Das 3D-korrelative FIB-Fräsen macht spezifische und sogar seltene zelluläre Ereignisse für die Kryo-TEM zugänglich. Dies ermöglicht die Enthüllung der Ultrastruktur dieses Ereignisses direkt in der nativen Umgebung. Der korrelative Arbeitsablauf verbessert die Erfolgsrate bei der Bekämpfung seltener zellulärer Strukturen und hilft, sie in der überfüllten zellulären Umgebung eindeutig zu identifizieren.
Demonstrieren wird das Verfahren von Anna Bieber und Christina Capitanio, Expertinnen für korrelative Kryo-Elektronentomographie. Beginnen Sie mit der Kryo-Fluoreszenzmikroskopie der zellbesiedelten Gitter, indem Sie einen weiten Feldüberblick im Fluoreszenz- und reflektierten Modus erhalten. Wählen Sie dann geeignete Gitterquadrate mit Fluoreszenzsignal aus.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Zellen und Perlen gleichmäßig in Richtung der Mitte jedes Quadrats verteilt sind, wählen Sie die Quadrate auf 200-Maschen-Gittern, die sowohl für das FIB-REM als auch für das TEM-Instrument zugänglich sind und mindestens drei Quadrate vom Gitterrand entfernt sind. Erfassen Sie auf jedem der ausgewählten Gitterquadrate einen Fluoreszenzstapel mit einem geeigneten fokussierten Schritt. Objektive mit hoher numerischer Apertur sollten verwendet werden, um die Photonenzahl und die Lokalisierungsgenauigkeit zu erhöhen.
Erfassen Sie auf einem konfokalen Mikroskop mit einem Objektiv mit numerischer Apertur von 0,9 Stapel mit einer Schrittweite von 300 Nanometern und einer Überabtastung des Nyquist-Werts. Zeichnen Sie mehrere Farbstapel auf und lagern Sie die Gitter bis zur weiteren Verwendung unter flüssigem Stickstoff. Verwenden Sie entweder die Ausschnitt- oder die Ausrichtungsmarkierungen, um die richtige Ausrichtung des Gitters für die spätere Platzierung im TEM sicherzustellen.
Laden Sie die Gitter in das Kryo-FIB-REM-Instrument. Achten Sie darauf, dass die Fräsrichtung senkrecht zur Kippachse des TEM verläuft. Um die Gitter mit einer metallorganischen Schutzschicht zu beschichten, verwenden Sie einen Plasmacodierer und ein Gasinjektionssystem an den durch den FIB-SEM-Aufbau vordefinierten Tischpositionen.
Zeichnen Sie als Nächstes die SEM-Rasterübersicht auf und führen Sie eine 2D-Korrelation mit FLM-Übersichten durch. Finden Sie die Rasterquadrate, indem Sie aufgezeichnete Rasterübersichten manuell überprüfen oder ein Softwarepaket verwenden. Wählen und markieren Sie vier korrespondierende Positionen für die Quadrate in der FLM- und SEM-Rasterübersicht und berechnen Sie die Transformation zwischen den markierten Punkten für die FLM-SEM-Korrelation.
Platzieren Sie dann die Marker in der Mitte der entsprechenden Rasterquadrate, für die FLM-Stapel erfasst wurden, bevor Sie ihre Position in der SEM-Ansicht vorhersagen. Nehmen Sie für jedes korrelierte Gitterquadrat ein Niedrigstrom-Ionenstrahlbild mit dem gewünschten FIB-Fräswinkel auf und wählen Sie ein Sichtfeld mit der gewünschten Position und Vergrößerung, das den Fluoreszenzdaten entspricht. Erfassen Sie für 200 Netzgitter FIB-SEM-Daten, die einzelne Rasterquadrate enthalten, einschließlich der Rasterstäbe.
Nehmen Sie dann ein REM-Bild desselben Quadrats auf, um die Identifizierung entsprechender Kügelchen in der Fluoreszenz- und Ionenstrahlansicht zu erleichtern. Führen Sie die Registrierung des rohen oder entfalteten 3D-FLM-Stapels und der 2D-Ionenstrahlansicht für jede Position mit der 3D-Korrelations-Toolbox, 3D-CT, durch, indem Sie den entsprechenden neu geschnittenen 3D-FLM-Stapel und die Ionenstrahlansicht in 3D CT.In die Fluoreszenzdaten laden, vier Passermarkenperlen auswählen und mit der rechten Maustaste auf die Positionsliste klicken, um die 3D-Position der Perlen über die Gaußsche Anpassung des Signals in X zu bestimmen. Y und Z.Wählen Sie dann die entsprechenden Kügelchen im Ionenstrahlbild aus, um eine erste 3D-Korrelation durchzuführen. Fügen Sie dem Register weitere Perlen hinzu, um die Genauigkeit der Korrelation zu überprüfen.
Lassen Sie einige Passermarken weg, die sowohl in der Fluoreszenz als auch im Ionenstrahl klar erkennbar sind, indem Sie ihre vorhergesagte und tatsächliche Position im Ionenstrahlbild überprüfen. In der 3D-CT können "Root Mean Square Error" (RMSE-Werte) angezeigt werden, um die Korrelationskonsistenz zu bewerten. Stellen Sie sicher, dass die RMSE-Werte klein sind und in der Größenordnung der Lokalisierungsgenauigkeit liegen.
Wählen Sie als Nächstes die anvisierten Mobilfunksignale aus und passen Sie die 3D-Position im FLM-Stapel an, bevor Sie die Transformation anwenden, um die Zielpositionen in der Ionenstrahlansicht vorherzusagen. Übertragen Sie für jedes korrelierte Quadrat die vorhergesagten Positionen der interessierenden Merkmale an das FIB-REM-Instrument, um die Lamellenfräsmuster zu platzieren. Wenn mehrere Signale pro Zelle vorhanden sind, platzieren Sie die Muster so, dass sie die maximal möglichen Punkte von Interesse in derselben Lamelle enthalten.
Die Lamellen werden grob gefräst und anschließend fein gemahlen, um eine Enddicke von 150 bis 250 Nanometern zu erhalten. Achten Sie darauf, dass die Lamellenausrichtung senkrecht zur Kippachse steht, wenn Sie die Gitter in das Transmissionselektronenmikroskop laden. Erfassen Sie Gittermontagen und Übersichten für jedes Gitterquadrat, das Lamellen enthält, mit geeigneter Vergrößerung und Belichtungszeit, um die Passermarkenperlen in den TEM-Bildern zu visualisieren, ohne die Gesamtelektronendosis signifikant zu erhöhen.
Erfassen Sie hochauflösende TEM-Karten jeder Lamellen. Register und 3D-2D korrelieren den FLM-Stack mit dem TEM-Gitterquadrat und den Lamellenübersichten in der 3D-CT. Führen Sie eine Korrelation zwischen FLM und TEM von niedriger bis hoher Vergrößerung in TEM durch. Nach dem Übertragen der Positionen richten Sie die Neigungsreihen ein und führen Sie sie an korrelierten Positionen aus, verwenden Sie dann eine geeignete Vergrößerung, Defokussierung und Gesamtdosis, um die Bildaufnahme bei der von der Lamelle unter Verwendung eines dosissymmetrischen Neigungsschemas bestimmten Vorneigung zu starten.
Befolgen Sie entweder die manuelle oder die Stapelerfassung von Bildern. In der repräsentativen Analyse wird gezeigt, dass die TEM-Übersicht der Mahlstelle mit geringer Vergrößerung biologische Merkmale von Interesse lokalisiert. Später wurde eine Ansicht mit höherer Vergrößerung mit der FLM-Maximalintensitätsprojektion korreliert und Positionen für die Tomogrammaufnahme eingerichtet.
In den aufgenommenen Bildern konnte die endozytäre Proteinablagerung in ihrer nativen Umgebung visualisiert werden. Die Optimierung der Probe ist sehr wichtig. Die Gitterpräparation sollte optimiert werden, um eine gute Verteilung der zu mahlenden Zellen und eine gute Anzahl sichtbarer Passermarkenperlen in den meisten Gitterquadraten zu erreichen.
Das korrelative 3D-Fräsen hat dazu beigetragen, die Ultrastruktur verschiedener zellulärer Prozesse aufzudecken, wie z. B. das schrittweise Fortschreiten der Autophagie in jeder Zelle, und es wird verwendet, um ein neuartiges phasengetrenntes Kompartiment zu erfassen.
