Name: novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology at JoVE.com

Wir danken Prof. Jeff Gerst und Boris Slobodin für ihre hilfreiche Ratschläge bei der schnellen Protokoll der Einrichtung und Bereitstellung der erforderlichen Plasmide. Wir danken auch Dr. Avigail Atir-Lande für ihre Hilfe dieses Protokoll und Dr. Tamar Ziv vom Smoler Proteomics Zentrum für ihre Hilfe bei der LC-MS / MS-Analyse zu etablieren. Wir danken Prof. TG Kinzy (Rutgers) für den YEF3 Antikörper. Diese Arbeit wurde durch Gewährung 2011013 vom Binationale Science Foundation unterstützt.

Hinweis: eine Sequenz einfügen, bestehend aus 12 MS2-Bindungsstellen (MS2 Schleifen; MS2L) in den genomischen Locus gewünschten, in der Regel zwischen dem offenen Leserahmen (ORF) und der 3&#39;-UTR. Ein detailliertes Protokoll für diese Integration wird an anderer Stelle 22 vorgesehen. Stellen Sie sicher , die richtige Insertion und Expression durch PCR, Northern - Analyse oder RT-PCR 20,23. Es ist wichtig zu überprüfen, dass die Integration nicht mit der Synthese des 3&#39;-UTR nicht beigetreten sind. Zusätzlich kann ein Plasmid-exprimierenden MS2-CP zu SBP unter der Expression eines induzierbaren Promotors (Methionin Depletion) fusioniert sollte auch in die Zellen 24 eingeführt werden. Ein identischer Stamm, mit Ausnahme der eingeführten MS12 Schleifen sollte als Kontrolle für den Nachweis von nicht-spezifischen Signalen verwendet werden. 1. schnelle Reinigung <ol><li> Wachsen 500 ml Hefezellen (verwenden 250-1,000 ml Hefezellen in Abhängigkeit von dem Expressionsniveau des Gens von Interesse) Exprimieren MS2-markierten mRNA 20 undMS2-CP-GFP-Fusionsprotein SBP 24 bis OD600 von 0,8 bis 1,0 bei 30 o C in dem geeigneten Wachstumsmedium (zB synthetische Dextrose (SD) selektives Medium). </li><li> Centrifuge Zellen bei 3000 × g für 4 min bei RT und den Überstand verwerfen. </li><li> Waschen Zellen in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zentrifugieren wie zuvor (Schritt 1.2), Resuspendieren in einem gleichen Volumen (Schritt 1.1) von SD ohne Methionin und Inkubation für 45 - 60 min bei 30 o C Expression der MS2 zu induzieren -CP-GFP-SBP-Fusionsprotein. Hinweis: Längere Induktionszeit-Aggregation von GFP führen kann. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ml Zellen und Extrahieren von RNA aus dieser Probe 25 das einfache &quot;hot Phenol&quot; Methode. Achtung: Phenol ist sehr giftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitshinweisen behandelt werden. Hinweis: Diese RNA für die Qualität der isolierten RNA (1A) eine gute Referenz. </li><li> Für 500 ml Zellen, fügen 1,35 ml 37% Formaldehyd zu einem endgültigen cONZENTRATION von 0,1%, um die RNA-Protein-Komplexe zu vernetzen. Weiterhin Inkubation bei 30 o C für 10 min. Vorsicht: Formaldehyd ist hochgiftig und sollte entsprechend seiner Sicherheitsanweisungen gehandhabt werden. </li><li> Hinzufügen 26,5 ml 2,5 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M und Inkubation für 3 min Vernetzung zu stoppen. Von diesem Schritt auf, alles auf Eis gelegt RNA-Abbau zu minimieren. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 3.000 × g für 4 min bei 4 ° C und Waschen mit 45 ml kaltem 1x PBS. </li><li> Die Zellen in 1 ml Lysis-Puffer RaPID pro 100 ml der ursprünglichen Zellkultur. </li><li> Geteilt in Aliquots von 500 ul in Schraubdeckelröhrchen Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie ~ 400 mg gekühlten Glasperlen zu jedem aliquoten Teil (etwa eine volle 0,2 ml PCR-Röhrchen). </li><li> Lyse-Zellen in einem Wulst 3 min Beater. Sofort legte das Lysat auf Eis. Hinweis: Die Zelllyse Releases zelluläre RNasen, die die Hauptursache für RNA-Abbau sind. RaPID Lysis-Puffer enthält eine hohe Konzentration von RNase INHIsteller, wie die unspezifische RNase Inhibitor Heparin und spezifische Inhibitoren. Arbeiten schnell und halten alles kalt wird auch empfohlen. </li><li> Übertragen Sie das Lysat in neue Röhrchen. Pierce ein kleines Loch in der Unterseite jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer heißen Nadel (0,8 mm x 40 mm) und legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen auf der 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie den Kopf einer 5-ml-Spritze als Adapter zwischen den Mikrozentrifugenröhrchen und den 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen Montage bei 3000 × g für 1 min bei 4 o C </li><li> Übertragung der Durchfluss von der 15 - ml - Röhrchen in ein neues 1,5 - ml - Röhrchen und zentrifugiert bei 10.000 xg für 10 min bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Pool Stände aus allen 1,5-ml-Röhrchen in einem einzigen 15-ml-Röhrchen und beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Protein Isolation bzw. eingestellt. Hinweis: Diese als &quot;Input&quot; Proben für die nachfolgende Analyse dienen wird (Abbildung 1). </li><li> In 300 ug Avidin pro 500 ml initial Hefekultur und inkubiere für 30 min (dies auf 10 min reduziert werden können) bei 4 ° C unter konstantem Walzen (10 rpm). Hinweis: Avidin- Blöcke Biotin und biotinylierte Proteine ​​aus den Streptavidin-Kügelchen binden. </li><li> Vorwäsche die Streptavidin-Kügelchen vor der Inkubation mit dem Zelllysat. <ol><li> Übertragen etwa 300 ul der Streptavidin-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Gülle und die obere Überstand zu entfernen. Dies wird in 250 &amp; mgr; l der Kügelchen führen. Waschen der Kügelchen zweimal mit 1 ml Lysepuffer RaPID. Zentrifugieren Sie die Streptavidin - Kügelchen bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C zwischen jedem Schritt. </li><li> Blockieren die Perlen durch Inkubation für 1 h mit 0,5 ml RaPID Lysispuffer, 0,5 ml 10 mg / ml BSA und 10 ul 10 mg / ml Hefe-tRNA. Perlen können O / N in Blockierungslösung bei 4 ° C unter Rotation bei Bedarf gelassen werden. </li><li> Wasche zweimal mit 1 ml Lysis-Puffer RaPID. Hinweis: Die Magnetkügelchen können auch zur Verringerung der Zeit und backgr verwendet werdenound. Diese haben jedoch geringere Kapazität als Sepharosebeads. </li></ol></li><li> Nach Eintragen von 250 ul der vorgewaschenen Streptavidin-Kügelchen mit dem Avidin enthaltenden Lysat (aus Schritt 1.14) und inkubiere 1 h bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). Anmerkung: Diese Inkubationszeit ist ein Kompromiß zwischen einer ausreichenden Bindungszeit Bereitstellung und minimiert die Chancen für die RNA-Abbau. </li><li> Zentrifuge bei 660 × g für 2 min bei 4 ° C die Streptavidin - Kügelchen zu löschen und den Überstand in ein neues 15 - ml - Röhrchen übertragen. Beiseite 1/50 und 1/100 Volumen des Lysats für RNA und Proteinisolierung sind. Hinweis: Diese werden die &quot;Unbound&quot; Proben sein. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Lysepuffer, leicht schütteln, Transfer in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge wie in Schritt 1.17. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Waschen Sie die Perlen mit 1 ml RaPID Waschpuffer, und dieser Zeit drehen (10 Umdrehungen pro Minute) für 5 min bei 4 ° C. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li&gt; <li> Waschen der Kügelchen mit 1 ml 1x PBS und zentrifugiert wie oben beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Perlen wieder mit 120 ul 1x PBS. Zentrifuge nach oben, und nehmen Sie die gesamte Überstand für die RNA-und Proteinextraktion als &quot;Wash&quot; Probe. Hinweis: Diese letzte Waschprobe die Stringenz der Wäschen zeigen werden und sollte als die Elution Probe des gleichen Volumens sein. Dies wird die Verarbeitung und das Laden in den nachfolgenden Tests vereinfachen. </li><li> Zu eluieren, RNA und RNA-assoziierten Proteine ​​aus der Säule, Zugabe von 120 ul 6 mM Biotin in 1x PBS und Inkubation für 45 min bei 4 ° C mit konstanter Rotation (10 rpm). </li><li> Zentrifugieren Sie die wie oben Perlen und übertragen das eluierte Material in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Drehen Sie die eluierten Probe erneut und übertragen Sie die obere Phase in ein neues 1,5-ml-Röhrchen keine Verschleppung von Perlen zu gewährleisten. </li><li> Nehmen Sie Proben für die RNA oder Proteinextraktion. Hinweis: genommen Das Volumen auf dem folgenden Assay und Expressionsniveau des RNA oder Protein von Interesse abhängen. Als Richtwert für die Northern - Analyse 26, nehmen 80% der Probe für Western - Blot 23,27 oder RT-PCR 28, 20% nehmen, und für 29 Massenspektrometrie neue Proteine zu entdecken, die gesamte Probe nehmen. </li></ol> 2. RNA-Extraktion <ol><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Crosslinking Reversal Puffer und Inkubation für 45 min bei 65 ° C. Fahren Sie direkt zur RNA-Extraktion. Hinweis: Das Crosslinking Reversal Puffer enthält Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), die deutlich RNA - Extraktion 20 verbessert. </li><li> Verwenden Sie die Standard - Phenol: Chloroform - Methode 26 bis RNA aus dem &quot;Input&quot; zu extrahieren und &quot;ungebunden&quot; Proben (Schritte 1.13 und 1.17). Anmerkung: Diese Proben enthalten eine große Menge des RNase - Inhibitors Heparin, das nachfolgende Rück Transcriptase- (RT) unter Verwendung von Assays inhibieren können (zB RT-PCR), also 30 LiCl Fällung empfohlen wird , sie zu entfernen. Die &quot;wash &quot;und&quot; Elution &quot;Proben (Schritte 1.21 und 1.24) enthalten geringe Mengen an RNA und werden durch die folgenden Schritte gefällt. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von 8 M Guanidinium-HCl (GuHCl) und zwei Volumina 100% Ethanol zum &quot;Waschen&quot; und &quot;Elution&quot; Proben. Inkubieren bei -80 ° C für mindestens 2 Std. Hinweis: Guanidinium effizient Proteine ​​denaturieren und dadurch hemmen RNasen und Proteasen, die in der Probe. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g, 4 ° C für 30 min und den Überstand verwerfen. Waschen des Pellets mit kaltem 80% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 × g, 4 ° C für 15 min. </li><li> Man löst das RNA-Pellet in 400 ul RNase freies Wasser und fallen wieder alle übrig gebliebenen GuHCl oder andere Verunreinigungen zu entfernen. Werden 40 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 800 ul 100% Ethanol, Inkubation bei -20 ° C für mindestens 1 Std. </li><li> Zentrifuge und waschen, wie in Schritt 2.4 und alle Ethanol mit einer 10 &amp; mgr; l Spitze zu entfernen. Resuspendieren RNA Pellet in 10 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser. Seien Sie besonders vorsichtig, wie das RNA-Pellet in der Regel nicht sichtbar ist. Hinweis: Die Proben können für Northern - Analyse verwendet werden , wie in 23 (Abbildung 1) beschrieben. </li></ol> 3. Proteinpräparat für Western Blot oder Massenspektrometrie-Analyse <ol><li> Hinzufügen 1/3 Volumen von 4x Laemmli Probenpuffer (LSB) auf Proteinproben und inkubiere 45 min bei 65 ° C die Vernetzung von RNA und Proteine ​​umzukehren. Anmerkung: Die Proben können bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Führen Proteine auf einem SDS - Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) 31. Den Prozent des Gels entsprechend der Größe der Proteine ​​analysiert werden. Anmerkung: 10% Acrylamid-Gel gibt eine breite Palette von Trennung und ist gut als erste Näherung. </li><li> Transferproteine an die Membran , wie in dem Standard - Immunoblot - Analyse 27 zur Steuerung der Isolationswirkungsgrad (1C). Fleck mit entweder Coomassie Blau R250 oder Silberfärbung vor der Massenspektrometrie-Analyse. Anmerkung: Silberfärbung die bevorzugte Wahl, da sie empfindlicher ist , und ermöglicht eine bessere Erkennung (1B). Die Färbung kann entweder mit manuell hergestellten Lösungen oder kommerziellen Kits durchgeführt werden. Die Inkubationszeit des Gels in der endgültigen Färbelösung sollte experimentell bestimmt werden. Lange Inkubation kann niedrig reichlich Proteine ​​zeigen, kann aber stark exprimierten Proteine ​​wie MS2-CP-SBP-GFP führen über gefärbt sein und kann rund um Proteine ​​in ihrer Umgebung verschleiern. Darüber hinaus könnte ein hoher Hintergrund auftreten. Folgen Sie der Reaktion sorgfältig und fügen Stopplösung zu gegebener Zeit. </li><li> Schneiden Sie Banden aus dem Gel und sie auf 1,5-ml-Röhrchen. Proben bei -20 ° C, oder zur Proteinextraktion und Trypsin - Verdau durch LC-MS / MS - Analyse 32 gefolgt senden. </li><li> Als Alternative Proteom-Ansatz, um die Gel-Trennungsschritt auszuschließen, verdauen eluierte Material aus Schritt 1.24 in solution unter Verwendung von Trypsin und vorbehaltlich der LC-MS / MS - Analyse 33. Hinweis: Das Weglassen des SDS-PAGE-Trennung das Protokoll vereinfacht und erhöht die Ausbeute. Jedoch könnten Proben Spuren des Detergens enthalten, NP-40, der Massenspektrometrieanalyse hemmt. Um dieses Problem zu lösen, führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Führen Protein auf SDS-PAGE 31 10 - 15 min. </li><li> Schneiden Sie den gesamten Abschnitt der Spur aus (dh wo die Proteine befinden). Hinweis: Die Proteinprobe kann eine erhebliche Menge des MS2-CP-SBP-Protein umfassen, die Signale mit niedriger Abundanz Proteine ​​verdunkeln kann. </li></ol></li></ol>

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L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+(1D+SDS-PAGE).">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li><li>Gundry, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+proteins+and+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+a+bottom-up+proteomics+workflow.">Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 10, Unit 10.25 (2009).</li><li>Medzihradszky, K. 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F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. 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The authors declare no competing financial interests.

Verschiedene Methoden verwenden , um die Isolierung von spezifischen mRNAs ihre zugehörigen Proteine 11,34 35 zu identifizieren. Diese Verfahren gelten in vitro und in vivo - Strategien RNA-Protein - Wechselwirkungen zu untersuchen. In - vitro - Verfahren inkubieren exogen RNA mit Zelllysat transkribiert RBPs zu erfassen und RNP - Komplexe 36,37 isolieren. Ein wirksames Konzept dieser Art wurde kürzlich vorgestellt, die die Identifizierung neuer Prot...

RNA-bindende Proteine (RBPs) stellen etwa 10% der S. cerevisiae Proteine 1,2 und etwa 15% von Säugetierproteinen 3-5. Sie sind in vielen zellulären Prozessen wie mRNA posttranskriptionales Verarbeitung und Regulation, Übersetzung, Ribosomenbiogenese, tRNA-Aminoacylierung und Modifikation, Chromatin-Remodeling beteiligt, und vieles mehr. Eine wichtige Untergruppe von RBPs ist die mRNA-bindende Proteine (mRNPs) 6,7. Im Zuge der mRNA Reifung, binden verschiedene RBPs das Transkript und vermitteln ihre Kern Verarbeitung, Export aus dem Zellkern, zelluläre Lokalisation, Übersetzung und Abbau 6-8. Somit bestimmt die unterschiedliche Menge von RBPs auf ein bestimmtes Transkript zu jedem Zeitpunkt verpflichtet, ihre Verarbeitung und letztlich sein Schicksal. Die Identifizierung von RBPs mit einer mRNA verbunden sind, könnten unser Verständnis der Prozesse zugrunde liegen, ihre Post-Transkriptionsregulation verbessern. Diverse genetischeWurden in mRNA Regulation beteiligten Proteine zu identifizieren (in 9-11 prüft), mikroskopische, biochemische und bioinformatische Methoden verwendet. Jedoch nur wenige dieser Verfahren ermöglichen die Identifizierung von Proteinen mit einer bestimmten Ziel-mRNA assoziiert. Bemerkenswert ist die Hefe-Drei-Hybrid-System (Y3H), die die mRNA von Interesse als Köder verwendet eine Expressionsbibliothek in Hefezellen zu screenen. Positive Klone werden in der Regel durch eine Wachstumsselektion oder Reporterexpression 12-14 beobachtet. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die große Anzahl von Proteinen, die in einer zellulären Umgebung und die Fähigkeit, abgetastet werden kann, die Festigkeit des RNA-Protein-Wechselwirkung zu messen. Nachteile sind die relativ große Anzahl an falsch positiven Ergebnissen aufgrund der unspezifischen Bindung, und das hohe Potenzial für falsch negative Ergebnisse darauf zurückzuführen, zum Teil auf Fehlfaltungen des Fusionsproteins Beute oder der Köder-RNA. Eine Alternative zur genetischen Ansatz ist Affinität purifiKation RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Poly A enthaltenden mRNAs kann durch die Verwendung von Oligo-dT-Säulen isoliert werden, und deren assoziierte Proteine ​​durch Massenspektrometrie detektiert werden. Die RNA-Protein-Wechselwirkung in seinem zellulären Kontext durch Vernetzung erhalten, die Kurzstrecken-kovalente Bindungen macht. Die Verwendung der Oligo - dT - Säule ergibt eine globale Sicht auf die gesamte Proteom , die mit jeder Poly - A-haltige mRNA 3,5,15 zugeordnet ist. Allerdings bedeutet dies nicht eine Liste von Proteinen bereitzustellen, die mit einer bestimmten mRNA assoziiert sind. Nur sehr wenige Methoden zur Verfügung, eine solche Identifikation zu erreichen. Das Paar Verfahren beinhaltet die Transfektion von Nukleinsäure mit Komplementarität zum Ziel - mRNA 16,17. Die Nukleinsäure wird auch an ein Peptid gebunden, das in der Nähe des Interaktionsstelle zu RBPs Vernetzung ermöglicht. Nach der Vernetzung kann das RBP-Peptid-Nukleinsäure isoliert und Proteomik-Analyse unterzogen werden. Vor kurzem wurde ein Aptamer-basierte Methodikerfolgreich angewendet 18 aus Säugerzelllinien extrahiert. Ein RNA-Aptamer mit verbesserter Affinität an Streptavidin wurde auf eine Sequenz von Interesse (AU-rich Element (ARE) in diesem Fall) entwickelt und aufgeschmolzen. Das Aptamer-ARE-RNA wurde an Streptavidin-Kügelchen und gemischt mit Zelllysat angebracht. Proteine, die mit der ARE-Sequenz zugeordnet wurden gereinigt und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Obwohl dieses Verfahren Verbände detektiert , die außerhalb der zellulären Einstellungen auftreten (dh in vitro), ist es wahrscheinlich in der Zukunft modifiziert werden , um die Aptamere in das Genom einzuführen und somit die Isolierung von Proteinen mit der mRNA , während in der zugeordneten Freigabe Zellmilieu (dh in vivo). In Hefe, wo genetische Manipulationen gut etabliert sind, bietet die schnelle Methode (entwickelt von Prof. Jeff Gerst Labor) eine Ansicht der in vivo - Vereinigungen 19. RaPID kombiniert die spezifische und starke Bindung des MS2-Hüllprotein (MS2-CP) an die MS2-RNA-Sequenz und der Streptavidin-Bindungsdomäne (SBP) konjugierte Kügelchen an Streptavidin. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von MS2-markierten mRNAs durch Streptavidinkügelchen. Darüber hinaus wird die Expression von 12 Kopien von MS2-Schleifen können bis zu sechs MS2-CPs bis gleichzeitig an die RNA binden und die Effizienz seiner Isolation zu erhöhen. Dieses Protokoll wurde daher vorgeschlagen, die Identifizierung neuer mRNA-assoziierten Proteinen zu ermöglichen, sobald die eluierten Proben Proteomik-Analyse durch Massenspektrometrie unterzogen werden. Wir RaPID kürzlich verwendet , um neue Proteine zu identifizieren mit der Hefe assoziiert PMP1 mRNA 20. PMP1 mRNA wurde zuvor gezeigt , mit der ER - Membran und dessen 3&#39; - untranslatierten Region (UTR) wurde 21 in diesem Verband eine wichtige Determinante erwiesen assoziiert. So RBPs die PMP1 3 &#39;UTR binden , sind wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Lokalisierung zu spielen. RaPID gefolgt von Flüssigkeitschromatographeny-Massenspektrometrie / Massenspektrometrie (LC-MS / MS) führte zur Identifizierung vieler neuer Proteine , die mit PMP1 20 interagieren. Wir berichten hier über ein detailliertes Protokoll der Methodik RaPID bieten, wichtige Kontrollen, die getan werden müssen, und technische Tipps, die Ausbeute und Spezifität verbessern kann.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RaPID ermöglicht die Isolierung einer spezifischen Ziel-RNA mit seinen assoziierten Proteinen. Kritisch für den Erfolg hält die RNA intakt, so viel wie möglich, wodurch eine ausreichende Menge der Proteine ​​zu erhalten. Um die Isolation Effizienz und Qualität der RNA, Northern - Analyse durchgeführt (Abbildung 1A) bestimmen. Die Northern-Analyse hat den Vorteil, unmittelbar auf die Effizienz und die Qualität der raschen Meldung. Somit können die relativen Me...

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Aufrufe.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

Serie: Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Krebsforschung

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Genetik

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologie

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57516">Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. ...

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Zusammenfassung

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Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA