P2X7-Rezeptoren sind extrem vielseitig und funktionieren je nach Derase unterschiedlich. Auf diese Weise hat P2X7 verschiedene Funktionen und kann die Physiologie vieler verschiedener Systeme regulieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der drei Hauptfunktionen des P2X7-Rezeptors.
Es ist eine schnelle, reproduzierbare und quantifizierbare Methode, um seine Funktion zu verstehen. Unser Fokus darauf, wie P2X7-Rezeptoren in neuronalen Vorläuferzellen modulieren können. Diese Methode kann jedoch leicht an jeden Zelltyp angepasst werden.
Studenten, die genügend Literatur gelesen haben, bevor sie dieses Verfahren ausprobieren, können das an nur einem Tag lernen und können dies nach zwei oder drei Versuchen ganz allein ausführen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie neuronale Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dem Hippocampus erwachsener Mäuse erhalten, wie im Textprotokoll beschrieben. Halten Sie Kulturen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Neurosphären sollten sich nach sieben bis zehn Tagen bilden, ist die Passage Null subventrikuläre Zonenkultur und nach 15 bis 20 Tagen in der Hippocampuskultur. Nach der ersten Passage Null-Kultur-Phase, Passage alle sieben bis zehn Tage, je nach Bedarf mit einem biologischen Sicherheitskabinett und Standard-Gewebekultur-Praktiken. Durchdie Kugeln, wenn sie 150 bis 200 Mikrometer Im Durchmesser erreichen.
Sammeln Sie die Kugeln und Medium in einem 15 Milliliter Rohr und drehen Sie mit einer niedrigen Geschwindigkeit für zwei Minuten. Entfernen Sie das Medium und inkubieren Sie die Zellen mit Dissoziationsreagenz für sieben bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius, abhängig von der Größe der Kugeln. Schließlich zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
Wir suspendieren die einzelnen Zellen in einem Milliliter calciumfreiem Natriummedium. Dann laden Sie die Zellen mit zwei Ninigrammen pro Milliliter Kalziumindikator Farbstoff und 10 Mikroliter 5% Pluronsäure. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Waschen Sie die Zellen, indem Sie drei bis fünf Milliliter kalziumfreies Natriummedium hinzufügen und sanft zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen in kalziumfreiem Natriummedium wieder auf, waschen Sie ein zweites Mal. Die Zellen in einem Milliliter calciumfreiem Natriummedium wieder aussetzen.
Dann legen Sie die Zellen auf Eis und lassen Sie sie für 30 Minuten entestert. Waschen Sie die Zellen noch einmal, indem Sie drei bis fünf Milliliter Kaliummedium und Zentrifugieren wie bisher hinzufügen. Nach der Wiederaussetzung der Zellen in Kaliummedium, eliquate sie in fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS-Röhren mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro 500 Mikroliter pro FACS-Röhre.
Legen Sie die FACS-Röhren auf Eis, bis die Zellen zur Analyse bereit sind. Lassen Sie die Zellen nicht für einen längeren Zeitraum auf Eis, sondern beginnen Sie so schnell wie möglich mit dem Test. Bei einigen Proben die Zellen mit einem P2X7-Rezeptor-spezifischen Inhibitor vorinkubieren, wie im Textprotokoll beschrieben.
Wenige Minuten vor dem Ausführen der ersten Probe Kalziumchlorid zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen und das Rohr in ein 37 Grad Celsius Wasserbad legen, um sich zu erholen. Lassen Sie einen sauberen kleinen Magnetrührer in das FACS-Rohr fallen und positionieren Sie das Rohr im Zeitmodul, das mit einem zirkulierenden 37 Grad Celsius Wasserbad verbunden ist, um die Probentemperatur zu steuern. Wählen Sie eine niedrige Rührgeschwindigkeit, um die Bewegung der Probe zu gewährleisten, ohne einen Wirbeleffekt einzuführen.
Legen Sie den Wasserkrug und den Rohradapter auf die Probenplattform und schließen Sie den Hebelarm der FACS-Maschine. Initiieren Sie die Stichprobenerfassung, und führen Sie die Stichprobe drei Minuten lang mit etwa 1 000 Ereignissen pro Sekunde aus. Bei der 40-Sekunden-Marke entfernen Sie schnell das Rohr und fügen Sie den P2X7-Agonisten hinzu.
Entweder ein Millimolar ATP oder 300 Mikromolar BzATP. Dann ersetzen Sie die Röhre, um die Anschaffung fortzusetzen. Während der ersten Probe die Probe aufgezeichnet wird, bereiten Sie die zweite Probe mit Calciumchlorid vor.
Platzieren Sie es in 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen vor der Analyse aufwärmen können. Sobald die erste Probe fertig ist, reinigen Sie die Aufnahme, indem Sie eine Wasserprobe ausführen. Dann kann die Erfassung der zweiten Probe wie bisher beginnen.
Reinigen Sie die Aufnahme zwischen den Proben immer. Erstellen Sie eine Einzelzellensuspension wie bisher und sparen Sie ein paar Milliliter des konditionierten Mediums. Verwenden Sie das Medium, um die Zellen mit einer Konzentration von einer Million Zellen pro 100 Mikroliter pro FACS-Röhre wieder aufzuhängen und die Zellen auf Eis zu legen, bis sie fertig sind.
Vor dem Ausführen des Assays 900 Mikroliter Kaliummedium für ein Endvolumen von einem Milliliter hinzufügen. Legen Sie die Rohre in ein 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten zu erholen. Gegebenenfalls die Zellen mit Behandlungen einschließlich der P2X7-spezifischen Inhibitoren vorinkubieren.
Unmittelbar vor dem Ausführen des Assays 25 Mikromol-Ethidiumbromid in das FACS-Rohr geben. Dann fügen Sie den Magnetrührer hinzu, legen Sie das Rohr auf die FACS-Maschine und beginnen Sie die Erfassung wie zuvor. Um die Bildung von Poren in der Zellmembran zu induzieren, fügen Sie 40 Sekunden nach Beginn der Erfassung einen Millimolaren ATP oder 100 Mikromolar BzATP hinzu.
Führen Sie die Stichproben sechs Minuten lang mit etwa 1 000 Ereignissen pro Sekunde aus. Während die erste Probe läuft, nehmen Sie die zweite Probe aus dem Eis und legen Sie sie in das 37 Grad Celsius Wasserbad, um genügend Zeit für die Zellen zu ermöglichen, sich vor der Analyse zu erholen. Sobald die erste Probenerfassung abgeschlossen und die Aufnahme gereinigt wurde, kann die zweite Probe auf die Maschine gelegt werden, um mit der Aufnahme zu beginnen.
Wir suspendieren die einzelnen Zellen in konditioniertem Medium und setzen sie in FACS-Röhren mit einer Konzentration von mindestens einer Million Zellen pro 100 Mikroliter pro FACS-Röhre aus. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter mit Natriummedium und legen Sie die Zellen auf Eis, bis die Analyse durchgeführt wird. Verwenden Sie eine Mikron breite G-Perlen als phagozytische Ziele für Echtzeit-Phagozytose-Assays.
Bevor Sie die erste Probe ausführen, übertragen Sie die Zellen in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und inkubieren Sie sie für etwa sieben bis zehn Minuten, damit sich die Zellen erholen können. Fügen Sie alle Behandlungen, die eine Vorinkubation erfordern, zu ihren jeweiligen Röhrchen hinzu, einschließlich ATP, oxidiertem ATP, Cytokelisin D und 4%Paraformaldehyd. Für 5% humanes Serum ist keine Vorinkubation erforderlich.
Wenn Die Behandlungen ungefähr zur gleichen Zeit hinzugefügt werden, können die Proben nacheinander ausgeführt werden, während andere weiterhin inkubieren, weil ihre Inkubationszeiten variieren. Legen Sie die Probe mit dem Magnetrührer auf das Zytometer und initiieren Sie wie bisher die Probenaufnahme. Entfernen Sie das Probenrohr 15 bis 20 Sekunden nach Beginn der Erfassung von der Maschine und fügen Sie fünf Mikroliter unverdünnter YG-Perlen hinzu.
Geben Sie das FACS-Beispielrohr an das Gerät zurück und setzen Sie den Erwerb fort. Führen Sie die Stichproben sieben bis acht Minuten lang bei etwa 1 000 Ereignissen pro Sekunde aus. Während die erste Probe läuft, nehmen Sie die zweite Probe aus dem Eis und legen Sie sie in ein 37 Grad Celsius Wasserbad, damit sich die Zellen vor der Analyse erholen können.
Sobald die erste Probe fertig ist und die Aufnahme gereinigt wurde, beginnen Sie mit der Erfassung der zweiten Probe. Im Laufe der Zeit geplottet, war der Kalziumzufluss in den hippocampalen und subventrikulären Zonen-Neuralvorläuferzellen im Allgemeinen ähnlich. Agonisten wurden bei der 42. Marke hinzugefügt.
BzATP aktiviert schnell P2X7-Rezeptoren, öffnet den Ionenkanal und ermöglicht Kalziumzufluss, der an Fluo-8 und Fluoreszen bindet. ATP-Anwendung führt in der Regel zu einem allmählicheren Kalziumzufluss. Es hat eine geringere Affinität zu P2X7 im Vergleich zu BzATP und führt auch zu G-Protein gekoppelt Rezeptor Aktivierung.
Nach der Anwendung der ATP und BzATP des Agonisten erfasst die Zeit-Auflösungs-Flow-Zytometrie das Ethidiumbromid, das über Transmembranporen in die Zellen gelangt, in Echtzeit. Dieser Effekt wurde durch den P2X7-spezifischen Inhibitor abgeschwächt. ATP-Konzentrationsreaktionstests veranschaulichen die Auswirkungen der agonistischen Konzentration auf die P2X7-Porenbildung unter Verwendung von Veränderungen der Ethidiumbromidfluoreszenz im Laufe der Zeit.
Hier zeigt sich P2X7-Rezeptor-beteiligte Phagozytose durch hippocampale und subventrikuläre Zone neuronale Vorläuferzellen in Echtzeit. Als positiv erwiesen wurden die ungehemmten Phagozytosespiegel von YG-Latexperlen. ATP hemmte die Phagozytose von YG-Perlen im gleichen Maße wie die unspezifischen Inhibitoren, nämlich paraformaleDehydfixierung und der Aktinpolymerisationsinhibitor Cytokelisin D.5%serum, die alle angeborene Phagozytose abschafften.
Die Aufrechterhaltung einer gesunden Zellpopulation und die Verkürzung der Zeit auf Demeis ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Variabilität kann minimiert werden, indem der gleiche ATP-Batch für den gesamten Zelltest verwendet wird. Unser hier gezeigtes zeitliches Ergebnis der Durchflusszytometrie ist die einzige Meldung, die weiterhin Mengen für Ströme und Änderungen in einer gezielten Teilpopulation auswählen kann.
Alternative Methode ist ein Fluoreszenzmikroskop und ein Fluoreszenzplattenleser. Diese Methode kann jedoch aufgrund des fluoreszierenden Affinitätsprogramms keine kontinuierlichen Fluoreszenzänderungen messen. P2X7 ist einzigartig multimodal.
Die Entdeckung seines Ausdrucks auf einer Zelle von Interesse eröffnet eine Reihe einzigartiger Fragen, die die Ermittler erforschen können.
