Unser Protokoll ermöglicht es uns zu untersuchen, wie Gewebe wie die Skelettmuskulatur ihre Größe regulieren, was eine Schlüsselfrage in der Zell- und Entwicklungsbiologie mit wichtigen physiologischen und medizinischen Implikationen bleibt. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass das Zellwachstum in lebenden Tieren in vivo mit einem hohen Maß an räumlicher und zeitlicher Genauigkeit beobachtet und gemessen werden kann. Fortschritte im grundlegenden Verständnis des frühen Muskelwachstums können die Entwicklungsursprünge früher Muskelprobleme aufzeigen und zur Entdeckung von Novo Therapeutics zum Schutz vor Muskelabbau bei älteren Menschen und Patienten mit Muskelschwunderkrankungen führen.
Bereiten Sie 1% LMA in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor und bewahren Sie es für den wiederholten Gebrauch in einem 37-Grad-Celsius-Hitzeblock auf. Wählen Sie Fische aus, die montiert werden sollen, und betäuben Sie jeden Fisch vorübergehend. Um einen Hitzeschock zu vermeiden, entfernen Sie das LMA-Aliquot aus dem Heizblock und lassen Sie es bis knapp über die Einstellung abkühlen.
Nehmen Sie eine 60-Milliliter-Petrischale, die mit einer Schicht von 1% LMA beschichtet wurde, und legen Sie sie auf den Tisch eines Seziermikroskops. Die Larve mit einer Pasteur-Pipette aus einem Milliliter Kunststoff auf eine 60 Millimeter beschichtete Petrischale geben und so viel übertragenes Medium wie möglich entfernen. Geben Sie dann, immer noch mit der Pasteur-Pipette, einige Tropfen LMA auf den Fisch und richten Sie die Larve schnell in der Nähe der Oberseite der LMA mit ihrer anteroposterioren und dorsoventralen Achse innerhalb von 10 Grad der Horizontalen aus, wobei Sie eine Pinzette oder eine feuerpolierte, feine Glasnadel verwenden, bevor die LMA untergeht.
Alternativ können Sie eine Pasteur-Pipette aus einem Milliliter Kunststoff verwenden. Sammeln Sie die Larven mit minimalem Fischmedium und übertragen Sie die Larven in das Aliquot von gekühltem LMA. Lassen Sie die Larve fünf Sekunden lang sinken, um vollständig von LMA umgeben zu werden.
Dann holen Sie die Larve und geben Sie sie in einem Tropfen LMA auf die mit Agarose überzogene Petrischale. Positionieren Sie die Larve schnell, wie zuvor gezeigt. Wenn die Larven nicht korrekt horizontal in der Nähe der Oberfläche des Agarosentropfens montiert sind, entfernen und wieder einbetten, können Larven leicht durch sanftes Absaugen mit einer Pasteurpipette aus einem Milliliter Kunststoff geborgen werden und LMA kann vorsichtig mit Chem-Tüchern entfernt werden.
Warten Sie etwa 10 Minuten, bis LMA eingestellt ist. Fluten Sie die Schale mit etwa 10 Milliliter Tricain-haltigem Fischmedium. Um konfokale Stapel zu erfassen, lassen Sie die montierten Fische vor dem Scannen mindestens 10 Minuten ruhen, da eine Agaroseschwellung auftritt.
Laden Sie die Probenschale auf den Tisch des konfokalen Systems. Lokalisieren Sie die Larven und konzentrieren Sie sich auf das gewünschte Somit. Somite 17 kann aufgrund seiner einfachen Lokalisation in der Nähe des Analschlotes und der einfachen Bildgebung gewählt werden.
Überprüfen Sie, indem Sie Somiten von der Vorderseite zählen. Um YZ-Bilder aufzunehmen, richten Sie die Einrichtung so ein, als ob Sie einen Z-Stack erfassen möchten. Beginnen Sie mit der Definition der oberen und unteren Punkte des Fisches.
Sowohl die linke als auch die rechte Seite können beliebig erfasst werden, um sicherzustellen, dass alle schnellen YZ-Scans die gewünschten Regionen erfassen. Richten Sie den Scanbereich für die Fische so aus, wie es die konfokale Software zulässt. Positionieren Sie den Fisch mit der anteroposterioren Achse, parallel zur Bilddex-Achse und der dorsoventralen Achse parallel zur Y-Achse mit Somit 17 in der Mitte des Feldes.
Konzentrieren Sie sich auf eine mittlere Ebene im obersten Myotom, in der die gesamten epaxialen und hypaxialen Somithälften zusammen mit den vertikalen und horizontalen Myosepten sichtbar sind und ein hochauflösendes XY-Bild aufnehmen. Benennen Sie die Datei, und speichern Sie das Bild. Um die YZ-Bilder aufzunehmen, zeichnen Sie eine präzise dorsale bis ventrale Linie über den ausgewählten Somiten, senkrecht zur anteroposterioren Achse des Fisches.
Fügen Sie eine ausgewählte anteroposteriore Position hinzu und führen Sie dann einen Z-Stack-Line-Scan durch. Wiederholen Sie den YZ-Linienscan dreimal an definierten anteroposterioren Positionen entlang des ausgewählten Myotoms, um YZA, YZM und YZP zu erfassen. Benennen und speichern Sie diese Bilder mit dem zugehörigen XY-Bild.
Dieses Protokoll wurde als Vier-Slice-Methode bezeichnet und die Bilder können mit Zen-Software oder ImageJ analysiert werden. Um eine Stimulationskammer zu schaffen, nehmen Sie eine sechs mal 35 Millimeter große Well-Platte und erzeugen Sie zwei kleine Öffnungen mit einem Durchmesser von weniger als fünf Millimetern, die auf jeder Seite jeder Vertiefung mit einem schmalen Lötkolben einen Zentimeter voneinander entfernt sind. Einmal erstellt, kann die Stimulationskammer wiederverwendet werden.
Fädeln Sie ein Paar Silber- oder Platindrähte durch die Öffnungen jedes Vertiefungs. Das wiederverwendbare Klebematerial kann in der Nähe der Öffnungen aufgetragen werden, um die Drähte an Ort und Stelle zu halten und einen Abstand von einem Zentimeter zwischen den Drähten zu gewährleisten. Drei Tage nach der Befruchtung teilen Sie die Fische in drei Bedingungen auf, Fisch mittlere Kontrolle, inaktiv und inaktiv plus Stamm.
Bei inaktiven und inaktiven plus Stammgruppen die Larven 72 Stunden nach der Befruchtung mit 0,6 Millimolar Tricain anästhesieren. Für die Fische mittlere Kontrollfische, lassen Sie sie unbetäubt. Bereiten Sie 60 Milliliter 2% Agarose in Fischmedium vor.
Schmelzen Sie es gründlich mit einer Mikrowelle und lassen Sie es abkühlen. Dann fügen Sie Tricain hinzu und gießen Sie mindestens vier Milliliter in jede Vertiefung der Stimulationskammer. Fügen Sie sofort maßgeschneiderte Kämme mit vier Vertiefungen zwischen den Elektroden hinzu.
Lassen Sie das Gel 10 Minuten aushärten. Entfernen Sie die Kämme vorsichtig, um vier rechteckige Vertiefungen zu schaffen. Füllen Sie jede Vertiefung mit Tricainwasser und legen Sie eine einzelne betäubte, inaktive plus Stammlarve mit einer Mikropipette in jede Vertiefung, wobei ihr anteroposteriorer Zugang senkrecht zu den Elektroden steht.
Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, ob jeder Fisch in jeder Kammer vollständig betäubt ist. Verbinden Sie einen einstellbaren elektrophysiologischen, mustererzeugenden Stimulator über einen Polaritätsregler mit der Kammer, indem Sie Krokodilclips verwenden, die mit jeder Elektrode auf einer Seite der Kammer verbunden sind. Dann stimulieren Sie den Fisch wie im Textmanuskript beschrieben.
Überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, ob die Fische stimuliert werden. Der elektrische Reiz sollte alle fünf Sekunden eine sichtbare bilaterale Kontraktion und leichte Bewegung nach den beschriebenen Parametern induzieren. Entfernen Sie nach der Stimulation vorsichtig Fische aus jedem Brunnen, indem Sie sie vorsichtig mit einer Plastikpipette ausspülen, und kehren Sie in einem frischen, tricainhaltigen Fischmedium in den Inkubator zurück.
Gießen Sie das Tritainwasser aus der Kammer weg und verwenden Sie eine Pinzette, um die Agarose aus jedem Brunnen zu schneiden und zu entfernen, spülen Sie die Brunnen mit Leitungswasser ab und lassen Sie sie trocknen. Für die Analyse der Muskelgröße, die als Vier-Schnitt-Methode bezeichnet wird, wurden XY- und YZ-Bilder von Zebrafischlarvenmuskeln erhalten und das Somitenvolumen berechnet. Es wurde eine starke Korrelation zwischen den vier Slice- und Full-Stack-Methoden beobachtet, obwohl die Four-Slice-Methode eine etwas größere Volumenschätzung ergab.
Die volumetrische Analyse der benachbarten Myotome der Somiten 16 und 18 ergab, dass jeder Somit etwa 7% größer war als der dahintere. Weitere Untersuchungen ergaben, dass eine Zwei-Schicht-Methode, die nur eine einzige YZ-Messung erforderte, eine einigermaßen genaue Schätzung des Myotomvolumens ergab. Das Myotom wuchs zwischen zwei und fünf Tagen nach der Befruchtung nachweisbar an Länge und Querschnittsfläche, was zu einer stetigen Zunahme des Volumens führte.
Muskeln, die zwischen dem dritten und vierten Tag nach der Befruchtung durch das Anästhetikum Tricain inaktiv wurden, hatten ein signifikant reduziertes Volumen, was darauf hindeutet, dass das Muskelwachstum der Larven aktivitätsabhängig war. Eine größere Variation in der Verringerung der Myotomgröße wurde bei der Messung des Myotomvolumens vier Tage nach der Befruchtung beobachtet, verglichen mit der Messung jedes einzelnen Fisches drei und vier Tage nach der Befruchtung. Dennoch wurde kein signifikanter Unterschied im Myotomvolumen zwischen beiden Methoden der Myotommessung beobachtet.
Die Messung der Anzahl der Fasern innerhalb des Myotoms sowie des durchschnittlichen Faservolumens zeigte, dass die Aktivität beide zellulären Aspekte des Wachstums steuert. Stellen Sie sicher, dass die Larven mit frisch zubereitetem Tricain vollständig betäubt sind. Eine Teilanästhesie würde zu einem variablen Ergebnis führen.
Wie wir wissen, reagieren Larven stärker auf elektrische Stimulation. Diese Methode, kombiniert mit nachgeschalteter Transkriptomik und pharmakologischen Experimenten, hat neue Erkenntnisse darüber geliefert, wie Force Sensing das Wachstum der Skelettmuskulatur antreibt.
