Die Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie ist eine statistische Methode, die die Zeitergebnisfluoreszenz verwendet, um die dynamische Signatur von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in lebenden Zellen zu lokalisieren. Hier interessieren wir uns besonders für beta-2 adrenerge Rezeptoren. Sphingolipidrezeptoren liefern hauptsächlich Informationen über die translationale Diffusionsdynamik und mit Hilfe der Fluoreszenzanisotropie auch über die Rotationsdiffusion.
Durch die Einführung eines zusätzlichen Etiketts können wir auch Bindungs- oder sogar Konformationsänderungen fördern, wenn wir die Resonanzenergieübertragung zwischen den untersuchten Etiketten fördern. Die quantitative zeitaufgelöste Fluoreszenz erfordert eine sorgfältige Ausrichtung der Aufbau- und Kalibrierungsmessungen. In den folgenden Minuten werden wir einen experimentellen Leitfaden für die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie von Lebenszellen, die Kreuzkorrelationsspektroskopie und den Forster-Resonanzenergietransfer von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren unter Verwendung klonfähiger Tags und synthetischer Flusskraft bereitstellen.
Zellsitzen und Transfixieren müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Legen Sie eine saubere Deckblatt-Langhantel auf eine Sechs-Well-Kulturplatte und waschen Sie sie mit steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung ab, fügen Sie zwei ml Zellkulturmedium mit Phenolrot hinzu, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 Mikrogramm pro Aminpenicillin und 100 Mikrogramm pro ml Streptomycin zu jeder Vertiefung und halten Sie es beiseite. Nehmen Sie die CHO-Zellen, die im selben Medium mit Phenolrot bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent CO2 kultiviert werden, und waschen Sie sie mit fünf ml PBS, um die toten Zellen zu entfernen.
Fügen Sie zwei ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die Datenzellen mit acht ml Medium mit Phenolrot und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer und setzen Sie die Zellen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Vertiefung in die sechs Vertiefungskulturplatte, die den Deckschlupf enthält.
Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem Inkubator wachsen, um eine Konfluenz von ungefähr 80% zu erreichen. Verdünnen Sie zwei Mikrogramm der gewünschten Vektor-DNA. Zum Beispiel CT SNAP oder NT SNAP und sechs Mikroliter dieses Transfektionsreagenzes in zwei separate Röhrchen.
Jeder enthielt 500 Mikroliter reduziertes Serummedium für jede Vertiefung und inkubierte sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Mischen Sie die beiden Lösungen miteinander, um die Transfektionsmischung zu erhalten, und inkubieren Sie sie für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie in der Zwischenzeit die sitzenden CHO-Zellen einmalig mit sterilem PBS.
Ersetzen Sie das PBS durch ein ml pro Vertiefung phenolrotfreies Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und ohne Antibiotika. Fügen Sie die gesamte Konstruktionsmischung von einem ml Tropfenweise zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad in fünf Prozent CO2. Zur Markierung verdünnen Sie das geeignete SNAP-Substrat in einem ml Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum ergänzt wird, um eine Endkonzentration von einem Mikromolaren zu erhalten.
Waschen Sie die transfizierten Zellen einmal mit PBS und fügen Sie eine ml pro Vertiefung einer mikromolaren SNAP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei 37 Grad in fünf Prozent CO2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit phenolrotfreiem Medium und fügen Sie zwei ml pro Well phenolrotfreies Medium hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in fünf Prozent CO2. Übertragen Sie den Abdeckschein aller Proben anschließend in die Bildgebungskammer und waschen Sie ihn mit 500 Mikroliter Bildgebungspuffer. Fügen Sie 500 Mikroliter Imaging-Puffer hinzu, bevor Sie zum FRED FCS-Setup wechseln.
Das FRED FCS-Setup ist mit einem konfokalen Mikroskopie-Wasserobjektiv, zwei Laserlinien, einem Zeitquilter-Einzelauslandszählsystem, zwei Hybrid-BMTs und zwei Aktien für die Photonensammlung und die Datenerfassungssoftware ausgestattet. Es ist sehr wichtig, den Aufbau jedes Mal vor der Messung in lebenden Zellen auszurichten. Um Fokus, Loch und Farbposition einzustellen, legen Sie zwei nanomolar grüne Kalibrierlösungen auf einen Glasabdeckungsschein und schalten Sie den 485-Nanometer- und 560-Nanometer-Laser ein, der in Stapeln, interleaved-Anregung oder PI-Modus betrieben wird.
Konzentrieren Sie sich auf die Lösung und stellen Sie die Loch- und Kragenringposition so ein, dass die höchste Zählrate und das kleinste konfokale Volumen erhalten werden, um die maximale molekulare Helligkeit zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die roten Kanäle mit 10 nanomolaren roten Kalibrierlösungen und einer Mischung aus beidem. Legen Sie 10 nanomolare DNA-Lösung auf glasbedeckten Zettel und stellen Sie den Fokus des Lochlochs und die Position des Kragenrings so ein, dass die Kreuzfarben zwischen den grünen und roten Detektionskanälen am höchsten sind.
Das ist die Quelle der höchsten Amplitude. Für Messungen in lebenden Zellen finden Sie eine geeignete Zelle, indem Sie mit der Markerlampe limitieren und durch das Okular beobachten. Schalten Sie beide Laser im PI-Modus ein und fokussieren Sie sich auf die Membran, indem Sie nach den maximalen Anzahlen pro Sekunde suchen.
Bitte beachten Sie, dass die Laserleistung für die Zellproben möglicherweise reduziert werden muss. Vorzugsweise weniger als fünf Mikrowatt am Ziel. Dies hängt stark von der verwendeten Blume und dem Setup ab.
Beobachten Sie die Auto- und Cross-Coll-Kurven der an EGP- und Snap-Tag-Sonden gebundenen Beta-2 AR in der Online-Vorschau der Datenerfassungssoftware und sammeln Sie mehrere Sortiermessungen mit einer Erfassungszeit zwischen 60 und 180 Sekunden. Exportieren Sie den Korrelationsverlauf und den Kontrast aus allen Messungen. Bitte achten Sie hier darauf, die Zeitfenster für Eingabeaufforderung und Verzögerung korrekt zu definieren und verwenden Sie eine Mikrozeiterfassungsoption in der Datenkorrelationssoftware.
Insgesamt sind drei verschiedene Korrelationen erforderlich. Automatische Korrelation des Zeitfensters für die Eingabeaufforderung des grünen Kanals. Automatische Korrelation der roten Kanäle und des Verzögerungszeitfensters.
Und schließlich war die Kreuzkorrelation des grünen Kanalsignals und des Eingabeaufforderungszeitfensters das rote Kanalsignal im Verzögerungszeitfenster. Hier sind die Autokorrelationsfunktionen des grünen und roten FRED für Lösungen und passen Sie sie an ein 3-DT-Diffusionsmodell mit einem zusätzlichen Triplettterm an, der erforderlich ist, um die Form und Größe des konfokalen Detektionsvolumens für die beiden Verwendeten Farbkanäle zu kalibrieren, wobei B die Basislinie der Kurve und die Anzahl der Moleküle und des Fokus ist. TD die Diffusionszeit und S, die Null über Omega Null, der Formfaktor des konfokalen Volumenelements. Die Triplett-Blink- und Fotophysik wird als Amplituden-AR und Relaxationszeit TR beschrieben. Verwenden Sie den bekannten Diffusionskoeffizienten für die grünen und roten Kalibrierungsmerkmale und erhalten Sie Formfaktoren, um die Abmessungen und das Volumen des infektiösen konfokalen Volumenelements zu bestimmen.
Berechnen Sie das Spektrum wie IFR, das grüne Fluoreszenzsignal, das auf den Kanälen Nullen gesammelt wird, und zwei in den richtigen Detektionskanal, Kanal eins und drei, als Verhältnis der im Hintergrund gesammelten Signale. Bestimmen Sie die direkte Erwartung des Akzeptorflusses von Daten durch die Donoranregungswellenlängen durch das Verhältnis des hintergrunderzogenen Kontrasts der roten Kalibriermessungen und der prompten Zeitfensteranregung durch grünen Laser zum Hintergrund korrekte Darstellung direkt in der Verzögerungszeitfensteranregung durch roten Laser. Berechnen Sie die molekulare Helligkeit von B sowohl die grüne als auch die rote Strömungskraft basierend auf dem Hintergrund des gesammelten Kontrastes, und um die Anzahl der Moleküle zu erhalten und sich auf die 3 DT-Diffusionsanpassung zu konzentrieren.
Passen Sie sowohl Ultrakorrelationen aus dem grünen und roten Kanal als auch über die Korrelation von der grünen Eingabeaufforderung und der roten Verzögerung der Doppelebenen-DNA an das 3-DT-Diffusionsmodell an, um die erhaltenen Formfaktoren für die Autokorrelationsfunktionen konstant zu halten. Der Formfaktor für die Kreuzkorrelationsfunktionen liegt normalerweise zwischen diesen beiden Werten. Bestimmen Sie die Amplitude bei Null Korrelationszeit basierend auf den Schriftwerten der scheinbaren Anzahl von Molekülen und Fokus.
Berechnen Sie das Amplitudenverhältnis für eine Probe war eine 100% Co-Diffusion von grüner und roter Bodenkraft. Passen Sie die Zellproben an ein geeignetes Modell an. Wie sie gezeigt werden, dass die Membranrezeptordiffusion nicht bimodal ist, war eine kurze, keine lange Diffusionszeit.
Zusätzlich müssen die Fotophysik und das Ausblinzeln der Bodenkraft berücksichtigt werden. Hier zu TD1 und TD2, sind die beiden für Diffusionszeiten erforderlich. Und eine ist ein Bruchteil der ersten Diffusionszeit Im Gegensatz zur Kalibrierungsmessung, bei der die freie Würfel- und DNA-Strangdiffusion in alle Richtungen, Membranrezeptoren nur 2D-Diffusion entlang der Zellmembranen zeigen, berechnen die Konzentration von Grün- oder Rotmarkierungsproteinen unter Berücksichtigung der Anzahl der Moleküle und des Fokus.
Und das Volumen des konfokalen Volumenelements unter Verwendung der Biasing-Masse. Passen Sie die beiden Alt-Korrelationen der doppelt markierten Stichprobe mit dem gleichen Modell wie für das einstufige Konstrukt und die Kreuzkorrelationsfunktion mit einem bimodalen Diffusionsmodell an, Hinweis für eine globale Beschreibung des Systems. Alle drei Kulturen müssen zusammen fit sein.
Der Diffusionsterm ist für alle drei Kulturen identisch. Und der einzige Unterschied ist eine Reputationszeit fällt, die Kreuzkorrelationsfunktion. Berechnen Sie die Konzentration von grünen oder roten Arbeitsproteinen aus der jeweiligen Anzahl von Molekülen und Fokus und dem Volumen des konfokalen Volumenelements.
Schätzen Sie den Anteil oder die Konzentration von interagierenden Grün- und Rotmarkierungsproteinen aus den Zellproben unter Verwendung der aus den DNA-Proben erhaltenen Korrekturfaktoren, der Amplitudenverhältnisse der Zellprobe und der jeweils erhaltenen Konzentrationen. Passen Sie die beiden Alterkorrelationen der FRED-Probe als einzelne markierte Proben und die vordere Kreuzkorrelation zu einem bimodalen Diffusionsmodell an, das einen Antikorrelationsterm enthält, wobei AF die Amplitude der gesamten Antikorrelation und AR und TR die jeweilige Amplitude und Relaxationszeit widerspiegelt. Im Falle von antikorrelierten Fluoreszenzänderungen aufgrund von FRED können ein oder mehrere Antikorrelationsterme erforderlich sein, was zu einem Rückgang der Fred-Kreuzkorrelationsfunktion bei niedrigen Korrelationszeiten führte, die mit einem Anstieg der beiden Autokorrelationsfunktionen zusammenfielen.
Die Kalibrierungsmessungen der grünen und roten Blütenlösungen zur Rasur von Faktoren von 6,5 und den grünen Kanälen und 6,8 in den roten Kanälen. So hat das konfokale Volumen die Größe von 1,4 und 1,9 Femto später an diesem Messtag, die Molekülhelligkeit liegt bei 12,5 Kilohertz pro Molekül und 2,6 Kilohertz pro Molekül. Wir haben 15% des Übersprechens von der grünen Blütenpracht für in die roten Kanäle nach der Spendererregung und 38% der direkten außer Anregung der roten Blütenform durch die grüne, aus unserer DNA-Messung bestimmen wir die Korrekturfaktoren für das konfokale Überlappungsvolumen auf 0,6 und 0,7 auch, die mit einem einzigen Markierungskonstrukt transfizierten Zellen zeigen eine bimodale zweidimensionale Diffusion auf der Zellmembran, wo etwa die Hälfte der Moleküle langsam auf diffundiert die Zeitskala von 50 bis hundert Millisekunden und die andere Hälfte relativ schnell um zwei Millisekunden in beiden Konstrukten.
Zusätzlich ist Triplet-Blinken vorhanden. Im Red-Level-Snap-Konstrukt wird jedoch eine weitere Relaxationszeit bei 180 Mikrosekunden erfasst, die von Unbound Snap Straight herrühren könnte. Von der Doppelmarkierung selbst, die mit dem Anti-Snap-Konstrukt durchtrennt wurde, bei dem die beiden Markierungen auf zwei verschiedenen Seiten der Zellmembran zwei weniger Messungen durchgeführt wurden, wurden das Rauschen und die rote Schicht auf Korrelation gesammelt.
Und die PI-Kreuzkorrelation ist hier ziemlich hoch. Hier sind 70% der Moleküle, wenn man langsam unter einer Zeitskala von hundert Millisekunden und nur 30% schnell um eine Millisekunde ist, ist der Anteil der doppelt freisetzenden Moleküle gering und liegt zwischen 15 und 25%Die Daten für den CT-Snap sehen besser aus und es ist weniger laut. Die erwartete vordere tiefste Antikorrelation kann jedoch nicht gesehen werden und ist höchstwahrscheinlich massereich durch die hohe Menge an Übersprechen, direkte Akzeptanzerregung und Triplett-Blinken beider Blütenkraft, und sobald Datenanalyseschemata die gesammelte Fluoreszenzintensität DKS nutzen, könnten helfen, dies zu retten, wie für den simulierten Datensatz gezeigt.
Der Vorteil der Fred FCS-Technik besteht darin, dass wir neben der Mobilität auch die Konferenzdynamik von GPCRs untersuchen können. Die Durchführung von FRED-FCs in Laboren ist jedoch eine Herausforderung und erfordert gute transfizierte Zellen, eine effiziente Markierung und einen perfekt kalibrierten Aufbau. Nur ein FRED-Paar Pro Force ist auch sehr wichtig.
Kritische experimentelle Schritte umfassen die Optimierung der Transfektionsoptimierung, die Minimierung des Hintergrunds und die Autofluoreszenz. Darüber hinaus wird die Atoms-Analyse-Pipeline dazu beitragen, die verschiedenen Dynamiken von Präzeptoren in lebenden Zellen zu verstehen. Wir hoffen, dass dieses Protokoll nützlich sein wird, um den FRED FCS-Ansatz in lebenden Zellexperimenten durchzuführen.
