Unsere Methode hilft, die Kinetik einer Proteinkomplexbildung zu untersuchen. Es beschreibt, wie eng ein Proteinkomplex ist und ob die Proteinkomplexbildung durch andere Proteine gestört wird. Diese Technik ermöglicht die quantitative Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion mit Hilfe der Fluoreszenz als Reporter, unser Assay kann die Assoziation und Disassoziation eines Proteinkomplexes in Echtzeit überwachen.
Entwerfen Sie zunächst den FRET-Assay, beginnend mit den Daten für den COL1 CAND1-Komplex aus der Proteindatenbank. Laden Sie die Struktur in PyMOL, und gehen Sie dann zum Assistentenmenü und verwenden Sie die Messfunktion, um den Abstand zwischen der ersten Aminosäure von CAND1 und der letzten Aminosäure von COL1 abzuschätzen. Laden Sie dann den Online-Spektrenbetrachter und sehen Sie sich die Anregungs- und Emissionsspektren von 7-Amino-4-Methylcoumarin und FlASH gleichzeitig an.
AMC ist der FRET Spender und FlASH der FRET-Akzeptor. Bereiten Sie Zellen mit dem FRET-Spenderprotein vor, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen. Reinigen Sie dann den COL1-Sortase-RBX1-Komplex, indem Sie zunächst 50 Milliliter Lysepuffer zu einem Pellet von E.Coli-Zellen hinzufügen, das den COL1-Sortase-RBX1-Komplex exient.
Eis die Zellen auf Eis mit Beschallung bei 50%Amplitude. Wechseln Sie die Stromversorgung für drei Minuten, so dass es eine Sekunde auf, und dann eine Sekunde aus, um eine Überhitzung der Probe zu verhindern. Übertragen Sie das resultierende Zelllysat in ein 50 Milliliter Zentrifugationsrohr und entfernen Sie den Zellabfall durch Zentrifugation bei 25.000 mal g für 45 Minuten.
Dann fügen Sie den Überstand zu fünf Milliliter Glutathionperlen hinzu und bebrüten sie bei vier Grad Celsius, um das Zelllysat zu löschen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Perlenlysatmischung bei 1, 500 mal g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand.
Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 5 Milliliter Lysepuffer ohne Protease-Hemmer. Nach dem Zentrifugieren der Lösung den Überstand entfernen. Fügen Sie nun drei Milliliter Lysepuffer in die gewaschenen Perlen und übertragen Sie die Perlenschlämme in eine leere Säule.
Fügen Sie der neuen Spalte auch fünf Milliliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Spalte dann für 10 Minuten und sammeln Sie das Eluat. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Thrombin bei fünf Milligramm pro Milliliter aus den Glutathionperlen zum Eluat hinzu. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius verdünnen Sie die Proteinprobe dreifach mit Puffer A.Laden Sie die Proteinprobe in einen Puffer Eine gleichimdigerische kationische Austauschchromatographie-Spalte bei null Punkt fünf Milliliter pro Minute.
Fügen Sie dann einen Gradienten von Null zu 50 % des Puffers B in Puffer A hinzu, um das Protein mit einer Durchflussrate von 1 Milliliter pro Minute zu löschen. Als nächstes die Eluatfraktionen, die das FRET-Spenderprotein enthalten, zu bündeln und auf zwei Punkt-Fünfmilliliter mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem 30-Kilodalton-Cutoff zu konzentrieren. Fügen Sie nun 7-Amino-4-Methylcoumarin in den c-terminus von COL1 durch sortase vermittelte Transpeptidation hinzu, indem Sie zuerst den Puffer in der FRET-Spenderproteinprobe mithilfe einer Entsalzungssäule in den Sortase-Puffer ändern.
Um dies zu erreichen, gleichen Sie zunächst eine Entsalzungsspalte mit 25 Millilitern Saähnenpuffer aus. Dann zwei Punkt fünf Milliliter der FRET-Spenderproteinlösung in die Säule laden und den Durchfluss entsorgen. Als nächstes, elute die Probe mit drei Punkt fünf Milliliter Sortase Puffer und sammeln den Fluss durch.
In 900 Mikroliter des Eluats, fügen Sie 100 Mikroliter 600 Mikromolar gereinigte Sortase A Lösung und 10 Mikroliter eines 25 Millimolar GGGG-AMC Peptid. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 30 Grad Celsius im Dunkeln über Nacht, um COL1-AMC-RBX1 zu erzeugen. Laden Sie nun die gesamte Probe auf die Spalte "Größenausschlusschromatographie" und legen Sie sie mit einem Punkt fünfmal dem Spaltenvolumen des Puffers zu.
Am Ende die Eluatfraktionen, die COL1-AMC-RBX1 enthalten, bündeln. Folgen Sie dem Textprotokoll, um das FRET-Akzeptorprotein vorzubereiten. Viele der Schritte ähneln der FRET-Spenderproteinzubereitung.
Nach der Fertigstellung bereiten Sie die FlASH CAND1-Lösung vor. Fügen Sie zunächst einen Mikroliter der FlASH-Lösung zu 50 Mikrolitern der frisch zubereiteten Tetracys-CAND1-Lösung hinzu. Mischen Sie die kombinierten Lösungen gut und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur im Dunkeln für ein bis zwei Stunden, um die FlASH CAND1 Lösung zu bilden.
In 300 Mikroliter FRET-Puffer, fügen Sie COL1-AMC-RBX1 zu einer Endkonzentration von 70 Nanomolar und übertragen Sie die Lösung in eine Küvette. Legen Sie die Küvette in den Probenhalter eines Fluorimeters. Reizen Sie die Probe mit 350 Nanometer Anregungslicht und scannen Sie die Emissionssignale von 400 bis 600 Nanometern in einem Nanometer-Schritten.
Dann, in 300 Mikroliter FRET Puffer, fügen Sie sowohl COL1-AMC-RBX1 und FlASH-CAND1 zu einer endgültigen Konzentration von 70 Nanomolar. Reizen Sie die Probe mit 350 Nanometer Anregungslicht und scannen Sie die Emissionssignale von 400-600 Nanometern in einem Nanometer-Schritten. Stellen Sie das Anregungslicht auf 350 Nanometer ein und verwenden Sie einen Bandpassfilter, der 450 Nanometer Emissionslicht passieren lässt und 500 bis 650 Nanometer Emissionslicht blockiert.
Verbinden Sie mit den Probenventilen an der Füllposition eine mit Wasser gefüllte Drei-Milliliter-Spritze. Dann waschen Sie die beiden Probenspritzen mit Wasser, indem Sie die Probenspritze mehrmals nach oben und unten bewegen und das Wasser nach Fertigstellung entsorgen. Schließen Sie als Nächstes eine mit FRET-Puffer gefüllte Drei-Milliliter-Spritze an.
Waschen Sie die beiden Probenspritzen mit dem FRET-Puffer, indem Sie den Probenspritzenantrieb mehrmals nach oben und unten bewegen und das Wasser nach Fertigstellung entsorgen. Schließen Sie nun eine Drei-Milliliter-Spritze an und laden Sie die erste Probenspritze, Spritze A, mit 100 Nanomolar COL1-AMC-RBX1 in den FRET-Puffer. Dann drehen Sie das Probenventil in die Antriebsposition Auch eine Drei-Milliliter-Spritze an Spritze B anschließen und Spritze B mit 100 Nanomolar flASH CAND1 in den FRET-Puffer laden und das Ventil in die Antriebsposition drehen.
Öffnen Sie das in der Software unter Acquire befindliche Bedienfeld und zeichnen Sie die Emission von COL1-AMC im Laufe von 60 Sekunden auf. Dann machen Sie einen einzigen Schuss. Passen Sie die Abnahme und die fluoreszierenden Signale, die im Laufe der Zeit von jedem Schuss auf eine einzelne exponentielle Kurve gemessen werden.
Waschen Sie das System wie bisher gezeigt und fügen Sie dann eine Lösung von 100 Nanomolar COL1-AMC-RBX1 und 100 Nanomolar FlASH CAND1 im FRET-Puffer in die Spritze A.Connect it to the system, while it is in the fill position Load syringe A and then turn the sample valve to the drive position. Als nächstes laden Sie eine Lösung von Skp1-Skp2 in die Spritze B.Connect it to the system while it is in the fill position. Tragen Sie Spritze B und drehen Sie die Probe dann in die Antriebsposition.
Gehen Sie in der Software, um das Bedienfeld zu erwerben und zu öffnen. Richten Sie das Programm ein, um die Emission von COL1-AMC über 30 Sekunden aufzuzeichnen. Dann machen Sie einen einzigen Schuss.
Die Fluoreszenzsignale nehmen im Laufe der Zeit zu, nachdem Mischlösungen aus Spritze A und Spritze B. nach dem Mischen von Lösungen aus Spritze A und Spritze B. zugenommen haben. Als jeweils 70 Nanomolar von COL1-AMC und FlASH CAND1 gemischt wurden, um FRET zu erzeugen, waren zwei Emissionsspitzen in den Emissionsspektren vorhanden. Und der Gipfel von COL1-AMC wurde niedriger, und der Gipfel von FlASH CAND1 wurde höher. Wenn die volle Länge CAND1 für FRET verwendet wurde, zeigte der Spender-Peak eine 10%ige Verringerung der Intensität.
Als jedoch CAND1 mit seiner ersten Helix abgeschnitten verwendet wurde, wurde die Reduktion der Spenderspitzenintensität auf 30% erhöht, was auf eine höhere FRET-Effizienz hindeutet, um zu bestätigen, dass die Signaländerungen durch FRET zwischen COL1-AMC und FlASH CAND1 resultierten, wurde der Spender FRET mit überschüssigem, nicht gekennzeichnetem CAND1 gemischt, der als Chase im Akzeptor bekannt ist. In der Folge wurde der Spendergipfel vollständig wiederhergestellt und der Akzeptanz-Peak verringert. Hier ist ein Diagramm des durchschnittlichen beobachteten K-Wertes mit der CAND1-Konzentration nach linearer Regressionsanalyse dargestellt.
Zur Messung der Onkonstante des Komplexes wurde 50 Nanomolar COL1-AMC in einer Reihe von beobachteten Dissoziationsratenkonstanten gemessen, die durch Mischen von 50 Nanomolar COL1-AMC mit zunehmenden Konzentrationen von FlASH CAND1 gemessen wurden. Ähnlich wie bei der Messung der On-Konstante wurde die beobachtete Dissoziationskonstante von COL1 und CAND1 durch die Überwachung der Wiederherstellung des Spendersignals im Laufe der Zeit auf dem gestoppten Durchfluss-Fluorometer gefunden. Hier stieg das Spendersignal schnell an und es ergab einen beobachteten K-Wert von null Punkt vier pro Sekunde.
Im Gegensatz dazu wurde beim Puffer zu dem vormontierten Komplex keine Signalerhöhung beobachtet, die darauf hindeutet, dass die schnelle Dissoziation von COL1 CAND1 durch Skp1 Skp2 ausgelöst wurde. Stellen Sie sicher, dass die Lichtmenge, der spender- und Akzeptorproteine ausgesetzt sind, minimiert wird. Versuchen Sie, Fluorophore so weit wie möglich im Dunkeln zu halten.
