Unser Protokoll beschreibt das Design, den Aufbau und die Validierung von Genschaltkreis-basierten Diagnostika. Diese papierbasierte molekulare Diagnostik ist kostengünstig und empfindlich, da sie in der Lage ist, klinisch relevante Konzentrationen von Nukleinsäuren zu detektieren und kann so konzipiert werden, dass sie praktisch jede Sequenz detektieren. Dies ist eine Plattformtechnologie, die von Benutzern für ihre Bedürfnisse entworfen werden kann und das Potenzial hat, klinische Diagnostik in dezentralere zahnärztliche Ressourceneinstellungen zu bringen.
Der zellfreie Zehenhalteschaltersensor kann für praktisch jedes Nukleinsäure-basierte Ziel ausgelegt werden. Jüngste Arbeiten haben eine zellfreie Diagnostik für Ebola, Noroviren, SARS-CoV-2, C.difficile und Typhus-verursachende Bakterien gezeigt. Severino Jefferson Rivero da Silva, ein Postdoktorand, und Pouriya Bayat, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren.
Um den Zehenschalter zu entwerfen, identifizieren Sie die Zielsequenzen aus dem Zika-Virusgenom und wählen Sie die Zika-Virus-Zielsequenzen aus den Amplikons aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie das Zehenhalteschalter-Design-Softwarepaket herunter. Öffnen Sie MATLAB und navigieren Sie zum Ordner Designsoftware.
Geben Sie die Zielsequenzen in die CSV-Datei der Designeingabedatei ein, die sich im Unterordner input befindet. Wählen Sie die Parameter aus, die für die Konstruktionsfunktion verwendet werden sollen. Führen Sie die Designfunktion aus, um die Zehenschalterdesigns für die interessierenden Ziele zu generieren.
Navigieren Sie nach Abschluss zum Ordner final_designs und suchen Sie die Entwurfssequenzen des oberen Zehengriffschalters und die entsprechenden Zielsequenzen in Tabellenkalkulationen im CSV-Format. Stellen Sie sicher, dass die vom Algorithmus erzeugten Zehenschalter-DNA-Sequenzen die T7-Promotorsequenzen am fünf Hauptende und eine konservierte 21-Nukleotid-Linkersequenz am drei Hauptende enthalten. Verwenden Sie NCBI BLAST, um die Designsequenzen des oberen Zehengriffschalters gegen andere gängige Viren zu überprüfen, indem Sie nach Sequenzhomologie suchen.
Akzeptieren Sie Sequenzen mit weniger als 40%Hämologie. Bereiten Sie Lösungen der Zehenhalteschalter-Haarnadel-DNA-Oligos und umgekehrte Amplifikationsprimer in einer Konzentration von 10 Mikromolaren in nukleasefreiem Wasser vor. Reaktionen in PCR-Röhrchen auf Eis gemäß dieser Tabelle zusammenstellen.
Legen Sie die Reaktionsröhrchen gemäß den in dieser Tabelle aufgeführten Zyklusbedingungen in einen Thermocycler. Analysieren Sie die PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel. Reinigen Sie die PCR-Produkte und eluieren Sie die DNA in einem minimalen Volumen nukleasefreien Wassers, um eine ausreichend hohe Konzentration zu gewährleisten.
Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer. Bereiten Sie eine CPRG-Stammlösung vor, indem Sie 25 Milligramm des Pulvers in einem Milliliter nukleasefreiem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine Mastermischung auf Eis nach dem hier gezeigten Standardprotokoll vor.
Geben Sie die zellfreie Mastermischung in PCR-Röhrchen. Für zellfreie Kontrollen und Schalterkontrollen allein fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Volumen von 5,94 Mikrolitern hinzu. Und für die Reaktion fügen Sie PCR-gereinigte Zehenschalter-DNA hinzu, um eine Endkonzentration von 33 Nanomolaren zu erhalten.
Um die Zehengriff-Schalter- und Ziel-RNA-Kombination zu testen, fügen Sie in vitro transkribierte Ziel-RNA zu einer Endkonzentration von einem Mikromolaren hinzu. Mischen Sie alle Reaktionen gründlich durch Pipettieren und Zentrifugieren kurz. Auf einer schwarzen, klaren 384-Well-Platte 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Vertiefungen um die Reaktionsmulden geben.
Schneiden Sie dann mit einem Zwei-Millimeter-Biopsiestempel und einer Pinzette BSA-blockierte Filterpapierscheiben ab und legen Sie sie in die Reaktionsmulden. Dosieren Sie 1,8 Mikroliter aus jedem Reaktionsrohr dreifach auf die Filterpapierscheiben in der 384-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen PCR-Folie ab und legen Sie sie in einen Plattenleser.
Messen Sie die Absorption bei 570 Nanometern bei 37 Grad Celsius jede Minute für 130 Minuten. Bereiten Sie eine 25-Mikromol-Stammlösung aller Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets in nukleasefreiem Wasser vor. Richten Sie eine Fünf-Mikroliter-Reaktion mit der hier gezeigten Mastermischung ein.
Durch Pipettieren mischen, bis der weiße Niederschlag löslich ist, und dann in PCR-Röhrchen dosieren. Fügen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu den entsprechenden Röhrchen hinzu, gefolgt von einem Mikroliter entweder nukleasefreiem Wasser oder zwei Picomolar Zieltrigger-RNA. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen und die Röhrchen kurz herunterschleudern.
Richten Sie das Inkubationsprotokoll auf einem Thermocycler ein, wie hier gezeigt. Nach 12 Minuten die Röhrchen entfernen und 1,25 Mikroliter der Enzymmischung zu jedem Röhrchen hinzufügen, gefolgt von Mischen und Zentrifugieren. Bringen Sie die Röhrchen zum Thermocycler zurück, nachdem Sie den 41 Grad Celsius Halteschritt übersprungen haben, um die einstündige Reaktionsinkubation zu starten.
Um dann die Primerleistung zu bewerten, stellen Sie die papierbasierten zellfreien Zehenschalterreaktionen zusammen und analysieren Sie die Daten. Für die Sensitivitätsanalyse identifizieren Sie mögliche Primerpaare und bereiten serielle Verdünnungen der Ziel-RNA in nukleasefreiem Wasser vor. Wiederholen Sie die NASBA- und zellfreien Reaktionen mit den ausgewählten Primer-Sets in biologischen Triplikaten.
Führen Sie unter Verwendung eines Mikroliters extrahierter Patienten-RNA die NASBA-Amplifikation und papierbasierte zellfreie Reaktionen durch, wie in Abschnitt fünf gezeigt. Nach den Reaktionen bereiten Sie die 384-Well-Reaktionsplatte vor und führen den Assay in einem tragbaren Plattenleser bei 37 Grad Celsius durch. Anschließend werden die RT-qPCR-Komponenten zusammengebaut und die Reagenzien in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gemäß dieser Tabelle gegeben.
Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren. Geben Sie 6,5 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well- oder 384-Well-PCR-Platte, gefolgt von 3,5 Mikrolitern jeder RNA-Vorlage in dreifacher Ausfertigung. Legen Sie einen PCR-Film über die Oberseite der Platte.
Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 600 mal G für zwei Minuten. Legen Sie die Platte in ein RT-qPCR-Gerät und führen Sie die Zyklusbedingungen wie hier gezeigt durch. Nach dem rechnerischen Design wurden drei Zehenhalteschalter konstruiert und mittels Agarosegelelektrophorese analysiert.
Eine Bande um 3.000 Basenpaare zeigte eine erfolgreiche Reaktion an. Die Zehengriffschalter wurden anhand ihrer jeweiligen in vitro transkribierten Trigger-RNA bewertet. Während alle drei Sensoren eine erhöhte Absorption aufwiesen, hatte Sensor 27B die schnellste Einschaltrate, während die Schalter 33B und 47B ein niedrigeres Ein-/Aus-Verhältnis aufwiesen, was auf Hintergrundaktivität und reduzierte Spezifität hinweist.
Die Faltenänderung der Absorption bei 570 Nanometern zeigte, dass der Schalter 27B mit einem Ein-/Aus-Signalverhältnis die beste Leistung aufweist. Darüber hinaus kann es in Verbindung mit NASBA RNA in Konzentrationen von nur 124 Molekülen pro Mikroliter nachweisen, was auf eine hohe Empfindlichkeit hinweist. Zika-Virus-Patientenproben aus Brasilien wurden getestet, um die klinisch-diagnostische Genauigkeit der Sensoren mit einem tragbaren Plattenleser zu beurteilen.
Ein Farbwechsel von gelb zu violett identifizierte eine positive Probe. Die kolorimetrische Reaktion für jede papierbasierte Reaktion wurde im Laufe der Zeit von der integrierten Software auf dem tragbaren PLUM-Plattenleser aufgezeichnet. Die Proben, die den Schwellenwert überschritten, wurden als positiv eingestuft.
Die klinische Leistung des Sensors wurde im Vergleich zur RT-qPCR ermittelt. Die Proben wurden als positiv angesehen, wenn der Zyklusschwellenwert gleich oder kleiner als 38 war. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Ergebnisse von Zehenschalter-Bildschirmen und NASBA-Primer-Empfindlichkeit reproduzierbar und optimiert sind, bevor mit Patientenstudien fortgefahren wird.
Aufgrund ihrer Einfachheit und Anpassungsfähigkeit hat die hier beschriebene Diagnoseplattform den Weg für die Entwicklung neuer Point-of-Care-Instrumente geebnet, die dem Gesundheitssystem, insbesondere für Länder mit niedrigem Einkommen, Vorteile bringen können.
