Diese Methode ermöglicht hochauflösende Kryo-Bildgebung an ganzen biologischen Zellen, um zelluläre Strukturen genau zu identifizieren. Es kann auch in Verbindung mit anderen Modalitäten als Teil eines korrelativen Bildgebungsworkflows verwendet werden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass die hochauflösende Bildgebung unter kryogenen Bedingungen mit herkömmlichen Fluorophoren und relativ niedrigen Lichtdosen schnell durchgeführt werden kann.
CyroSIM ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das Einblicke in das Verständnis der zellulären Ultrastrukturdynamik als Reaktion auf interne oder externe Hinweise bietet. Seine Anwendung umfasst impfstoffproduktion und -einführung, Qualitätskontrolle, Überwachung nach dem Inverkehrbringen, Antikörper-Engineering und -Optimierung sowie Nanopartikelcharakterisierung. Das Manövrieren von Proben innerhalb der Kryophase erfordert Übung, um die Sicherheit des Netzes zu gewährleisten.
Am besten machen Sie sich vor der Datenerfassung auch mit den Bedienelementen im Cockpit-Fenster vertraut. Entfernen Sie zunächst den Deckel vom äußeren Dewar der Kryostufe und gießen Sie gefilterten flüssigen Stickstoff, bis er etwa ein Viertel voll ist. Warten Sie, bis das anfängliche Kochen nachlässt, bevor Sie mehr gießen und füllen Sie das Gefäß zu etwa zwei Dritteln voll.
Ersetzen Sie den Deckel vorsichtig und richten Sie die Düse vom Handler weg, wenn der flüssige Stickstoff auskocht. Sobald der flüssige Stickstoff nicht mehr aus dem Auslass kommt, legen Sie das Auslassrohr über die Bühne Dewar auf die Kryostufe. Schließen Sie die Stromquelle an, schließen Sie das USB-Kabel an und schließen Sie den externen Dewar an die Bühne an.
Drücken Sie nach der Lieferung von flüssigem Stickstoff den Auslöseknopf auf der Kryostufe, damit er in die Probenkammer gelangen kann, und warten Sie 30 bis 45 Minuten, bis das System abgekühlt und stabilisiert ist, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Verwenden Sie die Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug, um die beiden Platten der Probentransferkassette zu öffnen. Öffnen Sie die Platten breit genug, um das Gitter zwischen den beiden Platten fallen zu lassen, aber öffnen Sie nicht bis zur maximalen Position.
Verwenden Sie eine lange Zette, um die Probengitterbox aus dem flüssigen Stickstoff zu heben. Drehen Sie es so, dass die Notch mit der Lagerposition innerhalb der Bühne ausgerichtet ist, und legen Sie es auf die Bühne. Verwenden Sie das entsprechende Gerät, um den Deckel der Aufbewahrungsbox an die richtige Probenposition zu öffnen.
Entfernen Sie mit einer invertierten Sozette das TEM-Gitter aus dem Probenhalter, tauchen Sie es in den flüssigen Stickstoff ein, um sicherzustellen, dass die Kohlenstofffilmseite so platziert wird, dass sie letztendlich dem Objektiv auf der Probenbrücke zugewandt ist, und lassen Sie es in der Probentransferkassette in Position bringen. Schließen Sie die Probenkassette mit der Sechskanttaste am Kassettenwerkzeug. Verwenden Sie den Magnetpunkt am Kassettenwerkzeug, um die Patrone mit dem Gitter auf der Probenbrücke anzuheben und zu montieren.
Halten Sie es eingetaucht oder nahe am flüssigen Stickstoff und in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie die Kassette flach in die Positionierstifte der Brücke und stupsen Sie sie vorsichtig an, um sicherzustellen, dass sie fixiert ist. Schließen und entfernen Sie die Aufbewahrungsbox zusammen mit den verbleibenden Proben.
Bewegen Sie die Öffnung des Kryo-Deckels in die Bildposition und schalten Sie das Probenkammerlicht aus. Schieben Sie die Bühne in Richtung der Optik, um sie unter der Objektivlinse auszurichten, und lassen Sie das Objektiv dann vorsichtig mit dem Hebel in Position, um sicherzustellen, dass es im Deckel der Kryostufe ruht, es aber nicht berührt. Decken Sie Bühne und Optik mit einem undurchsichtigen schwarzen Vorhang ab und starten Sie dann die Steuerungssoftware Cockpit auf dem cryoSIM-PC. Klicken Sie auf die Schaltfläche für den Auslesemodus für jede Kamera und stellen Sie sie auf CONV3 Megahertz ein.
Überprüfen Sie, ob die Temperatur jeder Kamera 80 Grad Celsius beträgt und dass der Kameralüfter ausgeschaltet ist. Schalten Sie die reflektierte Kamera unter Licht ein, wählen Sie Umgebung und unter Linkam, überprüfen Sie den Kondensator und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Videomodus. Verkleinern Sie im Mosaikansichtsfenster, um die Rasterkontur anzuzeigen.
Klicken Sie auf Bühne suchen, wenn sie nicht sichtbar ist, und zentrieren Sie das Raster durch Doppelklick mit der linken Maustaste in die Mitte des Kreises. Verwenden Sie die Auf- und Abwärtstasten, um die Probe zu fokussieren, bis der Rasterunterstützungsfilm oder ein anderes relevantes Merkmal im Fokus ist. Verwenden Sie die Tasten neun und drei auf dem Numerischen Pad, um den Z-Schritt zu ändern.
Sobald die Bühne zentriert ist, deaktivieren Sie den Videomodus. Sammeln Sie ein Mosaik mit sichtbarem Licht, indem Sie in der Mosaikansicht auf Mosaik ausführen klicken, um Kacheln mit Bildern mit sichtbarem Licht zu erzeugen, die sich von der Mitte nach außen spiralförmig drehen. Speichern Sie die Ansicht, indem Sie auf Mosaik speichern klicken.
Untersuchen Sie das Hellfeldmosaik neben allen vorherigen Fluoreszenzkartenbildern, indem Sie das Umgebungslicht und den Kondensator sowie den Videomodus ausschalten, dann den erforderlichen Anregungslaser einschalten und die entsprechende Kamera und den Filter auswählen, zunächst bei 50 Milliwatt für eine Belichtungszeit von 50 Millisekunden. Drücken Sie Null, um ein Bild und einen Stern auf automatischen Kontrast zu halten. Alternativ können Sie den Kontrast manuell anpassen, indem Sie den Schieberegler am unteren Rand des Bildes verwenden.
Sobald biologisch interessante Zellen mit geeigneter Fluoreszenz gefunden wurden, markieren Sie ihre Positionen mit dem Mark-Site-Button in der Mosaikansicht. Markieren Sie weiterhin alle potenziellen Standorte, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Speichern Sie das Mosaik mit den markierten Websites erneut, indem Sie auf Sites in Datei speichern klicken.
Wählen Sie den anzuwendenden Filter aus und optimieren Sie die Einstellungen für jede Wellenlänge des zu verwendenden Anregungslichts, indem Sie jeden Laser separat einschalten. Klicken Sie auf beide Kameras, um sie einzuschalten. Kehren Sie zu einem der markierten Orte zurück und konzentrieren Sie sich wieder auf die gewünschte Tiefe.
Sobald Sie in einem Interessenbereich im Fokus sind, bewegen Sie sich mit der Pfeiltaste nach oben im XY-Fenster auf der Makrostufe aus dem Fokus, um die Höhe des zu erfassenden Z-Stapels auszuwählen, und klicken Sie auf Oben speichern. Bewegen Sie sich mit der Nach-unten-Taste aus dem Fokus, klicken Sie auf Unten speichern, dann auf Gehe zur Mitte, überprüfen Sie, ob das Bild noch im Fokus ist. Wählen Sie im Fenster Cockpit die Option Einzelstandortexperiment aus.
Wählen Sie in der Dropdown-Liste Strukturierte Beleuchtung aus. Ändern Sie die Stapelhöhe so, dass sie der Z-Höhe plus einem Mikrometer entspricht. Geben Sie die Belichtungszeiten in Millisekunden für die Laser 405 und 488 Nanometer in der oberen Reihe für die reflektierte Kamera und die Belichtungszeiten für die Laser 561 und 647 Nanometer in der unteren Reihe für die übertragene Kamera ein.
Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf Aktualisieren, um eine neue Datei mit Datum und Uhrzeit zu erstellen, ohne die vorherigen Dateien zu überschreiben, und klicken Sie dann auf Start. Füllt der flüssige Stickstoff Dewar während der Bildaufnahme die Kryostufe wieder auf, bricht der Vorgang ab, indem Sie in der Cockpit-Software auf die Schaltfläche ABORT klicken. Sammeln Sie an jeder Position einen Z-Stack mit sichtbarem Licht, indem Sie die Laser ausschalten und das Umgebungslicht und den Kondensator einschalten.
Wählen Sie unter Einzelstandortexperiment die Option Z-Stack aus und stellen Sie das Umgebungslicht auf 20 Millisekunden ein, wobei die Z-Höhe beibehalten wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle markierten Websites. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, koppeln Sie die Bühne ab und entfernen Sie alle Proben.
Schalten Sie die Probenkammerleuchte aus. Ziehen Sie den externen Dewar ab und dekantieren Sie den verbleibenden flüssigen Stickstoff in einen anderen kryokompatiblen Behälter, damit der Dewar sicher auf eine normale Temperatur zurückkehren kann. Warten Sie, bis die Option zum Ausbacken der Kryo-Stage-Anzeige verfügbar ist, nachdem kein flüssiger Stickstoff mehr in der Stufe Dewar verbleibt.
Drücken Sie die Bake-Out-Taste, um in den Heizmodus zu wechseln. Setzen Sie den Deckelstecker auf die Kryobühne. Die Auflösung in KryoSIM ist deutlich höher als in der Standard-Epifluoreszenzmikroskopie.
Die Fluoreszenzkarte eines herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskops kann verwendet werden, um Bereiche von Interesse für die Bildgebung zu lokalisieren und das entsprechende KryoSIM-Bild kann von einem Ort auf dem Gitter erhalten werden. Eine Probe, die U2OS-Zellen enthielt, wurde mit einer Mischung aus grünem Mikrotubuli-Zytoskelettfarbstoff und rotem Mitochondrienfarbstoff gefärbt, was zur Färbung der Mikrotubuli-Komponente des Zytoskeletts und der Mitochondrien führte. Die anschließende Bildgebung zeigte die Lokalisation der Mitochondrien innerhalb der Zelle sowie die Anordnung der Mikrotubuli, wobei der strukturelle Rahmen, den sie der Zelle bieten, und die Montage des Zytoskeletts um Organellen hervorgehoben wurden.
Der SIM-Rekonstruktionsprozess kann Artefakte erzeugen, die mit SIMCheck, einem kostenlosen imageJ-Plugin, identifiziert werden können. Diese mit SIMCheck generierte Modulationskontrastkarte zeigt Bereiche mit niedrigem Modulationskontrast innerhalb des Kernbereichs, was darauf hindeutet, dass dieser Bereich anfälliger für Rekonstruktionsartefakte sein wird. Der weiße Pfeil zeigt ein Rekonstruktionsartefakt an.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass die Probe jederzeit untergetaucht oder in der Nähe von flüssigem Stickstoff bleibt, um eine Entvitrifizierung zu vermeiden. Achten Sie auch auf Belichtungszeiten und Zählungen im Dynamikbereich, da dies die Qualität der Daten beeinträchtigt und Laserschäden an der Probe vermeidet. Nach der Kryo-Bildgebung können die gleichen Proben mit anderen Modalitäten wie der kryoweichen Röntgentomographie abgebildet werden, die wir hier an der B24 Beamline haben.
Durch die Kombination von KryoSIM-Bildern mit Bildern, die strukturelle Informationen über die Zelle enthalten, können wir wichtige zusätzliche Fragen zur zellulären Ultrastruktur und -funktion beantworten.
