Dieses Protokoll bietet einen einfachen Zugang in die immer beliebter werdende, aber komplexe Welt der Kryo-Elektronentomographie. Sechs zelluläre Proben können abgebildet werden. Institut in einem Heimatstaat.
Mikromoleküle können dann mit hoher Auflösung in ihrer nativen zellulären Umgebung aufgelöst werden, indem CROW, ET und Subatom-Mittelung verwendet werden. Starten Sie zunächst die Tomo five-Software vom TEM-Server-PC. Starten Sie die Einrichtung der Sitzung, indem Sie die Bildaufnahmeparameter auf der Registerkarte Vorbereitung unter Voreinstellungen anpassen.
Kopieren Sie die Parameter der Bildaufnahme in alle anderen Voreinstellungen für hohe Vergrößerung. Drücken Sie "Set", um die Belichtung im Mikroskop einzustellen, und "Get", um die Belichtungseinstellungen für alle anderen hohen Vergrößerungen zu erhalten, nachdem Sie sie einzeln ausgewählt haben. Um einen Atlas zu sammeln, klicken Sie auf die Registerkarte "Neue Sitzung" im Atlas.
Legen Sie die Sitzungseinstellungen fest. Geben Sie den Speicherpfad und das Ausgabeformat ein und drücken Sie Übernehmen. Wählen Sie "Screening" und kreuzen Sie alle zu erwerbenden Atlanten an.
Select Close Call Valves"Wenn das Mikroskop unbeaufsichtigt ist, werden die Säulenventile geschlossen. Um die Vorführung zu starten, drücken Sie dann die Starttaste. Überprüfen Sie die einzelnen oder mehrere Atlanten auf Ziele, indem Sie auf das Raster im linken Bereich unter Sitzungseinrichtung klicken"Klicken Sie dann mit der linken Maustaste und ziehen Sie die Maus, um sich zu bewegen, und den mittleren Bildlauf, um zu vergrößern und zu verkleinern.
Wählen Sie das Raster für das Ziel-Setup aus. Wählen Sie es aus und klicken Sie in der Software auf "Load Sample". Um die Kalibrierung der Bildverschiebung durchzuführen, stellen Sie auf der Registerkarte "Autofunktionen" die Voreinstellung auf Euzentrische Höhe "Navigieren Sie zu Auto-Euzentrisch" durch Stufenneigung ein und drücken Sie Start.
Wenn das Feature während des Zielens zentriert blieb, überspringen Sie die Kalibrierung der Bildverschiebung. Andernfalls gehen Sie auf die Registerkarte "Vorbereitung" für die Kalibrierung der Bildverschiebung, wählen Sie "Bildverschiebung kalibrieren" und drücken Sie Start. Dadurch werden die niedrigeren Vergrößerungen an dem bei der Belichtungsvergrößerung zentrierten Feature ausgerichtet.
Für die Tomographie einrichten, starten Sie eine neue Sitzung in "Session Setup" für biologische Proben. Wählen Sie "Slab like" als Probentyp und wählen Sie "Batch" und "Low Dose" und wählen Sie dann das Ausgabeformat und den Ordner "Speicher". Fügen Sie optional einen E-Mail-Empfänger hinzu und drücken Sie Übernehmen"Um Ziele einzurichten, gehen Sie zum Atlaspfeil, suchen Sie eine Region von Interesse und bewegen Sie sich, indem Sie die Optionen auswählen, die mit einem rechten Mausklick angezeigt werden.
Machen Sie ein Übersichtsbild, um eine gute Position für die euzentrische Höhenverstellung zu bestätigen. Drücken Sie dann "autoeuzentrisch", um die euzentrische Neigungsroutine auszuführen, ein neues Übersichtsbild zu erhalten, um die euzentrische Höhe zu aktualisieren. Überprüfen Sie die Quadratübersicht oder die erworbene Suchkarte.
Wechseln Sie zu einer Region von Interesse und drücken Sie die Suche erwerben. Überprüfen Sie dann das Suchbild, wenn die Region von Interesse nicht zentriert ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Position und wiederholen Sie "Move stage here" und erfassen Sie das Bild. Passen Sie den Fokus und die Tracking-Bereiche an.
Klicken Sie mit der linken Maustaste, um die Tracking- und Fokusbereiche zu ziehen. Sobald alle Parameter eingestellt sind, drücken Sie Position hinzufügen"Um automatische Funktionen auszuführen, überprüfen Sie die Einstellungen, um die Ausrichtung über die Registerkarte "Autofunktionen" durchzuführen, indem Sie den Atlas zu einem Bereich aus Kohlenstoff navigieren. Bringen Sie diesen Bereich auf euzentrische Höhe und folgen Sie der Reihenfolge der Ausrichtungen, wie im Textmanuskript beschrieben.
Als nächstes starten Sie die automatisierte Erfassung der Tomographie-Registerkarte. Wählen Sie die "Datenerfassung" aus und stellen Sie die gewünschten Parameter ein. Richten Sie Datenerfassungsparameter ein: Neigungsschritt, maximaler positiver Winkel, maximaler negativer Winkel, Tracking-Schema.
Wählen Sie dann "Säulenventile schließen" für das euzentrische Höhenschema. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Eingabedateien und Verzeichnissen. Richten Sie einen Projektordner unter dem Ordner "Projekt" ein.
Erstellen Sie einen weiteren neuen Ordner mit festen Stapeln und bereiten Sie die Eingabedateien vor. Neigungsserie eins feste Neigung Serie 1. XF und Tilt Serie 1.tlt.
Um die Unschärfe zu berechnen, aktualisieren Sie die Parameterdatei mit den Mikroskop- und Bildgebungsparametern. Kopieren Sie eine Parameterdatei in den Projektordner. Ändern Sie den Namen in param_CTF.
M und führen Sie den angegebenen Befehl aus. Überprüfen Sie als Nächstes die CTF-Schätzergebnisse. Überprüfen Sie für jeden Stapel die ausgerichteten Stapel mit 3D-Mod und stellen Sie sicher, dass die treuhänderischen Perlen korrekt gelöscht werden.
Stellen Sie sicher, dass die Händigkeit korrekt ist, indem Sie den angegebenen Befehl ausführen. Überprüfen Sie dann den Defokussierungswert und stellen Sie sicher, dass er mit der theoretischen CTF-Schätzung übereinstimmt. Um die Teilbereiche zu definieren, generieren Sie ein Biegetomogramm.
Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Bestimmen Sie die Grenzen, indem Sie sechs Punkte Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin und Zmax auswählen, um einen Unterbereich unter dem Ordner bin10 zu erstellen, führen Sie den angegebenen Befehl aus. Führen Sie als Nächstes die Partikelauswahl für jeden Unterbereich aus.
Für den Apoferritin-Datensatz führen Sie eine Vorlagensuche in bin sechs durch. Ändern Sie den Unterstrichwinkel der Vorlage. Suchparameter zur Bestimmung des Winkels, des Bereichs und der Intervalle für die Suche in Grad in oder außerhalb der Ebene.
Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Entfernen Sie die falschen Partikel mit 3D-Mod unter dem Ordner. Convmap_wedge_Type2_bin6. Führen Sie den angegebenen Befehl aus.
Initialisieren Sie als Nächstes das Projekt. Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus, um eine Datenbank für EM-Klarheit zu erstellen, AppoF.mat. Führen Sie eine Tomogrammrekonstruktion vor der Sub-Tomo-Mittelung und -Ausrichtung durch, um CTF-korrigierte Subregion-Tomogramme in bin4 zu generieren, führen Sie den angegebenen Befehl aus.
Um als nächstes eine Sub-Tomo-Mittelung und -Ausrichtung durchzuführen, führen Sie die Mittelwertbildung mit den CTF-korrigierten Subtelegrammen durch, die bei bin4 beginnen. Führen Sie im Projektordner den angegebenen Befehl aus. Fahren Sie mit den Ausrichtungen fort, und führen Sie den Befehl aus.
Reinigen Sie die überlappenden Partikel, indem Sie den angegebenen Befehl ausführen. Führen Sie die endgültige Rekonstruktion durch, indem Sie die beiden halben Datensätze kombinieren. Führen Sie im Projektordner die angegebenen Befehle aus.
Überblick über den Tomographie-Workflow für die zelluläre und molekulare Tomographie werden hier für Zell- und Lamellenproben gezeigt, die Datenerhebungsstrategie hängt maßgeblich von der Probe und dem Ziel der bildgebenden Untersuchung ab. Die Sammelparameter für mehrere Kryo-ET-Studien sind hier dargestellt. Repräsentative Tomogramme molekularer Proben wie Apoferritin, dünnzellige Prozesse und fokussierte ionenstrahlgefräste Lamellen der dickzelligen Probe werden hier gezeigt.
Hochauflösende Strukturanalysen können helfen, Bindungsstellen für Wirkstoffziele aufzudecken, und Tomographie und subtomograle Mittelung haben auch die Impfstoffentwicklung gegen SARS-CoV-2 unterstützt.
