Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum schnellen Screening von Tausenden von Genomen mit F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien. Diese Technik ist vorteilhaft in ihrer Zugänglichkeit. Anstelle von teuren, spezialisierten sequenzierungsbasierten Ansätzen verwendet unsere Methode PCR-Restriktionsenzyme und Gelelektrophorese, um männliche F0-Träger auf Indels oder spezifische Genom-Editierungen zu untersuchen.
Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist es, die Spermien schnell zu bekommen, aber es wird zu einer guten Technik für die In-vitro-Fertilisation, wenn wir mit vielen dysmorphen Fischen arbeiten, und so ist es eine einfache Möglichkeit für uns, Fische zu kreuzen, die uns Probleme bereiten. Beginnen Sie mit dem Aufstellen von Zuchtbecken sowohl für den Wildtyp als auch für F0-Fische und bebrüten Sie die Becken über Nacht. Nachdem Sie den männlichen Fisch am nächsten Tag betäubt haben, verwenden Sie einen geschlitzten Löffel, um ihn auf einen Stapel sauberer Papiertücher zu übertragen.
Rollen Sie den Fisch vorsichtig, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Entfernen Sie jegliches Wasser, indem Sie es mit einem sauberen, gefalteten Taschentuch trocken tupfen. Übertragen Sie den Fisch mit dem Schaumlöffel auf den vorbereiteten Biskuit.
Legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben und tupfen Sie den Bereich um die Afterflossen vorsichtig mit einem sauberen, gefalteten Seidenpapier ab. Um das Sperma zu sammeln, verwenden Sie einen Kapillarschlauch, um die Beckenflossen sanft von der Mittellinie weg zu bewegen und die Kloake freizulegen. Platzieren Sie das Kapillarrohr in der Nähe der Kloake.
Drücken Sie mit den Fingern oder einer Filterzange vorsichtig die Seiten des Fisches von den Kiemen abwärts zusammen. Sammeln Sie die Spermien mithilfe der Kapillarwirkung im Röhrchen und geben Sie sie in ein PCR-Röhrchen, das 40 Mikroliter 50 millimolare Natronlauge enthält, und stoßen Sie die Probe dann in das Röhrchen aus. Nachdem Sie die Spermaproben in einer Minizentrifuge gedreht haben, legen Sie die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler.
Lassen Sie den Cycler laufen, indem Sie die Proben 40 Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen und anschließend auf 25 Grad Celsius abkühlen. Nachdem Sie die Proben aus dem Cycler entnommen haben, neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 10 Mikroliter eines molaren Trishydrochlorids mit einem pH-Wert von acht hinzufügen. Mischen Sie durch Ansaugen der Suspension und zentrifugieren Sie dann die Proben.
Stellen Sie den Thermocycler zum Vorheizen auf 95 Grad Celsius ein. Bereiten Sie in der Zwischenzeit für jede Spermaprobe 25 Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung vor. Mischen Sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren, und drehen Sie dann die Proben.
Legen Sie die Proben in den vorgeheizten Thermocycler und stellen Sie den Zyklus ein. Um eine Gellösung zu erhalten, erhitzen Sie eine 4%ige Agarose-Gellösung, die durch Mischen von Agarosepulver, Gelfärbung und FSME-Puffer hergestellt wird, in der Mikrowelle. Gießen Sie die Gellösung in einen Gelgussrahmen und führen Sie auf einer Seite einen Kamm ein.
Entfernen Sie den Kamm nach der Gelverfestigung vorsichtig. Platzieren Sie das Gel so in einem Elektrophorese-Rig, dass die Vertiefungen der negativen Elektrode am nächsten sind. Gießen Sie den TBE-Laufpuffer in das Bohrgerät, bis die Bohrlöcher vollständig untergetaucht sind.
Beginnen Sie mit dem Laden des Gels, indem Sie fünf Mikroliter DNA-Leiter in die erste Vertiefung pipettieren. Befüllen Sie die restlichen Wells mit 5 bis 10 Mikrolitern des PCR-Produkts. Lassen Sie das Gel 1 Stunde lang bei 150 Volt laufen, um eine ausreichende Trennung der Amplikone zu gewährleisten.
Verwenden Sie den Gel-Imager, um die DNA-Banden anzuzeigen. Die p2ry12-Locusanalyse zeigte, dass das Wildtyp-Amplikon ein einzelnes Band von 250 Basenpaaren Länge aufwies, während die F0-injizierten männlichen Amplikons, die Indels enthielten, als mehrere Banden liefen. Die DNAH10-Locusanalyse zeigte, dass Wildtyp-Amplikon als einzelnes langes Band mit 400 Basenpaaren läuft.
F0-injizierte männliche Amplikons, die Indels enthielten, liefen als mehrere Banden oder als einzelne Bande mit verminderter Gelbeweglichkeit. Die F0-injizierte männliche Nummer eins hatte eine zusätzliche Bande im verdauten Produkt, die im PCR-Produkt fehlte, was sie zum besten Gründerkandidaten für die Etablierung von Mutanten-Knock-in-Linien machte. Wenn ein männlicher Fisch beim Zusammendrücken kein Sperma produziert, ist es am besten, den Fisch eine Woche lang auszuruhen und es erneut zu versuchen, anstatt ihn zu fest zu quetschen und zu riskieren, ihn zu verletzen.
Sobald der FC oder männliche Gründer ausgekreuzt ist, müssen die Allele in den F1-Nachkommen sequenziert werden. Die direkte Sequenzierung der F1-Amplikons und die Durchführung einer heterozygoten Allelanalyse ist eine einfache Möglichkeit, dies zu tun.
