Dieses Protokoll ist wichtig, weil es verwendet werden kann, um menschliche Skelettmuskel Xenografts zu schaffen, die verwendet werden können, um Muskelerkrankungen zu modellieren und präklinische therapeutische Tests durchzuführen. Dieses Xenograft-Modell ermöglicht es Forschern, menschliche Muskeln in vivo zu untersuchen, um die menschliche Muskelzellbiologie besser zu verstehen und neuartige Modelle für seltene oder erworbene Muskelerkrankungen zu entwickeln. Nach Erhalt einer menschlichen Muskelbiopsie, legen Sie die Probe in eine 100 x 15-Millimeter Petrischale mit Muskelmedium, und verwenden Sie ein Stereomikroskop und chirurgische Schere, um alle verbleibenden Faszien oder Fettgewebe zu entfernen.
Sezieren Sie die Muskelbiopsie in etwa sieben mal drei mal drei Millimeter, wobei darauf geachtet wird, dass die Fasern längs innerhalb der Probe angeordnet sind. Als nächstes die Petrischale mit dem sezierten Muskel auf Eis übertragen und synthetische, nicht resorbierbare Nähte in eine 100 mal 15 Millimeter lange Petrischale mit 70% Ethanol legen. Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifen in einer acht bis zwölf Wochen alten, anästhesierten NOD-Rag-Gamma-Maus, tragen Sie Salbe auf die Augen des immungeschwächten Tieres auf und verwenden Sie einen Trimmer, um das Haar zu entfernen, das das Tibialis vordem vom Knöchel bis zum Knie überragt.
Dann eine Minute lang Enthaarungscreme auf die exponierte Haut auftragen, bevor Sie die chirurgische Stelle mit Povidon-Jod-Lösung und 70% Ethanol desinfizieren. Um das menschliche Gewebe zu transplantieren, zuerst Band auf dem Mausbein, und machen einen geraden Schnitt über die tibialis vordere, die an den distalen Sehnen und endet unter dem Knie. Verwenden Sie stumpfe Sezierung, um die Haut vom Muskelgewebe zu trennen, und verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt von weniger als 0,5 Millimetern durch das Epimysium des tibialis vorderen Muskels zu machen, beginnend an der Sehne und endend am Knie.
Nach dem Schneiden der distalen Sehne des Tibialis vorder, greifen Sie die Sehne mit Iriszange, und ziehen Sie den Muskel in Richtung knie. Als nächstes schneiden Sie die distale Sehne des Extensor digitorum longus, und ziehen Sie den Extensor digitorum longus in Richtung Knie. Sobald die proximale Sehne des Peroneus longus Muskels sichtbar ist, entfernen Sie den Extensor digitorum longus und den Tibialis vorder mit der Schere.
Verwenden Sie ein chirurgisches Wischen nass mit PBS, um leichten Druck auszuüben, bis Hämostase erreicht ist, und fädeln Sie eine Naht durch die proximale Peroneus Longussehne, so dass ein etwa 1,5-Zoll-Gewinde auf beiden Seiten der Sehne. Machen Sie die erste Hälfte eines zweihändigen chirurgischen quadratischen Knotens ohne Anziehen, um einen Kreis zu bilden, und legen Sie ein Xenograft in den Kreis, Die Schleife anziehen, um das Transplantatgewebe zu sichern. Vervollständigen Sie die andere Hälfte des quadratischen Knotens, um das Xenograft an die proximale Sehne des Peroneus longus zu nähen, und fädeln Sie die Naht durch die distale Peroneuslongussehne, um die quadratische Knotentechnik an der distalen Sehne zu wiederholen.
Wenn beide Enden des Transplantats gesichert sind, ziehen Sie die Haut über den xenotransplantierten Muskel, versiegeln Sie den Schnitt mit chirurgischem Kleber und legen Sie zwei bis drei chirurgische Klammern über den Kleber. Legen Sie dann die Maus in einen sauberen Käfig auf einem beheizten Pad mit Überwachung bis zur vollen Recumbency. Vier bis sechs Monate nach der Operation einen abgedeckten Becher mit 200 Millilitern 2-Methylbutan mindestens 30 Minuten vor der Xenograft-Ernte in eine Dose Trockeneis geben.
Wenn das 2-Methylbutan abgekühlt ist, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen, und entfernen Sie das Haar, das den Tibialis vor dem Knöchel zum Knie mit einem Trimmer und enthaarter Creme überlagert. Die Nähte, die das Xenograft an Ort und Stelle halten, sollten durch die Haut beobachtet werden. Sichern Sie das Bein mit Klebeband, und verwenden Sie Scheren und Iriszange, um die Haut über dem Xenograft zu öffnen, bis beide Nähte aufgedeckt sind.
Verwenden Sie ein Skalpell zwischen dem Xenograft und der Tibia zu schneiden, um eine Seite des Xenograft vor dem Schneiden zwischen dem Peroneus longus Muskel und dem Magen-Darm-Muskel zu befreien. Schneiden Sie unter die distale Naht und durch die distale Sehne des Peroneus longus, und verwenden Sie die Iriszange, um die Naht zu greifen und in Richtung Knie zu lenken, während Sie eine Schere verwenden, um das Xenograft vom darunter liegenden Muskelgewebe wegzuschneiden. Dann verwenden Sie eine Schere, um über die proximale Naht zu schneiden, um den Xenograft und Peroneus longus zu entfernen, und legen Sie das geerntete Exemplar auf ein kleines Stück Pappe.
Pin das Gewebe so nah wie möglich an den Nähten, während sanft den Muskel dehnen, um sicherzustellen, dass die Faserausrichtung während des Snap-Freezing-Prozesses beibehalten wird. Wenn die Stifte sicher an Ort und Stelle sind, schieben Sie den Muskel die Stifte nach oben, so dass das Gewebe knapp über dem Karton ruht, und fangen Sie das Xenograft im vorgekühlten 2-Methylbutan für minus 80 Grad Celsius Lagerung einfrieren. Ein erfolgreiches Xenograft zeigt eine robuste Regeneration menschlicher Myofiber, die mit humanspezifischen Antikörpern identifiziert werden.
Positive embryonale Myosinfärbung innerhalb eines Anteils von Myofibers deutet darauf hin, dass der Regenerationsprozess noch im Gange ist. Im Gegensatz dazu kann eine schlechte Operationstechnik oder eine unzureichende Probe zu einer schlechten Regeneration der Muskelfasern führen. Xenografts, die von einem Patienten durchgeführt wurden, bei dem eine idiopathische entzündliche Myopathie diagnostiziert wurde, zeigen eine moderate Anzahl regenerierter menschlicher Myofiber bei vier- und sechsmonatigen Sammlungen, und die embryonale Myosinfärbung bleibt sechs Monate an.
Entzündliche Zellen sind auch innerhalb des Xenograft vorhanden, wie durch H und E Färbung beobachtet. Einzelne Myofibergrößen sind bei idiopathischen entzündungshemmenden Homöopathie-Xenografts zwischen vier und sechs Monaten ähnlich. Seltene Fasern mit einer Querschnittsfläche größer als 3, 500 Mikrometer im Quadrat werden innerhalb der Xenografts beobachtet, aber nicht in den idiopathischen entzündungshemmenden Myopathie-Biopsien, was darauf hindeutet, dass einige der Myofiber in den Xenografts sich zu einem Querschnittsbereich ähnlich in der Größe wie gesunde Myofiber regenerieren können.
Die wichtigsten Teile dieses Verfahrens sind die Identifizierung aller Sehnen im Knöchel nach dem ersten Schnitt und das erfolgreiche Durchschneiden des Epimysiums. Die funktionelle Kompetenz der Xenografts kann beurteilt werden, indem einzelne Myofiber enzymatisch isoliert und Kalziumtransienten getestet oder evozierte Zwangsmessungen nach elektrischer Stimulation durchgeführt werden.
