Dieses Protokoll kann verwendet werden, um einen besseren Einblick in die Dynamik und Rolle von Phosphoproteinen zu erhalten, die während der kraniofazialen Entwicklung von Säugetieren aktiv sind. Dieses Protokoll überwindet die gemeinsame Barriere der Dephosphorylierung während der Proteinisolierung aus zwei physiologisch relevanten Kontexten, Mausgesichtsprozessen und kultivierten embryonalen Gaumenchymzellen der Maus. Es ist unerlässlich, sich schnell zu bewegen, während alle Reagenzien und Materialien auf Eis gehalten werden, und Phosphatase-Inhibitoren in allen Lysepuffern zu verwenden, um die Integrität phosphorylierter Proteine zu erhalten.
Legen Sie zunächst den Mauskörper mit der Bauchseite nach oben auf ein Sezierbrett und besprühen Sie den Mausbauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie dann die Bauchhöhle, indem Sie die Haut vor die Vaginalöffnung mit gerader Semken-Pinzette kneifen und anheben. Als nächstes schneiden Sie die angehobene Haut in darunter liegende Schichten mit einer geraden chirurgischen Schere in einem Winkel von 45 Grad auf beiden Seiten, um eine V-Form zu erzeugen, die sich etwa auf halbem Weg zwischen den vier Gliedmaßen und Hinterbeinen auf jede seitliche Oberfläche erstreckt.
Mit der Semken-Pinzette eines der Gebärmutterhörner greifen und unterhalb des Eileiters und oberhalb des Gebärmutterhalses mit einer chirurgischen Schere schneiden. Um eine vollständige Entfernung des Gebärmutterhorns zu ermöglichen, schneiden Sie das Mesometrium weg und übertragen Sie dann das sezierte Gebärmutterhorn auf 10 Milliliter Histologie PBS in einer 10 Zentimeter großen Petrischale. Entfernen Sie in ähnlicher Weise das zweite Gebärmutterhorn auf der gegenüberliegenden Seite der Bauchhöhle.
Anschließend die 10 Zentimeter große Petrischale mit den beiden Uterushörnern auf Eis legen. Sezieren Sie unter einem sezierenden Stereomikroskop vorsichtig jeden Embryo aus den Uterushörnern mit Dumont 5 feinen Pinzetten. Ziehen Sie dann langsam das Myometrium, die Dezidua und das Chorion weg.
Als nächstes reißen und entfernen Sie das relativ transparente Amnion, das den Embryo umgibt, und durchtrennen Sie die Nabelschnur, die den Embryo mit der Plazenta verbindet. Übertragen Sie dann jeden sezierten Embryo auf 2,5 Milliliter Histologie PBS in einem individuellen Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette. Bereiten Sie drei 10 Zentimeter große Petrischalen mit 10 Millilitern Histologie PBS vor und bewahren Sie sie auf Eis auf, um sie in Rotation zwischen den Embryonen zu verwenden.
Übertragen Sie dann einen Embryo aus einer individuellen Vertiefung der 12-Well-Zellkulturplatte in eine der 10 Zentimeter großen Petrischalen mit Histologie PBS auf Eis mit einer geschnittenen Plastiktransferpipette. Trennen Sie unter dem Seziermikroskop jeden Oberkieferfortsatz mit der feinen Pinzette vom Gesicht, indem Sie zuerst einen Schnitt an der Vorderseite eines Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Vertiefung vornehmen, die den lateralen Nasenfortsatz im Oberkieferfortsatz trennt. Als nächstes schneiden Sie die hintere Seite des Oberkieferfortsatzes entlang der natürlichen Einkerbung, die den Oberkieferfortsatz und den Unterkieferfortsatz trennt.
Dann trennen Sie den Oberkieferprozess vollständig, indem Sie einen vertikalen Schnitt von der vorderen zur hinteren Seite des Oberkieferfortsatzes auf der Augenseite des Oberkieferfortsatzes machen, wo die oben genannten natürlichen Einkerbungen enden. Übertragen Sie mit einer neun Zoll großen Pasteur-Pipette mit einer zwei Milliliter kleinen Latexzwiebel das sezierte Paar von Oberkieferprozessen in einem kleinen Tröpfchen von etwa 30 Mikrolitern Histologie PBS auf eine beschriftete 35-Millimeter-Petrischale auf Eis. Übertragen Sie dann das Paar Oberkieferprozessgewebe mit der Pasteur-Pipette auf ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, wodurch der Transfer von Histologie-PBS minimiert wird.
Entfernen Sie außerdem überschüssiges Histologie-PBS im 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit der Pasteur-Pipette. Fügen Sie 0,1 Milliliter eiskalten NP40-Lysepuffer mit Protease- und Phosphatasehemmern hinzu, die unmittelbar vor der Verwendung auf Eis hinzugefügt werden. Dann 10 Mal mit einem 200 Mikroliter PIPETMAN auf und ab pipettieren.
Als nächstes wirbeln Sie 10 Sekunden lang und pipettieren Sie dann 10 Mal mit einem 200-Mikroliter-PIPETMAN auf und ab, während Sie die Erzeugung von Blasen vermeiden. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei Stunden, während Sie Ende über Ende mit einem 1,5-Milliliter- oder Zwei-Milliliter-Paddel mit einem Rohrrevolver rotieren. Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 x g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln den Überstand zu einem neuen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem 200 Milliliter PIPETMAN.
Zuerst aspirieren Sie das Medium aus den embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus mit einer 5,75-Zoll-Pasteur-Pipette, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit eiskaltem Gewebekultur-PBS und kippen Sie die Platte während der letzten Wäsche zur Seite, um sicherzustellen, dass das gesamte PBS-Gewebekultur-Sauggut abgesaugt wird. Als nächstes fügen Sie einen eiskalten NP40-Lysepuffer mit Protease- und Phosphatasehemmern hinzu, die unmittelbar vor dem Gebrauch auf Eis hinzugefügt werden, um die Zellen zu lysieren.
Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang auf Eis mit einer Rotation etwa jede Minute, um eine vollständige Abdeckung der Platte zu gewährleisten. Kratzen Sie dann die Zellen mit einem vorgekühlten Zelllifter von der Platte und übertragen Sie die Zellsuspension auf ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Inkubieren Sie anschließend die Zellsuspension bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, während Sie sich mit einem 1,5-Milliliter- oder Zwei-Milliliter-Paddel mit einem Rohrrevolver von Ende zu Ende drehen.
Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 x g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln den Überstand zu einem neuen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem 200 Milliliter PIPETMAN. Die Western-Blot-Analyse von Ganzzelllysaten aus immortalisierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus nach Stimulation mit PDFG-B-Ligand von 2 bis 15 Minuten ergab unterschiedliche reproduzierbare Banden für Phosphoproteine, die auf oder nahe der Höhe der entsprechenden Gesamtproteinbande verlaufen. Eine Zunahme der Phosphoproteinbandenintensitäten wurde bei der Behandlung mit einem Wachstumsfaktor im Vergleich zu denen unbehandelter Zellen beobachtet, während die Gesamtbandintensitäten der Proteine zwischen den Proben relativ gleich waren.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie Störungen und Phosphorylierung die interzelluläre Signalgebung, Genexpression und zelluläre Aktivität in kraniofazialen Kontexten direkt beeinflussen.
