Dieses Protokoll ermöglicht die wiederholbare Verwendung der intakten extrazellulären Lungenmatrix als dreidimensionales Gewebekultursubstrat und moderaten Durchsatz. Der Hauptvorteil des technischen Lungengewebesystems ist die Flexibilität der Plattform. ELTs können angepasst werden, um verschiedene Gewebegerüste, Zellen oder Kulturmedien von Interesse zu verwenden.
Sobald die Lunge extrahiert ist, füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit Agarose und HBSS ohne Phenolrot. Blähen Sie die Lunge mit ca. 10 Millilitern Luft über die Luftröhrenkanüle auf und injizieren Sie dann sofort die vorbereitete Agarose über die Luftröhrenkanüle, bis die distalen Spitzen der Lungenlappen aufgeblasen sind. Verschließen Sie die Luftröhre, indem Sie die weiße Kappe eines Vier-Wege-Absperrhahns an der weiblichen Luer-Sperre der Trachealkanüle befestigen.
Die Lunge in eine 150 Millimeter große Petrischale auf Eis legen, damit sich die Agarose verfestigen kann. Bereiten Sie die Lungenscheiben gemäß dem Protokoll im Manuskript vor und füllen Sie dann eine 100-Millimeter-Petrischale mit 1/3 Volumen PBS. Übertragen Sie Kassetten und Tabs mit einer Pinzette auf die Schüssel.
Wenn die Scheiben gefroren sind, tauen Sie ein Gericht nach dem anderen auf, indem Sie PBS bei Raumtemperatur gießen. Anschließend eine aufgetaute Scheibe in eine 150-Millimeter-Petrischale geben. Entfalten Sie die Scheibe vorsichtig mit einer feinen Pinzette oder einer Hämostat und saugen Sie vorsichtig überschüssiges PBS aus dem Gewebe ab.
Schneiden Sie dann einen drei Millimeter breiten, mindestens neun Millimeter langen Streifen aus der Scheibe, indem Sie die gesamte Länge einer Rasierklinge fest gegen die Schale drücken und sie leicht von einer Seite zur anderen schaukeln. Um den Gewebestreifen in die Kassette zu klemmen, schweben Sie ihn über die Kassette und zentrieren Sie ihn vorsichtig, um über die Löcher in den Clips an beiden Enden hinauszugehen. Platzieren Sie eine Lasche teilweise in das Loch an einem Ende mit einer feinen Pinzette, richten Sie das Gewebe vorsichtig auf und setzen Sie die zweite Lasche ein.
Verwenden Sie schließlich eine Pinzette, um jede Lasche vollständig zu drücken, um das Gewebe zu sichern. Nachdem Sie alle Seiten beschnitten haben, geben Sie die 100-Millimeter-Schale mit den Kassetten auf eine laminare Haube. Übertragen Sie Kassetten auf Platten mit sechs Vertiefungen, die die erste Dezellularisierungslösung enthalten, indem Sie einen gekrümmten Hämostat verwenden, um die gekerbten Seiten zu greifen.
Legen Sie dann die Sechs-Well-Platte bei 30 U / min für 10 Minuten auf einen Orbitalschüttler. Saugen Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie sie dann durch drei Milliliter der zweiten Dezellularisierungslösung pro Welle. Legen Sie die Platte bei 30 U / min auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie fünf Minuten lang.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jeder Lösung, wie im Dezellularisierungsprotokoll im Manuskript beschrieben. Nach der letzten Spülung mit PBS das Gewebe auf sterile Six-Well-Platten mit frischem PBS mit Antibiotika und Antimykotika übertragen und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Sterilisation mit Antibiotika und Antimykotika können Lungengewebegerüste sofort ausgesät oder bei vier Grad Celsius bis zu 30 Tage gelagert werden.
Inkubieren Sie vor der Verwendung für die Kultur Gerüste, die bei vier Grad Celsius gelagert werden, mit frischem PBS und Antibiotika und Antimykotika über Nacht bei 37 Grad Celsius als zusätzlichen Sterilisationsschritt. Dann spülen Sie die Gerüste mit sterilem PBS, fünf Milliliter pro Well, dreimal, für jeweils fünf Minuten. Untersuchen Sie Gerüste unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 5-facher Vergrößerung, um Gewebe für die Aussaat auszuwählen.
Bereiten Sie die Endothelzellsuspension in Endothelmedium bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter mit ausreichend Zellen vor, um 500.000 Endothelzellen pro Scheibe zu säen. Stellen Sie autoklavierte Aussaatbäder in 100-Millimeter-Petrischalen und geben Sie die Spülgerüste vorsichtig kopfüber in die Aussaatbäder. Schwenken Sie vorsichtig die vorbereitete Zellsuspension zum Mischen.
Dann pipettieren Sie vorsichtig 100 Mikroliter Zellen direkt auf jedes Gewebe an der Basis der Vertiefungen und achten Sie darauf, das Gewebe nicht mit der Pipettenspitze zu beschädigen. Übertragen Sie das ausgesäte Gewebe in den Zellkultur-Inkubator. Geben Sie 24 Stunden nach der Aussaat der Endothelzellen 900 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium mit einer manuellen Pipette in jede Vertiefung und bringen Sie die Platte dann in den Inkubator zurück.
Entfernen Sie nach 24 Stunden Zellaussaat das Medium und ersetzen Sie den einen Milliliter frisches Endothelmedium pro Well. 72 Stunden nach der Aussaat der Endothelzellen zählen Sie AEC2s oder alveoläre Epithel-Typ-II-Zellen und Fibroblasten mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine 1: 1-Zellsuspension in AEC2-Wachstumsmedium bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter vor. Das Medium aus jedem Aussaatbad gut pipettieren und die vorbereitete Zellsuspension vorsichtig schwenken.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellen direkt auf jedes Gewebe an der Basis des Brunnens. Übertragen Sie das ausgesäte Gewebe in den Zellkultur-Inkubator. Fügen Sie nach zwei Stunden 900 Mikroliter vorgewärmtes AEC2-Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung hinzu und bringen Sie die Platte dann in den Inkubator zurück.
Nach 24 Stunden Kultur mit AEC2s und Fibroblasten bereiten Sie eine 12-Well-Platte mit einem Milliliter vorgewärmtem AEC2-Wachstumsmedium pro Well, pro Kassette vor. Pipettieren Sie 800 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen des Aussaatbades, entfernen Sie dann die Kassetten aus dem Aussaatbad und geben Sie sie mit der rechten Seite auf die vorbereitete 12-Well-Platte, eine Kassette pro Well. Wechseln Sie das Kulturmedium sorgfältig mit einer Pasteur-Pipette aus Glas jeden zweiten Tag für die gewünschte Kulturdauer.
Überwachen Sie den Grad der Geweberepopulation mittels Phasenkontrastmikroskopie bei 5-facher Vergrößerung während der gesamten Kulturdauer. Die H- und E-Färbung von Gewebegerüsten zeigte nach der Dezellularisierung eine konservierte alveoläre Architektur ohne sichtbare Zellkerne. Alveolargewebe wurde beobachtet, als dezellularisierte extrazelluläre Matrixgerüste bei 5-facher Vergrößerung durch Phasenkontrastmikroskopie betrachtet wurden.
Große verzweigte Atemwege und Gefäße waren auch in einigen Scheiben sichtbar. Am siebten Tag der Kultur zeigte die Phasenkontrastmikroskopie, dass das Muster der Rezellularisierung in künstlich hergestellten Lungengeweben die alveoläre Struktur des Gewebes bei erfolgreicher Repopulation nachahmte. Eine schlechte Rezellularisierung war ebenfalls sichtbar.
H- und E-Färbungen am siebten oder achten Tag zeigten eine Wiederbesiedlung der Alveolarsepten. Die stehende Immunfluoreszenz zeigte Pro-Kollagen Typ I alpha 1-positive Fibroblasten, ABCA3-positive AEC2s, CD31-positive Endothelzellen und reichlich vorhandene SPB-positive AEC2s. Darüber hinaus zeigte der Thymidin-Assay viele proliferierende AEC2s.
Diese Technik hat die Entwicklung von Strategien für das Lungengewebe-Engineering erleichtert und Untersuchungen von Warteschlangen ermöglicht, die die Proliferation und Differenzierung von Typ-II-Zellen innerhalb der Alveole unterstützen.
