Die Protein-Protein-Wechselwirkung bei der Transkription wurde traditionell mit Por-Dialyse untersucht. Die Por-Dialyse ist jedoch rein quantitativ. Wir verwenden Biolayer-Interferometrie, oder BLI, um dieses Problem zu überwinden.
Im Vergleich zu Por dan erkennt BLI Echtzeit-Assoziationen und Dissoziationen zwischen Bindungspartnern. Es erzeugt auch quantitative kinetische Parameter, die auf Interaktionsmechanismen hinweisen. BLI-Technologie mag einschüchternd klingen, aber es ist nicht schwer zu lernen, um diese Technologie zu verwenden, muss man den Zugriff auf ein BLI-Instrument und die zugehörige Software haben.
Mit diesem Video können Sie sich einfach an die BLI-Technologie anpassen. Etwa 10 Minuten vor Beginn eines Assays, Pipette 200 Mikroliter des BLI-Puffers in ein PCR-Rohr. Entfernen Sie einen Nickel-NTA-Biosensor aus der Originalverpackung, indem Sie den breiten Teil des Biosensors mit einer handgeliebten Hand halten.
Legen Sie den Biosensor über das PCR-Rohr, so dass nur die Glasspitze des Biosensors in den BLI-Puffer eingetaucht ist. Halten Sie die Biosensorspitze mindestens 10 Minuten unter Wasser, um eine vollständige Hydratation zu gewährleisten. Schalten Sie die Blitz-Maschine ein.
Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgangsanschluss auf der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist. Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software und klicken Sie auf Advanced Kinetics auf der linken Seite des Bildschirms. Geben Sie in der Software alle entsprechenden Informationen über das Experiment unter den jeweiligen Überschriften ein.
Klicken Sie auf Biosensor Type und wählen Sie Nickel NTA aus dem Dropdown-Menü. Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von der Standardeinstellung geändert werden. Für optimale Ergebnisse mindestens 30 Sekunden für die Ausgangs- und Ausgangsbasislinie und 120 Sekunden für Die Zuordnung und Dissoziation verwenden.
Entfernen Sie den hydratisierten Nickel-NTA-Biosensor aus dem PCR-Rohr und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben. Legen Sie ein 0,5 Milliliter schwarzes Mikrozentrifugenrohr in den Rohrhalter der Maschine und Pipette 400 Mikroliter BLI-Puffer hinein. Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenrohr eingetaucht wird.
Klicken Sie auf Weiter in der Software, um mit der Aufzeichnung der ursprünglichen Baseline zu beginnen. Nachdem der erste Basisschritt die Aufzeichnung abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine. Bewegen Sie den Schieberegler nach rechts, so dass sich der Fallhalter vor dem schwarzen Pfeil befindet.
Pipette vier Mikroliter eines dialyzierten Zintands mit Tindel auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch mit der Aufzeichnung des Ladeschritts beginnt. Nachdem der Ladeschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine. Bewegen Sie den Schieberegler nach links, so dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Rohres im Rohrhalter eingetaucht ist. Die Maschine und die Software beginnen automatisch mit der Aufzeichnung des Basisschritts. Nachdem der Basisschritt die Aufzeichnung abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie ein Protein auspfeifen und insgesamt fünfmal mit doppelt entionisiertem Wasser ausspülen. Verwenden Sie ein Tuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach der letzten Wäsche zu reinigen. Ersetzen Sie den Fallhalter wieder auf die Maschine.
Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine nach rechts, so dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet. Pipette vier Mikroliter eines Dialyzanels analyt auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch die Aufzeichnung der Assoziation Schritt beginnt. Nachdem der Assoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine nach rechts, so dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet, und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch mit der Aufzeichnung des Dissoziationsschritts beginnt. Nachdem der Dissoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine und entfernen Sie den Fallhalter und den Rohrhalter. Spülen Sie beide mit doppelt entionisiertem Wasser gründlich ab, um jedes Protein wegzuwaschen.
Entfernen Sie den Biosensor und entsorgen Sie ihn sicher. Wiederholen Sie diese Schritte für dasselbe Ligand-Analytpaar mit unterschiedlichen Analytkonzentrationen. Sobald alle Durchläufe abgeschlossen sind, speichern Sie die Daten auf der Software, indem Sie auf Datei und Experiment speichern wie auf der linken Seite des Bildschirms klicken.
Wählen Sie unter der Überschrift Daten ausführen die Option Schrittkorrektur und Eins-zu-Eins aus, und klicken Sie auf Analysieren, um kinetische Daten zu generieren. Um die quantitativen Daten in ein Arbeitsblatt zu extrahieren und Diagramme zu generieren, klicken Sie auf In CSV exportieren und speichern Sie die aufgezeichneten Daten als CSV-Datei. Öffnen Sie die CSV-Datei mit einer Tabellenkalkulationssoftware.
GrgA in voller Länge besteht aus 288 Aminosäuren. Wie hier gezeigt, bindet ein 28 Aminosäure-Mittelbereich Sigma 28 direkt. Hier wurde der mittlere Bereich mit einem Endterminal His-Tag als Liganden verwendet, der zuerst bis zur Spitze eines Nickel-NTA-Biosensors immobilisiert wurde.
Gezeigt werden Aufnahmen von Experimenten mit drei verschiedenen Analytkonzentrationen, die jeweils 30 Sekunden vor der Ligandenbindung beginnen und zwei Minuten nach Beginn der letzten Wäsche enden. Die verbesserte Visualisierung der Liganand-Analytenzuordnung und -dissoziation wird nach dem Entfernen von Werten in den ersten beiden Phasen und dem Zurücksetzen der Basislinie angezeigt. Nach dem Waschen ungebunden und terminal Seine-getaggt GrgA 138 bis 165 aus dem Biosensor, Echtzeit-Assoziation mit dem Analyten wurde nach dem Zusatz von Sigma 28 aufgezeichnet.
Schließlich wurde die Echtzeit-Dissoziation nach dem Waschen aufgezeichnet. Vor BLI-Assays wird Glycerin aus Liganden und Analyten entfernt. Wir empfehlen, dass BLI kurz nach der Dialyse durchgeführt wird, wie im Text beschrieben.
Nach der Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription mit BLI kann man untersuchen, wie sich die Interaktion auf die Transkriptionsinitiierung, Dehnung und Beendigung auswirkt.
