PIB-MS ist eine neuartige Technik, die verwendet wird, um endogene Phosphorproteinphosphatasen anzureichern, und sie interagieren Proteine aus Zellen und Geweben. Es beinhaltet die Identifizierung und Quantifizierung dieser Proteine mittels massenspektrometriebasierter Proteomik. Diese Technik erfordert nicht die exogene Expression von markierten Versionen von Phosphorproteinphosphatasen, die die Proteinaktivität oder -lokalisation verändern könnten.
Es werden auch keine Antikörper verwendet, die möglicherweise unspezifisch sind oder nicht in der Lage sind, zwischen bestimmten Isoformen zu unterscheiden. Diese Methode zur Untersuchung des PPPM kann für den Einsatz an allen Zellen bis hin zu klinischen Proben skaliert werden. Sammeln Sie zunächst das Zellpellet durch Zentrifugation bei 277 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit fünf Millilitern PBS. Bereiten Sie den Lysepuffer wie im Textprotokoll beschrieben vor und halten Sie sich auf Eis. Geben Sie einen Milliliter gekühlten Lysepuffer zu den Proben, homogenisieren Sie dann die Proben durch Sonifikation und halten Sie die Zellen zwischen den Impulsen auf Eis.
Die Lysate in frische 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die beschallte Probe bei 21, 130 mal g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie ein Aliquot des Lysats, um die Gesamtproteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Assay zu quantifizieren.
Dieser Schritt ist wichtig, um die gleiche Proteinkonzentration in jeder Probe sicherzustellen. Für eine Phosphoproteinphosphatase-Inhibitor-Kontrolle bereiten Sie zwei Aliquots gleicher Proteinkonzentration für jede Probe vor. Lysepuffer kann verwendet werden, um die Proben zu verdünnen, so dass jedes Röhrchen die gleiche Proteinkonzentration hat.
Fügen Sie einen Mikromolar freies Microcystin-LR zu einem Aliquot und ein gleiches Volumen von DMSO zum anderen hinzu. Wirbeln Sie die Proben ein und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis. Die Herstellung der Phosphatase-Inhibitor-Kügelchen sollte im Voraus oder während der im Abschnitt zur Probenvorbereitung beschriebenen Inkubationsschritte erfolgen.
Verwenden Sie 10 Mikroliter feste Phosphatase-Inhibitor-Kügelchen oder PIB-Harz für ein Milligramm Protein und fügen Sie sie zu einem 1,5-Milliliter-Röhrchen hinzu. Waschen Sie die PIBs dreimal mit 0,5 Milliliter Lysepuffer durch Vortexing, gefolgt von Zentrifugation bei 376 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Fügen Sie den gewaschenen PIBs eine angemessene Menge an Lysepuffer hinzu, um eine PIB-Pufferlösung von 50% pro Volumen herzustellen.
Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren und Schwenken Sie die Pipettenspitze und die Aufschlämmung, um die PIBs wieder aufzuhängen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Aufschlämmung auf ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 0,5 Milliliter Lysepuffer enthält. Drehen Sie die Schläuche 30 Sekunden lang mit 376 mal g.
Jede Röhre enthält gleiche Mengen an PIBs. Verwerfen Sie den Überstand, während Sie nur das feste Harz und bis zu 50 Mikroliter Lysepuffer in jedem Röhrchen belassen. Übertragen Sie die Lysate auf die entsprechend gekennzeichneten Röhrchen, die PIBs enthalten.
Inkubieren Sie das Lysat mit den PIBs für eine Stunde bei 4 Grad Celsius mit einer Rotation bei 8 U / min. Nach der Inkubation mit dem Lysat zentrifugieren Sie die PIBs bei 376 mal g für 30 Sekunden bei 4 Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen, indem Sie 0,5 Milliliter Lysepuffer hinzufügen und die Röhrchen umkehren Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche den Lysepuffer so weit wie möglich, ohne die PIBs zu pipettieren. Bereiten Sie einen Elutionspuffer mit 2% SDS vor und fügen Sie den Elutionspuffer dem Vier- bis Fünffachen des PIB-Volumens hinzu.
Eine Stunde lang bei 65 Grad Celsius inkubieren, um die Phosphoproteinphosphatasen aus den Perlen zu eluieren. Zentrieren Sie die Röhrchen bei 376 mal g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Sammeln Sie das Eluat in einem separaten Röhrchen und fahren Sie mit Massenspektrometrieanalysen oder Western-Blotting fort.
Um die PIBs zu regenerieren, inkubieren Sie sie in 2%SDS-Lösung mit Rotation bei 8 U / min für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen drei- bis fünfmal in 25 millimolaren Tris-HCl pH 7,5 mit Rotation für 30 Minuten pro Waschgang. Lagern Sie PIBs in 25 millimolar Tris HCL pH 7,5 mit Natriumazid.
Für die Massenspektrometrie-Analyse variieren die Methoden der Datenfilterung und -analyse und können vom Forscher oder einer Kerneinrichtung durchgeführt werden. Nachdem Sie die Rohdaten anhand einer artspezifischen Proteomdatenbank durchsucht haben, filtern Sie die Suchergebnisse und exportieren Sie sie als Microsoft Excel-Arbeitsblatt. Analysieren Sie die Daten in dreifacher Ausfertigung.
Für eine markierungsfreie Quantifizierung verwenden Sie MS1-Peak-Area-Messungen, um die Daten zu quantifizieren. Um PPP-Untereinheiten und ihre Interaktoren de novo zu identifizieren, vergleichen Sie biologische Triplikate von microcystin-LR-inhibierten und DMSO-behandelten Proben. Filtern Sie die Daten so, dass nur Proteine mit einer Gesamtpeptidzahl von mehr als einem von mindestens zwei der drei DMSO-Kontrollproben vorhanden sind.
Um Proteine herauszufiltern, die unspezifisch an das Harz binden, entfernen Sie die Proteine, in denen die Gesamtpeptidzahl im mit Microcystin-LR behandelten Zustand höher ist als bei jeder katalytischen PPP-Untereinheit. Schließen Sie häufige Verunreinigungen wie Keratin, Kollagen, ribosomale Proteine und heterogene nukleäre Ribonukleoproteine von der Analyse aus. Eine CSV-Datei ist für den Import der Daten in Perseus unerlässlich.
Importieren Sie gefilterte Daten in Perseus, indem Sie im Abschnitt Laden auf Generischer Matrix-Upload klicken. Transformieren Sie die Daten, indem Sie zu Basic Transform wechseln, die Daten auswählen und die Transformationsfunktion als Protokollbasis 2 von x angeben. Unterstellen Sie fehlende Werte aus einer Normalverteilung, indem Sie zu Imputation, Fehlende Werte aus der Normalverteilung ersetzen, die Daten auswählen und die Breite und die Herunterschaltung für die Berechnung angeben.
Führen Sie eine Quantilnormalisierung durch, indem Sie zu Normalisieren, Quantilnormalisierung gehen. Kommentieren Sie die Daten, indem Sie zu Annot-Zeilen, Kategoriale Anmerkungszeilen wechseln. Führen Sie den T-Test des Schülers durch, indem Sie zu Tests, Zwei-Stichproben-Tests, Auswahl der Gruppen, des durchzuführenden Tests und der Methode für die Korrektur mehrerer Hypothesentests, wie sie für das Abschneiden verwendet werden, gehen.
Diese Funktion berechnet auch die logarithmischen 2-Verhältnisse. Phosphoproteinphospholate und ihre Interaktoren wurden in den HeLa-Zellen mittels eines PIB-Pulldown-Experiments identifiziert, gefolgt von einer markierungsfreien Quantifizierung der Proteinhäufigkeit in DMSO-behandelten und Microcystin-LR-behandelten Proben. Das Vulkandiagramm der Massenspektrometrie-Analyse identifizierte spezifische PIB-Bindemittel, die in Rot dargestellt sind, katalytische Untereinheiten in Blau und neue PPP-Untereinheiten oder interagierende Proteine in Weiß.
Unspezifische Bindemittel wurden grau dargestellt. Das Streudiagramm der log2-Fläche aus dem DMSO-behandelten HeLa-Zelllysat zeigte, dass die Häufigkeiten stark korreliert waren, was auf eine Reproduzierbarkeit der Daten hinweist. Die Netzwerkanalyse aller Phosphorproteinphosphatase-Untereinheiten und interagierenden Proteine zeigte, dass diese Proteine spezifische Interaktoren im PIB-Pulldown waren.
Globale Proteomikanalysen könnten durchgeführt und die Ergebnisse mit der PIB-Analyse verglichen werden, um festzustellen, ob die PPPome-Zusammensetzung durch PPP-Häufigkeit gesteuert oder durch posttranslationale Mechanismen reguliert wird. PIB-MS ist ein breit anwendbares Werkzeug, das es uns ermöglicht hat, Unterschiede in PPP-Expressionsmustern unter verschiedenen Bedingungen wie Interphasen- gegenüber mitotischen Proben oder Unterschieden zwischen Krebszelllinien zu identifizieren.
