Die Autoren bedanken sich sehr für die Unterstützung durch die Auszeichnungen des Biotechnology and Biological Sciences Research Council BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) und BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) sowie des Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories Award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Die Daten zu dieser Veröffentlichung sind unter folgender Adresse verfügbar: 10.25405/data.ncl.22232452. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet.

1. Zelllysatpuffer und Medienvorbereitung
<ol><li>Herstellung von 2x YT+P Agar und Medium<ol><li>Bereiten Sie 2x YT+P-Agar vor, indem Sie 16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22mL/L 1 M KH2PO4 und 15 g/L Agar abmessen. Für die 2x YT+P Brühe die vorherige Zusammensetzung befolgen, aber den Agar weglassen.</li>
		<li>Sterilisieren Sie durch Autoklavieren der 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des S30A-Puffers<ol><li>Bereiten Sie den S30A-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat, 12,195 g/L K-Glutamat und 25 ml/L 2 M Tris vor, eingestellt auf pH 7,7 mit Essigsäure.</li>
		<li>Lagern Sie den S30A-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des S30B-Puffers<ol><li>Bereiten Sie den S30B-Puffer mit 5,88 g/L Mg-Glutamat und 12,195 g/L K-Glutamat vor, eingestellt auf pH 8,2 mit 2 M Tris.</li>
		<li>Lagern Sie den S30B-Puffer bis zu 1 Woche bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung des Zelllysats (4-Tage-Protokoll)
<ol><li>Tag 1<ol><li>Gießen Sie die 2x YT+P in Agarplatten, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt sind.</li>
		<li>E. coli aus −80 °C Glycerin-Stamm streifen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2<ol><li>Eine einzelne Kolonie von der 2x YT+P-Platte in 400 ml 2x YT+P-Bouillon (ergänzt mit Ampicillin) in einem 1-Liter-Kolben mit Schallblech inokuliert.</li>
		<li>24 h bei 37 °C bei 220 U/min schütteln.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3<ol><li>Messung und Aufzeichnung der OD600 der 24-h-Kulturen; Das Wachstum ist bei einem OD600 von 3-4 ausreichend. HINWEIS: Nehmen Sie ein 1 ml Aliquot Bakterienkultur und führen Sie eine serielle Verdünnung mit Medium (2x YT+P Brühe) durch, bevor Sie den OD600 nm messen. Berücksichtigen Sie den Verdünnungseffekt bei der Berechnung des OD600.</li>
		<li>Die Kultur gleichmäßig zwischen vorgekühlten 500-ml-Zentrifugenflaschen umfüllen.</li>
		<li>Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Während des Zentrifugierens wird die S30A-Puffervorbereitung abgeschlossen, indem 2 ml/l 1 M DTT zum zuvor vorbereiteten S30A-Puffer hinzugefügt werden, gemischt und der Puffer auf Eis aufbewahrt wird.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 ml S30A-Puffer.</li>
		<li>Ziehen Sie die Flaschen kräftig vor, bis das gesamte Pellet vollständig aufgelöst ist, und halten Sie die Zellen so weit wie möglich auf Eis.</li>
		<li>Bei 4.500 x g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5 bis einschließlich 2.3.7.</li>
		<li>Geben Sie 40 ml S30A-Puffer in jede Zentrifugenflasche, resuspendieren Sie die Pellets und füllen Sie sie in vorgewogene 50-ml-Zentrifugenröhrchen um.</li>
		<li>Bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand durch Dekantieren und entfernen Sie den verbleibenden Überstand durch Pipette, wobei Sie ihn so weit wie möglich auf Eis lassen.</li>
		<li>Wiegen Sie die Zentrifugenröhrchen erneut, zeichnen Sie die neue Masse auf und berechnen Sie die Masse der Pellets.</li>
		<li>Pellets werden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei −80 °C gelagert.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 4<ol><li>Die Pellets auf Eis auftauen.</li>
		<li>Pro 1 g Pellet Folgendes hinzufügen: 1,2 ml S30A-Puffer (DTT vor Gebrauch hinzugefügt), 275 μl Proteaseinhibitor (8 mM Stamm) und 25 μl Lysozym (10 mg/ml Stamm).</li>
		<li>Wirbeln Sie kräftig vor, bis die Pellets vollständig aufgelöst sind und keine Klumpen mehr verbleiben, und halten Sie sie so weit wie möglich auf Eis.</li>
		<li>Beschallen Sie die Zellsuspensionen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 120 W, 20 kHz, 30 % Amplitude und 20 s/40 s Ein-/Aus-Impulsen für 5 Minuten Beschallung.</li>
		<li>Bei 4.000 x g für 1 h bei 4 °C zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu pelletieren.</li>
		<li>Den Überstand in frische 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.</li>
		<li>Röhrchen bei 37 °C bei 220 U/min 80 min inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie Dialysematerialien vor, indem Sie 1 ml/l 1 M DTT in den S30B-Puffer geben. Mischen Sie und geben Sie 900 ml in ein steriles 1-Liter-Becherglas. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu und halten Sie ihn bei 4 °C.</li>
		<li>Nach der Abflussreaktion wird der Zellextrakt aus Schritt 2.4.7 in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Verfestigen Sie den pelletfreien Überstand auf Eis in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Bestimmen Sie das Gesamtvolumen des produzierten Zellextrakts und hydratisieren Sie die erforderliche Anzahl von 10K MWCO-Dialysekassetten, indem Sie sie 2 Minuten lang in S30B eintauchen.</li>
		<li>Befüllen Sie die Kassetten über eine Spritze mit bis zu 3 ml Extrakt. Dialysieren Sie bis zu drei Kassetten pro 1-Liter-Becherglas unter Rühren bei 4 °C für 3 h.</li>
		<li>Nach Abschluss der Dialyse, die den Extrakt klärt, wird der Extrakt in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Bei 20.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Verfestigen Sie den geklärten Extrakt in einem frischen Zentrifugenröhrchen auf Eis und wirbeln Sie kurz vor, um ihn zu mischen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Extrakts mit einem Fluorometer.</li>
		<li>Verdünnen Sie den Extrakt auf eine Konzentration von 44,5 mg/ml mit vorgekühltemddH2O.</li>
		<li>Aliquot in 200 μl Aliquots auftragen, in flüssigem Stickstoff schockfrosten und bei −80 °C lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Herstellung lyophilisierter Hydrogele (Methode A)
<ol><li>Wiegen Sie 0,75 g Agarose, fügen Sie ddH2Ozu einem Volumen von 100 ml hinzu und erhitzen Sie sie in 30 s Stößen bei hohen Temperaturen, um geschmolzene Agarosebrühe zu erzeugen.</li>
	<li>Mit einer Pipette 50 μl geschmolzene Agarose in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und das Gel 20-30 Minuten lang polymerisieren lassen (die Polymerisation erfolgt schneller, wenn die Gele in einen Kühlschrank umgefüllt werden).</li>
	<li>Die Mikrozentrifugenröhrchen, die die polymerisierten Gele enthalten, werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel der Zentrifugenröhrchen, decken Sie die Öffnungen der Zentrifugenröhrchen mit Wachsfolie ab und stechen Sie die Folie mehrmals mit einer Nadel oder Pipettenspitze ein.</li>
	<li>Die Mikrozentrifugenröhrchen mit den polymerisierten Gelen für 1-2 h in eine Lagerung bei −80 °C überführen.</li>
	<li>Die Zentrifugenröhrchen aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und in einen Gefriertrockner geben, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig trocken sind.</li>
	<li>Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar.</li>
	<li>Lassen Sie das Gel über Nacht gefriertrocknen.</li>
	<li>Holen Sie die Gele aus dem Gefriertrockner und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei −80 °C. HINWEIS: Gele können gefriergetrocknet bis zu 1 Jahr gelagert werden.</li>
</ol>4. Vorbereitung des 14-fachen Energielösungsvorrats
<ol><li>Kombinieren Sie alle Reaktionskomponenten (Tabelle 1) in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis, um eine 14-fache Energielösung herzustellen.</li>
	<li>Aliquotieren Sie die 14x-Energielösung in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C (es können Aliquots mit kleineren Volumina verwendet werden). HINWEIS: Die 14x-Energielösung kann mehrere Monate bei −80 °C gelagert werden, wenn ein wiederholtes Einfrieren der Röhrchen vermieden wird.</li>
</ol>5. Vorbereitung der 4x Aminosäurebrühe
<ol><li>Tauen Sie alle 20 Aminosäurekomponenten eines RTS-Aminosäure-Sampler-Kits auf Eis auf. Wirbeln Sie die Aminosäuren vor, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind.</li>
	<li>In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen werden alle 20 Aminosäuren vermischt und 12 ml steriler ddH2O-Vortex hinzugefügt, bis die Lösung klar wird und nur einen leichten Hauch von weißer Färbung aufweist.</li>
	<li>Aliquotieren Sie die 4x Aminosäuren in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (500 μL Aliquots).</li>
	<li>Die Aliquots der 4-fachen Aminosäurelösung in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei −80 °C lagern.</li>
</ol>6. Zellfreie Pufferkalibrierung
HINWEIS: Der CFPS-Puffer, der für die Hydrogelreaktionen verwendet wurde, wurde für optimale DTT-, Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Konzentrationen gemäß dem Protokoll von Banks et al.34 kalibriert, das von Sun et al.35 modifiziert wurde. Die Zusammensetzungen der Kalibrierreaktionen wurden mit der Methode der Versuchsplanung (DOE) ausgewählt, wobei sieben Faktorstufen für K-Glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-Glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) und DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) JMP Pro 15 wurde verwendet, um ein benutzerdefiniertes DOE-Design zu generieren (Tabelle 2) und die Analyse durchzuführen, um die optimalen Faktorkonzentrationen zu bestimmen.
<ol><li>Gewinnen Sie den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C und tauen Sie ihn auf Eis auf.</li>
	<li>Tauen Sie die 4x Aminosäuren, 14x Energielösung, 40% PEG-8000, Plasmid-DNA, 3 M K-Glutamat, 100 mM Mg-Glutamat und 100 mM DTT-Vorräte auf Eis auf.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Kalibrierungs-Mastermix, indem Sie 12,5 μl der 4-fachen Aminosäuren, 3,57 μl der 14-fachen Energielösung, 2,5 μl 40 % PEG-8000, 3 μg Plasmid-DNA und 10 μl zellfreien Extrakt (44,5 mg/ml) kombinieren und bis zu 35 μl pro Reaktion mit ddH2O herstellen.</li>
	<li>Verteilen Sie die 35 μl Mastermix in die Vertiefungen einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.</li>
	<li>Fügen Sie gemäß dem DOE-Design das entsprechende Volumen an Mg-Glutamat, K-Glutamat und DTT zu jeder Reaktion hinzu, zusammen mitddH2O, um jede Reaktion auf bis zu 50 μl zu erhöhen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den beschriebenen Plattenleseeinstellungen (für mCherry): Anregung: 587 nm, Emission: 610 nm, Wellenlängenbandbreite: 12 nm, Optik: oben, Temperatur: 37 °C, wobei die Fluoreszenzmesswerte alle 5 Minuten für 4 h Gesamtlesezeit erfasst werden. Inkubieren Sie die Platten durch Schütteln auf einer gepulsten Einstellung bei 60 U/min.</li>
	<li>Laden Sie die Ergebnisse in das JMP-DOE-Design hoch und generieren Sie ein Vorhersageprofil, um die optimalen Konzentrationsniveaus für K-Glutamat, Mg-Glutamat und DTT basierend auf den gewünschten Antwortvariablen zu bestimmen. In diesem Fall waren die maximale Fluoreszenz und die Reaktionsgeschwindigkeit die Antwortvariablen.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Reagenzien wie in Tabelle 3 gezeigt, um den 2X CFPS-Puffer zu erstellen</li>
	<li>Aliquotieren und bei −80 °C lagern</li>
</ol>7. CFPS in rehydrierten lyophilisierten Hydrogelen (Methode A)
ANMERKUNG: Die in den CFPS-Reaktionen verwendeten Plasmide wurden unter Verwendung von Komponenten aus dem modularen EcoFlex-Toolkit für E. coli36 hergestellt und in Whitfield et al. beschrieben.11 Die mCherry und eGFP standen unter der Kontrolle des konstitutiven JM23100 Promotors. Diese Komponenten sind bei Addgene erhältlich.
<ol><li>Den zellfreien Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C zurückgewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen lassen.</li>
	<li>Sammeln Sie den 2-fachen CFPS-Puffer und die Plasmid-DNA und tauen Sie sie auf Eis auf.</li>
	<li>Sammeln Sie die gefriergetrockneten Hydrogele und lassen Sie sie 15 Minuten lang Raumtemperatur erreichen, indem Sie die Gele auf der Bank stehen lassen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gele in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schneiden Sie die Gele bei Bedarf mit einem Skalpell zu, damit sie in die Vertiefungen passen.</li>
	<li>In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 μl zellfreien Extrakt mit 25 μl 2x CFPS-Puffer und 4 μg Plasmid-DNA mischen; bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl mitddH2Oherstellen, um die CFPS-Lösung herzustellen.</li>
	<li>Pipettieren Sie die CFPS-Lösung auf die gefriergetrockneten Hydrogele.</li>
	<li>Lassen Sie die Gele 5-10 Minuten bei Raumtemperatur im CFPS-System einweichen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse liegen in früheren Studienvor 31,33.</li>
</ol>8. Zellfreie Proteinsynthese in einsetzbaren Hydrogelen (Methode B)
<ol><li>Zellfreier Extrakt aus der Lagerung bei −80 °C gewinnen und ca. 20 Minuten auf Eis auftauen.</li>
	<li>Sammle die Plasmid-DNA und taue sie auf Eis auf.</li>
	<li>In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis werden 10 μl zellfreier Extrakt mit 3 μg Plasmid-DNA und 25 μl 2x CFPS-Puffer kombiniert, was ein Gesamtvolumen von 37,5 μl ergibt.</li>
	<li>3 g Agarose abmessen und zu 100 ml ddH2O-Puffer hinzufügen, um3%ige Agarose zu erhalten.</li>
	<li>Die 3%ige Agarose wird in 30 s Stößen bei hoher Leistung in der Mikrowelle erhitzt.</li>
	<li>Pipettieren Sie 12,5 μl geschmolzene Agarose in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die eine CFPS-Mischung enthalten, bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl.</li>
	<li>Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen, aber nicht polymerisieren, und lassen Sie die Agarose in einem auf 50 °C eingestellten Heizblock.</li>
	<li>Kombinieren Sie die geschmolzene Agarose mit der CFPS-Lösung; Durch Pipettieren und Rühren mit der Spitze mischen und darauf achten, dass Sie sich schnell bewegen, um eine Gelpolymerisation zu vermeiden, bevor die CFPS-Lösung eingemischt werden kann.</li>
	<li>Lassen Sie die Gele bei Raumtemperatur abkühlen und polymerisieren Sie ca. 2 min.</li>
	<li>Die polymerisierte Agarose mit einem Spatel in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren.</li>
	<li>Die schockgefrorenen Hydrogele für 1 h bei −80 °C lagern.</li>
	<li>Holen Sie die Gele aus der Lagerung zurück; Entfernen Sie die Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen, bedecken Sie die Röhrchen mit Wachsfolie und stechen Sie die Folie durch, damit die Feuchtigkeit abtrocknen kann.</li>
	<li>Schalten Sie den Gefriertrockner mit folgenden Einstellungen ein: Temperatur: −20 °C, Druck: 0,1 mbar, Gefriertrocknung für 18 h (über Nacht).</li>
	<li>Lagern Sie die gefriergetrockneten CFPS-Geräte bis zur Verwendung bei −80 °C.</li>
	<li>Die gefriergetrockneten CFPS-Geräte mit einem ungefähren Feuchtvolumen von 50 μL können mit 50 μLddH2Oohne überschüssige Flüssigkeit rehydriert werden. Die Rehydrierung dauert ca. 30 Minuten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mikrotiterplatte zur Fluoreszenzdetektion und -analyse auf einen Plattenleser mit den in Schritt 6.6 beschriebenen Einstellungen des Plattenlesers. Repräsentative Ergebnisse sind in früheren Publikationenverfügbar 31,33.</li>
</ol>

Einbettung von CFPS-Reaktionen in eine Vielzahl von Hydrogel-Matrizen

<ol>
	<li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+in+an+open+world.">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li><li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+beyond+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).</li><li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li><li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li><li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production.">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li><li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems.">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).</li><li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression.">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li><li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., B&#246;ckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies:+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology.">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).</li><li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+hydrogels:+synthesis,+properties,+and+their+applications.">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702 (2020).</li><li>Loo, S. L., V&#225;squez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future.">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials.">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li><li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings:+Status+and+trends.">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).</li><li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+lens+materials:+A+materials+science+perspective.">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261 (2019).</li><li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management.">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li><li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+drug+delivery+systems:+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques.">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).</li><li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems,+tissue+engineering+and+wound+management.">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).</li><li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible,+stimuli-responsive,+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds.">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050 (2020).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications.">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).</li><li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds.">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).</li><li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix.">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiobitsTM+explorer:+A+modular+synthetic+biology+education+kit.">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).</li><li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., Garc&#237;a-Guzm&#225;n, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine.">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li><li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels:+from+material+resources,+properties+to+functional+applications.">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).</li><li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials:+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150 (2020).</li><li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display.">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution.">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels.">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+DNA+hydrogel:+Design,+synthesis+and+applications.">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).</li><li>Howard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Datasets+for+Whitfield+et+al.">Datasets for Whitfield et al.</a> 2020 Chemical Communications. , (2020).</li><li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions.">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoFlex:+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology.">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li><li>Ben&#237;tez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+&#181;-channels.">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel &#181;-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li></ol>

Im Folgenden werden zwei Protokolle für den Einbau von CFPS-Reaktionen auf Basis von E. coli-Zelllysaten in Agarose-Hydrogele beschrieben . Diese Methoden ermöglichen eine gleichzeitige Genexpression im gesamten Material. Das Protokoll kann für andere CFPS-Systeme angepasst werden und wurde zusätzlich zu den hier beschriebenen im Labor hergestellten Zelllysaten erfolgreich mit kommerziell erhältlichen CFPS-Kits durchgeführt. Wichtig ist, dass das Protokoll die Genexpression in Abwesenheit einer externen fl...

Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmethoden beseitigt 1,2,3. CFPS wird in einer zunehmenden Anzahl von Anwendungen in zahlreichen Disziplinen eingesetzt, darunter die Konstruktion künstlicher Zellen, das Prototyping genetischer Schaltkreise, die Entwicklung von Biosensoren und die Herstellung von Metaboliten 4,5,6. CFPS ist auch besonders nützlich für die Herstellung rekombinanter Proteine, die in lebenden Zellen nicht ohne weiteres exprimiert werden können, wie z. B. aggregationsanfällige Proteine, Transmembranproteine und toxische Proteine 6,7,8.
CFPS wird in der Regel in flüssigen Reaktionen durchgeführt. Dies kann jedoch ihren Einsatz in einigen Situationen einschränken, da jede flüssigkeitszellfreie Vorrichtung in einem Reaktionsgefäß enthalten sein muss. Der Grundgedanke für die Entwicklung der hier vorgestellten Methoden bestand darin, robuste Protokolle für die Einbettung zellfreier Geräte der synthetischen Biologie in Hydrogele bereitzustellen, nicht als Proteinproduktionsplattform an sich, sondern um die Verwendung von Hydrogelen als physisches Chassis für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors zu ermöglichen. Die Verwendung von Hydrogelen als CFPS-Chassis hat mehrere Vorteile. Hydrogele sind polymere Materialien, die trotz eines hohen Wassergehalts (manchmal über 98%) feste Eigenschaftenbesitzen 9,10,11. Sie werden als Pasten, Gleitmittel und Klebstoffe verwendet und sind in so unterschiedlichen Produkten wie Kontaktlinsen, Wundauflagen, Marineklebebändern, Bodenverbesserungsmitteln und Babywindeln enthalten 9,11,12,13,14. Hydrogele werden auch aktiv als Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten untersucht 9,15,16,17. Hydrogele können auch biokompatibel und biologisch abbaubar sein und einige eigene Reizreaktionen besitzen 9,18,19,20. Ziel ist es daher, eine Synergie zwischen molekularbiologischer Funktionalität und Materialwissenschaft zu schaffen. Zu diesem Zweck wurden Anstrengungen unternommen, die zellfreie synthetische Biologie mit einer Reihe von Materialien zu integrieren, darunter Kollagen, Laponit, Polyacrylamid, Fibrin, PEG-Peptid und Agarose 11,21,22 sowie Oberflächen aus Glas, Papier und Stoff zu beschichten 11,23,24 mit CFPS-Geräten. Die hier vorgestellten Protokolle demonstrieren zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen im Makromaßstab (d. h. >1 mm), wobei Agarose als Beispielmaterial verwendet wird. Agarose wurde aufgrund ihrer hohen Wasseraufnahmefähigkeit, ihrer kontrollierten Selbstgelierungseigenschaften und ihrer einstellbaren mechanischen Eigenschaften ausgewählt 11,24,25,26. Agarose unterstützt auch funktionelle CFPS, ist billiger als viele andere Hydrogel-Alternativen und biologisch abbaubar, was sie zu einer attraktiven Wahl als experimentelles Modellsystem macht. Diese Methoden haben sich jedoch bereits als geeignet für die Einbettung von CFPS in eine Reihe alternativer Hydrogele erwiesen11. Unter Berücksichtigung des breiten Anwendungsspektrums von Hydrogelen und der Funktionalität von CFPS können die hier vorgestellten Methoden eine Grundlage bieten, auf der Forscher biologisch verbesserte Hydrogelmaterialien entwickeln können, die für ihre Zwecke geeignet sind.
In früheren Studien wurden Mikrogelsysteme mit einem Größenbereich von 1 μm bis 400 μm verwendet, um CFPS in Hydrogelen durchzuführen, die in den Reaktionspuffer 23,27,28,29,30,31 getaucht sind. Die Anforderung, Hydrogele in CFPS-Reaktionspuffer einzutauchen, schränkt jedoch die Möglichkeiten für ihren Einsatz als eigenständige Materialien ein. Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogelen, ohne dass die Gele in Reaktionspuffer getaucht werden müssen. Zweitens ermöglicht die Verwendung von makroskaligen Gelen (zwischen 2 mm und 10 mm Größe) die Untersuchung der physikalischen Wechselwirkung zwischen Hydrogelen und zellfreier Genexpression. Zum Beispiel ist es mit dieser Technik möglich, zu untersuchen, wie die Hydrogelmatrix die CFPS-Reaktionen11 beeinflusst und wie CFPS-Reaktionen die Hydrogelmatrix31 beeinflussen können. Größere Abmessungen von Hydrogelen ermöglichen auch die Entwicklung neuartiger, bioprogrammierbarer Materialien32. Schließlich besteht durch die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele auch eine potenzielle Reduzierung des Bedarfs an Kunststoff-Reaktionsgefäßen. Für den Einsatz von zellfreien Sensoren hat dies klare Vorteile gegenüber Geräten, die auf Kunststoffware angewiesen sind. Zusammenfassend bietet die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele mehrere Vorteile für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors.
Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Durchführung von CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogel-Matrizen zu ermöglichen. Es werden zwei verschiedene Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinproduktionsreaktionen in makroskalige Hydrogelmaterialien demonstriert (Abbildung 1). Bei Methode A werden CFPS-Komponenten in lyophilisierte Agarose-Hydrogele eingebracht, um ein aktives System zu bilden. Bei Methode B wird geschmolzene Agarose mit CFPS-Reaktionskomponenten vermischt, um ein vollständiges CFPS-Hydrogelsystem zu bilden, das dann lyophilisiert und bis zur Verwendung gelagert wird. Diese Systeme können mit einem Volumen Wasser oder Puffer und Analyt rehydriert werden, um die Reaktion zu starten.
In dieser Studie werden Escherichia coli-Zelllysat-basierte Systeme verwendet. Dies sind einige der beliebtesten experimentellen CFPS-Systeme, da die Herstellung von E. coli-Zelllysaten einfach und kostengünstig ist und hohe Proteinausbeuten erzielt . Das Zelllysat wird mit den makromolekularen Komponenten ergänzt, die für die Transkription und Translation erforderlich sind, einschließlich Ribosomen, tRNAs, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Insbesondere demonstriert diese Arbeit die Produktion von eGFP und mCherry in Agarose-Hydrogelen unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten und überwacht das Auftreten von Fluoreszenz mit einem Plattenleser und konfokaler Mikroskopie . Repräsentative Ergebnisse für den Mikrotiterplattenleser sind in Whitfield et al.31 zu sehen, und die zugrunde liegenden Daten sind öffentlich zugänglich33. Darüber hinaus wird die Expression fluoreszierender Proteine in den Gelen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Die beiden Protokolle, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, ermöglichen den Zusammenbau und die Lagerung von CFPS-basierten genetischen Geräten in Materia mit dem Ziel, eine geeignete physikalische Umgebung für die Verteilung zellfreier Genschaltkreise in einer Weise zu schaffen, die den Feldeinsatz unterstützt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214793B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10752.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Severn Biotech</td>
			<td>30-15-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino Acid Sampler Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BTRABR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J14121.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NG01208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>757551-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD037-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein concentration kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71397-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J23160.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS4323-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MWCO dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120-9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>part no. 101521, 101522, 101527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H-X3R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 384 well microtitre plates</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elga Purelab Chorus</td>
			<td>Elga</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP00532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP license</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15353518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photospectrometer (Biophotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>16713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16384738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12893543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Lux platereader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>OU-04724-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&#176;c meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1657</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogels

Synthetische Gennetzwerke bieten Wissenschaftlern und Ingenieuren eine Plattform, um neuartige Systeme mit Funktionen zu entwerfen und zu bauen, die auf genetischer Ebene kodiert sind. Während das vorherrschende Paradigma für den Einsatz von Gennetzwerken innerhalb eines zellulären Chassis liegt, können synthetische Gennetzwerke auch in zellfreien Umgebungen eingesetzt werden. Zu den vielversprechenden Anwendungen zellfreier Gennetzwerke gehören Biosensoren, da diese Geräte gegen biotische (Ebola-, Zika- und SARS-CoV-2-Viren) und abiotische (Schwermetalle, Sulfide, Pestizide und andere organische Verunreinigungen) Ziele nachgewiesen wurden. Zellfreie Systeme werden in der Regel in flüssiger Form in einem Reaktionsgefäß eingesetzt. Die Möglichkeit, solche Reaktionen in eine physikalische Matrix einzubetten, kann jedoch ihre breitere Anwendung in einer breiteren Palette von Umgebungen erleichtern. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Einbettung von Reaktionen der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) in eine Vielzahl von Hydrogelmatrices entwickelt. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Hydrogelen, die für diese Arbeit förderlich sind, ist die hohe Wasserrekonstitutionskapazität von Hydrogelmaterialien. Darüber hinaus besitzen Hydrogele physikalische und chemische Eigenschaften, die funktionell vorteilhaft sind. Hydrogele können für die Lagerung gefriergetrocknet und für die spätere Verwendung rehydriert werden. Es werden zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle für den Einschluss und die Analyse von CFPS-Reaktionen in Hydrogelen vorgestellt. Zunächst kann ein CFPS-System durch Rehydrierung mit einem Zelllysat in ein Hydrogel eingebaut werden. Das System innerhalb des Hydrogels kann dann für eine vollständige Proteinexpression durch das Hydrogel induziert oder konstitutiv exprimiert werden. Zweitens kann Zelllysat am Punkt der Polymerisation in ein Hydrogel eingebracht werden, und das gesamte System kann gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt mit einer wässrigen Lösung rehydriert werden, die den Induktor für das in dem Hydrogel kodierte Expressionssystem enthält. Diese Methoden haben das Potenzial, zellfreie Gennetzwerke zu ermöglichen, die Hydrogelmaterialien sensorische Fähigkeiten verleihen, mit dem Potenzial, über das Labor hinaus eingesetzt zu werden.

Synthetic biology integrates diverse engineering disciplines to design and engineer biologically based parts, devices, and systems that can perform functions that are not found in nature. Most synthetic biology approaches are still bound to living cells. By contrast, cell-free synthetic biology systems facilitate unprecedented levels of control and freedom in design, enabling increased flexibility and a shortened time for engineering biological systems while eliminating many of the constraints of traditional cell-based gene expression methods1,2,3. CFPS is being used in an increasing number of applications across numerous disciplines, including constructing artificial cells, prototyping genetic circuits, developing biosensors, and producing metabolites4,5,6. CFPS has also been particularly useful for producing recombinant proteins that cannot be readily expressed in living cells, such as aggregation-prone proteins, transmembrane proteins, and toxic proteins6,7,8.
CFPS is typically performed in liquid reactions. This, however, may restrict their deployment in some situations, as any liquid cell-free device must be contained within a reaction vessel. The rationale for the development of the methods presented here was to provide robust protocols for embedding cell-free synthetic biology devices into hydrogels, not as a protein production platform per se but, instead, to allow the use of hydrogels as a physical chassis for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory. The use of hydrogels as CFPS chassis has several advantages. Hydrogels are polymeric materials that, despite a high water content (sometimes in excess of 98%), possess solid properties9,10,11. They have uses as pastes, lubricants, and adhesives and are present in products as diverse as contact lenses, wound dressings, marine adhesive tapes, soil improvers, and baby diapers9,11,12,13,14. Hydrogels are also under active investigation as drug delivery vehicles9,15,16,17. Hydrogels may also be biocompatible, biodegradable, and possess some stimuli responses of their own9,18,19,20. Therefore, the goal here is to create a synergy between molecular biology-derived functionality and materials science. To this end, efforts have been made to integrate cell-free synthetic biology with a range of materials, including collagen, laponite, polyacrylamide, fibrin, PEG-peptide, and agarose11,21,22, as well as to coat surfaces of glass, paper, and cloth11,23,24 with CFPS devices. The protocols presented here demonstrate two methods for embedding CFPS reactions in macro-scale (i.e., &#62;1 mm) hydrogel matrices, using agarose as the exemplar material. Agarose was chosen due to its high water absorption capacity, controlled self-gelling properties, and tuneable mechanical properties11,24,25,26. Agarose also supports functional CFPS, is cheaper than many other hydrogel alternatives, and is biodegradable, making it an attractive choice as an experimental model system. These methods have, however, been previously demonstrated as appropriate for embedding CFPS in a range of alternative hydrogels11. Considering the wide range of applications of hydrogels and the functionality of CFPS, the methods demonstrated here can provide a basis from which researchers are able to develop biologically enhanced hydrogel materials suited to their own ends.
In previous studies, microgel systems with a size range of 1 &#181;m to 400 &#181;m have been used to perform CFPS in hydrogels submerged in reaction buffer23,27,28,29,30,31. The requirement to submerge hydrogels within CFPS reaction buffers, however, limits opportunities for their deployment as materials in their own right. The protocols presented here allow CFPS reactions to occur within hydrogels without the need to submerge the gels in reaction buffers. Second, the use of macroscale gels (between 2 mm and 10 mm in size) allows the study of the physical interaction between hydrogels and cell-free gene expression. For example, with this technique, it is possible to study how the hydrogel matrix affects CFPS reactions11 and how CFPS reactions can impact the hydrogel matrix31. Larger sizes of hydrogels also allow for the development of novel, bio-programmable materials32. Finally, by embedding CFPS reactions into hydrogels, there is also a potential reduction in the requirement for plastic reaction vessels. For the deployment of cell-free sensors, this has clear advantages over devices dependent on plasticware. Taken together, embedding CFPS reactions in hydrogels provides several advantages for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory.
The overall goal of the methods presented here is to allow the operation of CFPS reactions within hydrogel matrices. Two different methods are demonstrated for embedding cell-free protein production reactions in macro-scale hydrogel materials (Figure 1). In Method A, CFPS components are introduced to lyophilized agarose hydrogels to form an active system. In Method B, molten agarose is mixed with CFPS reaction components to form a complete CFPS hydrogel system, which is then lyophilized and stored until needed. These systems can be rehydrated with a volume of water or buffer and analyte to commence the reaction.
This study uses Escherichia coli cell lysate-based systems. These are some of the most popular experimental CFPS systems, as E. coli cell lysate preparation is simple, inexpensive, and achieves high protein yields. The cell lysate is complemented with the macromolecular components needed to perform transcription and translation, including ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, and initiation, elongation, and termination factors. Specifically, this paper demonstrates the production of eGFP and mCherry in agarose hydrogels using E. coli cell lysates and monitors the appearance of fluorescence using a plate reader and confocal microscopy. Representative results for the microtiter plate reader can be seen in Whitfield et al.31, and the underlying data are publicly available33. Further, the expression of fluorescent proteins throughout the gels is confirmed using confocal microscopy. The two protocols demonstrated in this paper allow for the assembly and storage of CFPS-based genetic devices in materia with the ultimate goal of creating a suitable physical environment for the distribution of cell-free gene circuitry in a manner supportive of field deployment.

Autor im Rampenlicht: Ein neuartiger Ansatz zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in Hydrogele 

Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

We know living systems continuously integrate information from many different sources and that these signals trigger complex and subtle responses. Much of this information processing occurs at the molecular level. We're interested in operating these processes within materials, but without cells.The purpose is to give materials novel functionality. Challenges in this work are primarily associated with the cell-free protein synthesis reaction, rather than working with hydrogel. Cell reaction require high quality cell lysate as well as high quality and purity DNA to function well.This protocol allows researchers to embed molecular biology reactions into a physical biodegradable material that can be taken outside of the laboratory. Also, because the reaction output interacts directly with the material chassis, there is potential for the development of materials with novel sensing and response capabilities. In short-term, we see these methods as providing a novel route to the deployment of cell-free diagnostic devices.This protocol allows a number of devices to be created and spatially organized in a manner that is not possible for liquid reactions. Our future interests are twofold. First, we are interested in expanding the nature of the hydrogels we use to bring more material functionality to the work.Second, we are interested in increasing the complexity and performance of the gene networks we operate in gels, expanding the biological functionality of these systems.

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen, wobei Abbildung 1 eine schematische Übersicht der beiden Ansätze zeigt. Beide Methoden eignen sich für die Gefriertrocknung und Langzeitlagerung. Methode A ist aus zwei Gründen die am häufigsten verwendete Methodik. Erstens hat sich gezeigt, dass es das am besten anwendbare Verfahren für die Arbeit mit einer Reihe von Hydrogelmaterialien11 ist. Zweitens ermöglich...

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In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Wir wissen, dass lebende Systeme kontinuierlich Informationen aus vielen verschiedenen Quellen integrieren und dass diese Signale komplexe und subtile Reaktionen auslösen. Ein Großteil dieser Informationsverarbeitung findet auf molekularer Ebene statt. Wir sind daran interessiert, diese Prozesse innerhalb von Materialien, aber ohne Zellen zu betreiben.Ziel ist es, Materialien mit neuartiger Funktionalität auszustatten. Die Herausforderungen in dieser Arbeit liegen in erster Linie in der zellfreien Proteinsynthesereaktion und nicht in der Arbeit mit Hydrogel. Zellreaktionen erfordern hochwertiges Zelllysat sowie hochwertige und reine DNA, um gut zu funktionieren.Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, molekularbiologische Reaktionen in ein physikalisches, biologisch abbaubares Material einzubetten, das außerhalb des Labors mitgenommen werden kann. Da der Reaktionsausgang direkt mit dem Materialchassis interagiert, besteht außerdem Potenzial für die Entwicklung von Materialien mit neuartigen Sensor- und Reaktionsfähigkeiten. Kurzfristig sehen wir in diesen Methoden einen neuen Weg zum Einsatz zellfreier Diagnosegeräte.Dieses Protokoll ermöglicht es, eine Reihe von Geräten zu erstellen und räumlich in einer Weise zu organisieren, die für flüssige Reaktionen nicht möglich ist. Unsere zukünftigen Interessen sind zweierlei. Erstens sind wir daran interessiert, die Art der von uns verwendeten Hydrogele zu erweitern, um der Arbeit mehr Materialfunktionalität zu verleihen.Zweitens sind wir daran interessiert, die Komplexität und Leistungsfähigkeit der Gennetzwerke, die wir in Gelen betreiben, zu erhöhen und die biologische Funktionalität dieser Systeme zu erweitern.

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

869 Aufrufe.  Newcastle University. Wir wissen, dass lebende Systeme kontinuierlich Informationen aus vielen verschiedenen Quellen integrieren und dass diese Signale komplexe und subtile Reaktionen auslösen. Ein Großteil dieser Informationsverarbeitung findet auf molekularer Ebene statt. Wir sind daran interessiert, diese Prozesse innerhalb von Materialien, aber ohne Zellen zu betreiben.Ziel ist es, Materialien mit neuartiger Funktionalität auszustatten. Die Herausforderungen in dieser Arbeit liegen in erster Linie in...

Serie: Autor im Rampenlicht: Ein neuartiger Ansatz zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in Hydrogele 

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Forschung

Biologie

Cell-Free Protein Synthesis in Rehydrated Lyophilized Hydrogels

To begin, transfer the hydrogels to 1.5 milliliter micro centrifuge tubes, trimming the gels with a scalpel if necessary to make them fit in the wells. In another 1.5 milliliter micro centrifuge tube, combine 10 microliters of the cell-free extract with 25 microliters of two x cell-free protein synthesis buffer and four micrograms of plasmid DNA. Make up to a total volume of 50 microliters with double distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution.Pipette the solution onto the freeze dried hydrogels, and allow the gels to soak in the cell-free protein synthesis system for five to 10 minutes at room temperature. Transfer the gels to a black 384 well microtiter plate using a spatula. Then, transfer the microtiter plate to a plate reader, and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis.

Zellfreie Proteinsynthese in rehydrierten lyophilisierten Hydrogelen

Cell-Free Protein Synthesis in Deployable Hydrogels

In a 1.5 milliliter microcentrifuge tube on ice, combine 10 microliters of the cell-free extract with four micrograms of plasmid DNA and 25 microliters of 2X cell-free protein synthesis buffer. Make up to a total volume of 50 microliters with double-distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution. Weigh 0.75 grams of agarose and add it to 100 milliliters of double-distilled water buffer to prepare 0.75%agarose.Microwave the 0.75%agarose in 30-second bursts at high power and pipette 50 microliters of the molten agarose into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes or into molds of a desired shape. Place the molten agarose on a heat block set to 50 degrees Celsius and allow the agarose to cool but not polymerize. Then, mix the molten agarose with the cell-free protein synthesis solution by pipetting and stirring with the pipette tip.Allow the gels to cool to room temperature and polymerize for approximately two minutes. Transfer the polymerized agarose to 1.5-milliliter microcentrifuge tubes with a spatula and flash freeze in liquid nitrogen. Place the flash-frozen hydrogels into minus 80 degrees Celsius storage for one hour.After that, remove the microcentrifuge tube lids. Cover the tubes with a wax film and pierce the film to allow the moisture to be dried off. Set the temperature of the freeze dryer to minus 20 degrees Celsius and pressure to 0.1 millibars and freeze-dry the cell-free protein synthesis devices for 18 hours or overnight.Rehydrate the freeze-dried devices for 30 minutes with 50 microliters of double-distilled water without excess liquid, and transfer the gels to a black 384-well microtiter plate using a spatula. Finally, place the microtiter plate on a plate reader and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis. The cell-free protein synthesis of eGFP and mCherry in a hydrogel using E.coli cell lysates is shown in this figure.0.75%agarose gels were prepared without DNA template with four micrograms of either eGFP or mCherry template or with four micrograms of both eGFP and mCherry template. An overlay of the two channels is also shown, and the overlay includes the differential interference contrast image. The results confirmed the co-expression of both mCherry and eGFP in agarose.