Diese Methode ermöglicht es, die Bildung von Proteinkomplexen zu untersuchen, die eine Koexpression für effiziente Testproben erfordern, wie z.B. die Bildung von Heterodimeren. Das Hauptpotenzial dieser Methode besteht darin, die Co-Expression von differentiell markierten untersuchten Proteinen unter Verwendung von Kombinationen kompatibler Vektoren zu nutzen, um eine effiziente komplexe Assemblierung sowie einen zeiteffizienten Arbeitsablauf und Skalierbarkeit zu fördern, die einen schnellen Patch-Test mehrerer Interaktionen ermöglichen. Diese Methode kann auch für ein schnelles Screening optimaler Proteinexpressions- und Aufreinigungsbedingungen verwendet werden.
Die visuelle Demonstration hilft bei der korrekten Durchführung kritischer Schritte des Protokolls, wie z. B. Co-Expression-Setup, Zellaufschluss und nachfolgende Pulldown-Schritte. Um zu beginnen, züchten Sie den Stamm Escherichia coli BL21 (DE3) in Luria-Bertani- oder LB-Medien bei 37 Grad Celsius auf eine optische Dichte (OD) von 0,1 bis 0,2. Zentrifugieren Sie einen Milliliter der Bakteriensuspension für eine Minute bei 9.000 G bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Fügen Sie dann 0,5 Milliliter eiskalten Transformationspuffer (TB) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang auf Eis. Am Ende der Inkubation 30 Sekunden lang bei 8.000 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter TB-Puffer und 100 Nanogramm jedes Vektors hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis.
150 Sekunden auf 42 Grad Celsius erhitzen, dann eine Minute auf Eis kalt stellen. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter LB-Medien ohne Antibiotika hinzu und inkubieren Sie 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird das Pellet in 100 Mikrolitern LB-Medien zentrifugiert und resuspendiert, bevor die Suspension auf eine LB-Agarplatte aufgetragen wird, die 0,5% Glucose und entsprechende Antibiotika enthält.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie am nächsten Tag die Zellen von der Platte mit zwei Millilitern LB-Medien in 50 Milliliter LB-Medien mit entsprechenden Antibiotika. Fügen Sie Metallionen oder andere bekannte Co-Faktoren hinzu, bevor Sie ein Aliquot mit 20% Glycerin bei minus 70 Grad Celsius für nachfolgende Experimente lagern.
Züchten Sie die Zellen mit einer konstanten Rotation von 220 U / min bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD von 0,5 bis 0,7. Kühlen Sie die Kultur auf Raumtemperatur ab und fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von einem Millimol hinzu. Lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension als Kontrolle der nicht induzierten Probe.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 220 U/min bei 18 Grad Celsius. Teilen Sie die bakterielle Suspension am nächsten Tag in zwei Teile und lagern Sie 20-Mikroliter-Aliquots, um die Proteinexpression zu bestätigen. Zentrifugieren Sie die verbleibende Zellsuspension bei 4.000 G für 15 Minuten.
Für den Pulldown-Assay resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer mit Proteasehemmern und Reduktionsmitteln, die unmittelbar vor dem Experiment zugesetzt wurden. Passen Sie die Pufferzusammensetzung für die getesteten Proteine an. Brechen Sie die Zellen durch Beschallung auf Eis auf und lagern Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot für die Elektrophorese.
Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 16.000 G und sammeln Sie 20 Mikroliter des geklärten Lysats für die Elektrophorese. Das Harz 10 Minuten lang mit einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer ausgleichen, dann 30 Sekunden lang bei 2.000 G zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Fügen Sie dem Harz Zelllysate hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei einer konstanten Drehung von 15 U / min.
Zentrifugieren und verwerfen Sie dann den Überstand, bevor Sie 20 Mikroliter der ungebundenen Fraktion zur Analyse sammeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter eiskalten Waschpuffer hinzu und inkubieren Sie ihn eine Minute lang. Nochmals zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
Führen Sie dann zwei lange Wäschen mit eiskaltem Waschpuffer durch. Nach dem zweiten Waschen eluieren Sie die gebundenen Proteine mit 50 Mikrolitern des Elutionspuffers in einem Shaker bei 1.200 U / min bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Analysieren Sie die eluierten Proteine mit der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Studien zur Zinkfinger-assoziierten Domäne (ZAD), zur Homodimerisierung in Maltose-bindendem Protein (MBP) und zu 6xHistidin-Pulldown-Assays werden hier gezeigt. Die Koexpression von MBP- und Thioredoxin-6xHistidin-fusionierten ZADs zeigt eine gute und reproduzierbare Homodimerisierungsaktivität und erscheint als zusätzliche Bande in den SDS-PAGE-Ergebnissen des MBP-Pulldown-Assays. Ein weiteres Beispiel für die Verwendung der Methode zur Untersuchung alternativer Komplexbildung wird hier gezeigt.
Im Co-Expressions-Assay interagierte 6xHistidin-markiertes ENY2 sowohl mit GST-markiertem Sgf11 als auch mit MBP-CTCF, aber in den MBP-Pulldowns war kein GST-Sgf11 vorhanden und umgekehrt. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Vergleich der erforderlichen Zeitintervalle im Workflow des konventionellen Pulldown-Assays im Vergleich zum Pulldown in Verbindung mit der Koexpression gezeigt. Die Ergebnisse der Verwendung beider Techniken zur Untersuchung der gleichen Interaktion zwischen der BTB-Domäne des CP190-Proteins und der GST-markierten C-terminalen Domäne des Drosophila-CTCF-Proteins werden hier gezeigt.
Die richtige Wahl des Affinitäts- und Löslichkeitstests, Thioredoxin, GST oder MBP, ist entscheidend für die effiziente Durchführung des Assays. Ein weiterer wichtiger Schritt ist der schnelle und gleichmäßige Zellaufschluss. Es wird dringend empfohlen, Ultraschallsonden mit mehreren Spitzen zu verwenden.
Diese Methode ermöglicht die direkte Untersuchung der Heterodimerbildung zwischen Proteindomänen, die sonst Homodimere bilden, die während der Inkubation gereinigter Proteine im herkömmlichen Pulldown-Assay nicht dissoziieren würden.
