In einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis 10 Mikroliter des zellfreien Extrakts mit vier Mikrogramm Plasmid-DNA und 25 Mikrolitern 2-fachem zellfreiem Proteinsynthesepuffer kombinieren. Mit doppelt destilliertem Wasser wird ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern hergestellt, um die zellfreie Proteinsyntheselösung herzustellen. Wiegen Sie 0,75 Gramm Agarose ab und geben Sie sie zu 100 Millilitern doppelt destilliertem Wasserpuffer, um 0,75%ige Agarose herzustellen.
Die 0,75%ige Agarose wird in 30-Sekunden-Stößen mit hoher Leistung in der Mikrowelle erhitzt und 50 Mikroliter der geschmolzenen Agarose in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen oder in Formen der gewünschten Form pipettiert. Geben Sie die geschmolzene Agarose auf einen auf 50 Grad Celsius eingestellten Heizblock und lassen Sie die Agarose abkühlen, aber nicht polymerisieren. Mischen Sie dann die geschmolzene Agarose mit der zellfreien Proteinsyntheselösung, indem Sie mit der Pipettenspitze pipettieren und umrühren.
Lassen Sie die Gele auf Raumtemperatur abkühlen und etwa zwei Minuten lang polymerisieren. Die polymerisierte Agarose mit einem Spatel in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Die schockgefrorenen Hydrogele für eine Stunde bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Danach entfernen Sie die Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen. Decken Sie die Röhrchen mit einer Wachsfolie ab und stechen Sie die Folie durch, damit die Feuchtigkeit abtrocknen kann. Stellen Sie die Temperatur des Gefriertrockners auf minus 20 Grad Celsius und den Druck auf 0,1 Millibar ein und gefriertrocknen Sie die zellfreien Proteinsynthesegeräte für 18 Stunden oder über Nacht.
Rehydrieren Sie die gefriergetrockneten Geräte 30 Minuten lang mit 50 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser ohne überschüssige Flüssigkeit und geben Sie die Gele mit einem Spatel auf eine schwarze 384-Well-Mikrotiterplatte. Legen Sie abschließend die Mikrotiterplatte auf einen Plattenleser und verwenden Sie die auf dem Bildschirm angezeigten Plattenlesereinstellungen für die Fluoreszenzdetektion und -analyse. Die zellfreie Proteinsynthese von eGFP und mCherry in einem Hydrogel unter Verwendung von E.coli-Zelllysaten ist in dieser Abbildung dargestellt.
0,75%ige Agarose-Gele wurden ohne DNA-Template mit vier Mikrogramm eGFP- oder mCherry-Template oder mit vier Mikrogramm eGFP- und mCherry-Template hergestellt. Eine Überlagerung der beiden Kanäle wird ebenfalls angezeigt, und die Überlagerung enthält das differentielle Interferenzkontrastbild. Die Ergebnisse bestätigten die Co-Expression von mCherry und eGFP in Agarose.
