro cm 2 auf gewünschte Schale Größe, Umfang Volumen entsprechend. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag, ein Epifluoreszenz-Mikroskop (mit einem 10fach-Objektiv und einen Filter geeignet für rote Fluoreszenzanregung) überwachen die Expression von mCherry Protein um Transduktionseffizienz zu schätzen. Hinweis: Transduktionswirksamkeit sollte auf 100% betragen. Wenn erhöhte Zelltod nach Transgen Induktion offensichtlich ist bedeutet dies, dass Virus-Titer zu hoch war. Transduktion sollte mit verringerter Menge an Virus-haltigem Medium wiederholt werden. </li><li> Von nun an Wechselmedien auf allen Plattierung jeden zweiten Tag bis zum Tag 10 nach der Gerichte. Danach füttern Zellen mit TS-Medium ohne DOX (TS-Medium + FGF4 / Heparin). </li><li> Unter Verwendung eines invertierten Mikroskops Monitor fürAussehen von &#39;transdifferentiated Gebiete &quot;auf 4F Schale (auf 2B und C beziehen) für bis zu 3 Wochen. Solche Kolonien sollten sich nicht auf die beiden Kontrollschalen (mCherry-MEFs und untransduzierten MEF) sichtbar sein. </li></ol> 6. Isolierung einzelner ITSC Linien Hinweis: Für Schritt 6.3 eine Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich. Es wird empfohlen, den inversen Mikroskop mit 70% Ethanol abzuwischen, um die Chancen auf eine bakterielle Kontamination zu minimieren. Einzel ITSC Kolonien können zwischen den Tagen 21 und 28 Tagen nach der Transdifferenzierungs isoliert werden. <ol><li> In 40 ul 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung in 12 Vertiefungen einer 96-U-Boden-Well-Platte und die Schale auf dem Eis. </li><li> Vor Kolonieisolierung, aspirieren Medium auf 4F-MEF transdifferentiation Gericht. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS. Wieder, 10 ml PBS und Ort Schale unter einem inversen Mikroskop. </li><li> Mit einer 100-ul-Pipette auf 40 ul eingestellt einzelnen Kolonien Lift, durch circling sie mit der Pipettenspitze und dem schwimmenden Kolonie Absaugen. Transfer Zellen einer Kolonie jeweils in eine Vertiefung der vorbereiteten Schale mit 96 Vertiefungen. Nach dem Pflücken 12 Kolonien platzieren Schale mit 96 Vertiefungen in den Inkubator bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Distanzieren Zellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals und Transfer Zellsuspension in eine Vertiefung einer Schale mit 24 Vertiefungen mit vorbereiteten 500 ul TS-CM-Medium (30% Frisch TS-Medium + 70% CM + FGF4 / Heparin). </li><li> Am folgenden Tag ersetzen Medium mit frischem TS-CM-Medium toten Zellen zu entfernen. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li><li> Monitor für Auftreten von epithelialen Kolonien mit hellen Grenzen (siehe Abbildung 2). Sobald Kolonien erscheinen, Kultur bis 70% konfluent oder für bis zu einer Woche und nach und nach größere Gerichte erweitern auf. Von nun an Kulturzellen als bona fide TSCs, nach Standardprotokollen in serumhaltigen Medien oder in serumfreiem, definiertem Medium 3,5,11. </li></ol>

<ol>
	<li>Cambuli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+of+the+first+cell+fate+decision+prevents+complete+ES+cell+reprogramming+into+trophoblast.">Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast.</a> Nat commun. 5, 5538 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Induction+of+Trophoblast+Stem+Cells+from+Murine+Fibroblasts.">Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).</li><li>Benchetrit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Nuclear+Reprogramming+Underlies+Lineage+Conversion+into+Functional+Trophoblast+Stem-like+Cells.">Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).</li><li>Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+mouse+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+TGF-beta/activin.">Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin.</a> Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).</li><li>Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+Oct-4+blocks+progenitor-cell+differentiation+and+causes+dysplasia+in+epithelial+tissues.">Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues.</a> Cell. 121 (3), 465-477 (2005).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. (10), e550 (2007).</li><li>Kubaczka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+Maintenance+of+Murine+Trophoblast+Stem+Cells+under+Defined+Conditions.">Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.</a> Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zel...

Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen - Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist. Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Doxycycline hyclate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D9891-10G</td>
			<td style="width:180px;">Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Chloroquine diphosphate salt&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">human recombinant Fibroblast Growth Factor 4</td>
			<td style="width:93px;">ReliaTech</td>
			<td>300-131L</td>
			<td style="width:180px;">Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 &#181;g/ml stock solution. Store aliquots at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-10KU</td>
			<td style="width:180px;">Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">ProFection Mammalian Transfection System</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td>E1200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1419-094</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">DMEM (1x) + GlutaMAX</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31966-021</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">RPMI 1640, no glutamine</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31870-025</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Advanced DMEM (1x)</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12491-015</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:93px;">Hyclone</td>
			<td>SH30071.03IR</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td>431220</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140-035</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360-039</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030-24</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:93px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31350-010</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:199px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade</td>
			<td style="width:93px;">Panreac AppliChem GmbH</td>
			<td>A3672,0100</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Tfap2c</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70269</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Gata3</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70270</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Eomes</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-Ets2</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70272</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pLV-tetO-mCherry</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>70273</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">psPAX2</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">pMD2.G</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Addgene</td>
			<td>19780</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td>
			<td style="width:93px;">JAX Mice</td>
			<td>6965</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">129S2SV</td>
			<td style="width:93px;">Charles River</td>
			<td>129</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into trophoblast stem cells

Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.

Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (...

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Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

protocol-for-direct-conversion-murine-embryonic-fibroblasts-into

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K Aufrufe.  Institute of Pathology, University of Bonn Medical School. Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Serie: Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is that the reprogramming of somatic cells to produce human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) avoids the ethical and legislative issues related to the use of human embryonic stem cells (hESCs). HiPSCs can be expanded and efficiently differentiated into different types of neuronal and glial cells, serving as test systems for toxicity testing and, in particular, for the assessment of different pathways involved in neurotoxicity. This work describes a protocol for the differentiation of hiPSCs into mixed cultures of neuronal and glial cells. The signaling pathways that are regulated and/or activated by neuronal differentiation are defined. This information is critical to the application of the cell model to the new toxicity testing paradigm, in which chemicals are assessed based on their ability to perturb biological pathways. As a proof of concept, rotenone, an inhibitor of mitochondrial respiratory complex I, was used to assess the activation of the Nrf2 signaling pathway, a key regulator of the antioxidant-response-element-(ARE)-driven cellular defense mechanism against oxidative stress.

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are considered a powerful tool for drug and chemical screening and for the development of new in vitro models for toxicity testing, including neurotoxicity. Here, a detailed protocol for the differentiation of hiPSCs into neurons and glia is described.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...