Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Natural Science Foundation of China (3157270) unterstützt. Wir danken Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) für die Bereitstellung von iBMDM.

1. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel
HINWEIS: Alle Zentrifugationen in den Schritten 1.1-1.11 bei 4 °C durchführen.
<ol><li>Herstellung von sEVs-freiem fetalem Kälberserum (FBS): FBS über Nacht bei 110.000 × g bei 4 °C durch eine Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle), um endogene sEVs zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, filtern Sie ihn mit einer 0,2 μm Ultrafiltrationsmembran und lagern Sie ihn bei -20 °C.</li>
	<li>Etwa 3 x 107 immortalisierte Makrophagen aus dem Knochenmark (iBMDMs) auf eine 150-mm-Kulturschale geben und 20 ml DMEM-Nährmedium hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bevor Sie sEVs sammeln, werfen Sie das Medium weg. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung; Material-Tabelle) und ersetzen Sie es durch ein Medium, das 10 % sEVs-freies FBS enthält.</li>
	<li>Je nach den Anforderungen des Experiments wird der Zellüberstand gesammelt und in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Zellüberstand 10 Minuten lang bei 300 × g , um die Zellen zu entfernen, das Pellet zu entsorgen und den Überstand in neue 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2000 × g für 10 Minuten, um abgestorbene Zellen zu entfernen, verwerfen Sie das Pellet und überführen Sie den Überstand in neue Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 × g für 30 Minuten durch eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, um Zelltrümmer und Mikrovesikel zu entfernen, verwerfen Sie das Pellet und überführen Sie den Überstand in neue Ultrazentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle). Das Volumen der offenen Ultrazentrifugenröhrchen beträgt 38,6 ml; Geben Sie 35 ml Zellüberstand in jedes Röhrchen.</li>
	<li>Der Überstand wird bei 110.000 × g für 70 min in einer Rotorzentrifuge zentrifugiert (siehe Materialtabelle), um rohes sEV-Pellet zu erhalten.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das mit sEVs angereicherte Pellet mit 1 ml PBS. Bei 110.000 × g für 70 min auf einer Tisch-Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle). Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml PBS in ein Ultrazentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Dann wird der Niederschlag kontinuierlich pipettiert, 1 ml PBS in ein anderes Ultrazentrifugenröhrchen überführt und so weiter, bis alle Ultrazentrifugenröhrchen durch Pipettieren gemischt sind.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl PBS, d. h. sEVs.</li>
	<li>Messen Sie das Gesamtprotein von sEVs mit der Bicinchoninsäure-Methode (BCA), indem Sie die folgenden Schritte ausführen (siehe Materialtabelle).<ol><li>Zubereitung des Proteinstandards: Geben Sie 1,2 ml Proteinzubereitungslösung in ein Standard-Proteinröhrchen (30 mg BSA), um es vollständig aufzulösen, um eine Proteinstandardlösung (25 mg/ml) herzustellen. Verdünnen Sie es dann mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml.</li>
		<li>Geben Sie 0 μl, 1 μl, 2 μl, 4 μl, 8 μl, 12 μl, 16 μl und 20 μl des Proteinstandards in die 96-Well-Platte und fügen Sie PBS hinzu, um 20 μl zu erhalten. Gleichzeitig werden 18 μl HEPES-Lysepuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % Triton X-100) und 2 μl sEVs-Proben in die zu testenden Probenvertiefungen gegeben.</li>
		<li>Bereiten Sie die erforderliche BCA-Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, geben Sie 200 μl BCA-Arbeitslösung in jede Vertiefung und stellen Sie sie 20-30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm mit einem Mikroplatten-Reader und berechnen Sie die Gesamtproteinkonzentration von sEVs gemäß der Standardkurve und dem Verdünnungsfaktor. HINWEIS: Die sEVs, die mit diesem Protokoll aus 40 ml Überstand extrahiert werden, können für die anschließende Identifizierung von Proteinmarkern (Western Blot) verwendet werden. sEVs, die aus 200 ml Zellüberstand extrahiert werden, können jedoch sowohl für die morphologische Beobachtung (Transmissionselektronenmikroskopie, TEM) als auch für die Partikelgrößenanalyse (Nanopartikel-Tracking-Analyse, NTA) verwendet werden. Insbesondere für sEVs, die in Schritt 1.11 geerntet wurden, resuspendieren Sie mit 100 μl PBS. Entnehmen Sie 20-30 μl für die morphologische Beobachtung (TEM) und resuspendieren Sie die verbleibende Probe in 1 ml PBS für die Partikelgrößenanalyse (NTA). Alle Zentrifugen werden vorgekühlt. Für Schritt 1.8 müssen diese Ultrazentrifugenröhrchen streng ausgewuchtet und mindestens zu drei Vierteln gefüllt sein. Wenn nicht, füge dem Make-up Medium hinzu. Für Schritt 1.11 können die sEVs kurzzeitig (12 h) bei 4 °C gelagert werden; Andernfalls müssen sie bei -20 oder -80 °C gelagert werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden, der die Extraktion von Peptiden stört. Für Proben, die zur Beobachtung der Morphologie und zur Messung der Partikelgröße verwendet werden, wird jedoch empfohlen, nur kurzzeitig (12 h) bei 4 °C zu lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Beobachtung der Morphologie von sEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie
<ol><li>Geben Sie einen Tropfen frische sEV-Probe (ca. 20-30 μl) auf den Parafilm, legen Sie die Zahlenseite des Kupfergewebes auf das sEVs-Tröpfchen und lassen Sie es 3 Minuten lang einwirken.</li>
	<li>Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier auf, legen Sie dann das Kupfergitter auf einen Tropfen destilliertes Wasser und waschen Sie es zweimal.</li>
	<li>Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier auf. Legen Sie dann das Kupfergitter für die Negativfärbung für 5 s auf das 0,5%ige Uranylacetat-Tröpfchen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.</li>
	<li>Legen Sie das vorbereitete Kupfergewebe auf den Probenstab und führen Sie es in den Probentisch ein.<ol><li>Stellen Sie die Vergrößerung auf das 20.000-25.000-fache ein, um die zu testende Probe zu finden. Stellen Sie dann die Vergrößerung auf das 100.000-fache ein und stellen Sie die entsprechende Position und Graustufen ein, um unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM; Materialtabelle). Die Beschleunigungsspannung für die Bildaufnahme ist auf 80 kV eingestellt. HINWEIS: Bei Schritt 2.1 kann die Adsorptionszeit auf 5 Minuten oder sogar länger verlängert werden, wenn die Konzentration der sEVs-Proben niedrig ist (<50 μg/μl). Alternativ kann für Schritt 1.10 ein kleineres Volumen PBS (50 μl) für die Resuspension verwendet werden. Für Schritt 2.3 sollte die negative Färbezeit nicht zu lang sein; Andernfalls ist es schwierig, die dreidimensionale (3D) Struktur von sEVs zu beobachten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Messungen der Partikelgrößenverteilung und -konzentration von sEVs mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse
<ol><li>Für die in Schritt 1.11 geernteten sEVs wird die Lösung für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) auf 1 ml verdünnt. Reinigen Sie das Instrument zunächst mit destilliertem Wasser, bis keine Verunreinigungen mehr im Sichtfeld vorhanden sind. Verwenden Sie dann eine sterile 1-ml-Spritze, um die Probe langsam zu drücken (Injektionsvolumen: 0,5-1 ml).</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben mit Hilfe von unterstützender Software (siehe Materialtabelle). Klicken Sie insbesondere auf Kamera starten , stellen Sie die Kamerastufe auf eine geeignete Größe ein (in der Regel eine Intensität von 14 bis 16 Einheiten), wählen Sie dann die Messmethode Standardmessung (3 oder 5 Mal) aus und klicken Sie auf Ausführen , um die Partikel zu erfassen.</li>
	<li>Nach dem Sammeln der Teilchen kann der Computer die sich bewegenden Teilchen des sEVs beobachten. Legen Sie gleichzeitig die Erkennungsschwelle (in der Regel 5) fest, um die Partikelgrößenverteilung so zu analysieren, dass die zuletzt gezählten Partikel alle sich bewegenden sEVs und nicht der Hintergrund sind. Nachdem Sie die Partikel analysiert haben, speichern und exportieren Sie die Analyseergebnisse.</li>
	<li>Waschen Sie das Instrument nach Gebrauch mit destilliertem Wasser, bis sich keine offensichtlichen Partikel mehr im Sichtfeld befinden, und schalten Sie den Laser aus. HINWEIS: Im Gegensatz zu sEV-Proben für TEM sollten sEV-Proben für NTA nicht zu konzentriert sein und größere Probenvolumina (mindestens 1 ml) erfordern. Darüber hinaus können alternative Methoden zur Analyse der Größenverteilung von sEVs verwendet werden, wie z. B. Durchflusszytometrie und abstimmbare resistive Impulsmessung (TRPS) usw. Die empfohlene Anzahl von Partikeln/Rahmen für NTA-Messungen (NanoSight LM10) beträgt 40.</li>
</ol>4. Detektion von Proteinmarkern von sEVs mittels Western Blot
HINWEIS: Gemäß den Richtlinien17,18 für Studien an extrazellulären Vesikeln (MISEV) 2018 werden 5 Kategorien von Proteinen für die Charakterisierung von sEVs empfohlen. Bewerten Sie mindestens einen Proteinmarker jeder Kategorie 1 bis 4 für die Vorbereitung von sEVs.
<ol><li>Für die in Schritt 1.9 geernteten sEVs wird der Überstand vorsichtig pipettiert und 5 Minuten lang 15 μl HEPES-Lysepuffer zugegeben. Dann die gleiche Menge Ladepuffer hinzufügen und 15 Minuten in kochendem Wasser kochen.</li>
	<li>In diesem Protokoll betrug die Beladung mit dem Protein von sEVs 8-10 μg. Elektrophorese der Proteine in 10%igen Gelen bei einer konstanten Spannung von 80 V (ca. 30 min).<ol><li>Wenn die Probe in das Trenngel eintritt, stellen Sie die Spannung auf 120 V (ca. 45 min) ein. Nachdem die Probe 2-3 cm vom Boden der Glasplatte entfernt ist, trennen Sie die Stromversorgung und schneiden Sie den Probenstreifen für die Elektroporation ab. Die Zusammensetzung der Elektrophoreselösung ist in Unterschritt 4.2.1.1 beschrieben.<ol><li>Zur Herstellung einer 5-fachen Elektrophoreselösung werden 15,1 g, 5 g bzw. 94 g Tris, SDS und Glycin abgewogen und mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Wenn es verwendet wird, muss es 5 Mal mit Wasser verdünnt werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Das Elektroporationsgerät zusammenbauen und in ausreichend Elektroporationslösung (ca. 1 l) geben und das Protein auf der Nitrozellulosemembran (NC) mit einem konstanten Strom von 90 mA 3,5 h auf Eis elektropolieren. HINWEIS: Zur Herstellung von 10x Elektroporationslösung werden 30,25 g bzw. 144,1 g Tris und Glycin eingewogen und mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Wenn es verwendet wird, muss es in einem Verhältnis von 7:2:1 von deionisiertem Wasser zu Methanol zu Elektroporationslösung hergestellt werden.</li>
	<li>Nach der Elektroporation wird die NC-Membran in Blockierungslösung (2,5 g Magermilchpulver in 50 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) für 1-2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C gelegt. Die Zusammensetzung von TBST ist in Unterschritt 4.4.1 beschrieben.<ol><li>Um 10x TBST herzustellen, wiegen Sie 60,56 g bzw. 175,32 g Tris bzw. NaCl ab und fügen Sie dann 10 ml Tween-20 und 34 ml konzentrierte Salzsäure hinzu. pH-Wert = 7,6 mit konzentrierter Salzsäure einstellen und mit deionisiertem Wasser auf 2 l auffüllen. Wenn es verwendet wird, muss es zehnmal mit Wasser verdünnt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizierung der Proteinmarker anhand von drei sEVs-Markern (Cluster of Differentiation 9 [CD9]; β-Aktin; Tumor-Suszeptibilitäts-Gen [TSG101]) und einem Nicht-sEVs-Marker (Glukose-reguliertes Protein 94 [GRP94]).<ol><li>Pipettieren Sie 2 μl der oben genannten Antikörper und verdünnen Sie sie bei 1:500, dann inkubieren Sie die NC-Membranen bei RT für 3 h oder über Nacht bei 4 °C. Das Verdünnungsmittel ist die Sperrlösung in Schritt 4.4.</li>
		<li>Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper 3 mal mit 1x TBST auf einem Schüttler für jeweils 10 min waschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die NC-Membran in den verdünnten Sekundärantikörper (1:500) und schütteln Sie sie langsam auf einem Schüttler bei RT für 45-50 min. 3 mal mit 1x TBST auf einem Shaker für jeweils 10 min waschen.</li>
	<li>Mischen Sie die chemilumineszierenden Substrate A und B (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1, geben Sie das gemischte Reagenz zur NC-Membran und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT.</li>
	<li>Abbildung der NC-Membran mit einem Blot-Imager (siehe Materialtabelle)<ol><li>Öffnen Sie die Image Lab-Software , und wählen Sie Neues experimentelles Protokoll aus.</li>
		<li>Wählen Sie die Anwendung Blotting-colorimetrisch, brechen Sie die Hervorhebung ab, klicken Sie auf Experimentelles Protokoll ausführen, erfassen Sie den Marker und speichern Sie ihn.</li>
		<li>Wählen Sie dann das Anwendungsprogramm Blotting-chemi erneut aus und stellen Sie die Gesamtzahl der Bilder und die Belichtungszeit auf 30 s bzw. 300 s ein.</li>
		<li>Klicken Sie auf Experimentelles Protokoll ausführen, rufen Sie die Bilder ab, und speichern Sie sie. Entfernen Sie abschließend die NC-Membran und schalten Sie den Computer aus. ANMERKUNG: Für Schritt 4.6 sollte die Inkubationszeit des Sekundärantikörpers 50 Minuten nicht überschreiten. Andernfalls ist der Hintergrund zu dunkel.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Extraktion der Peptide von sEVs
<ol><li>Waschen Sie die sEVs zweimal durch Ultrazentrifugation bei 110.000 × g bei 4 °C für 70 Minuten und fügen Sie 500 μl PBS (siehe Materialtabelle) hinzu, um sie zu resuspendieren, und fügen Sie 5 μl 100x Proteaseinhibitor hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie die Probe für die Ultraschallzerkleinerung ein (siehe Materialtabelle). Die Einstellungen für die Ultraschallhomogenisierung lauten wie folgt: Leistung: 40 W, Gesamtzeit: 10 Minuten, Ultraschallzeit: 3 s und Intervallzeit: 5 s.</li>
	<li>Die zerkleinerte Mischung wird bei 13.700 × g 15 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation wird Dithiothreitol (DTT; Material-Tabelle) bis zu einer Endkonzentration von 50 mmol/l in den Überstand geben und in einem Wasserbad bei 56 °C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Anschließend 50 μl Jodacetamid (IAA; Material-Tabelle) in eine Konzentration von 1 mol/L geben und bei RT 20 min im Dunkeln reagieren lassen.</li>
	<li>Das Gemisch wird bei 13.700 × g bei 4 °C für 15 min zentrifugiert und der Überstand, der Rohpeptidextrakt, aufgefangen. Für die spätere Verwendung bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Ultrafiltrieren Sie den erhaltenen Peptidrohextrakt mit einem 10 kDa Ultrafiltrationsröhrchen19 (siehe Materialtabelle), um Proteine zu entfernen, und zentrifugieren Sie bei 13.700 × g bei 4 °C für 1 h. Das Abwasser wird aufgefangen und in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator (siehe Materialtabelle) bei 45 °C getrocknet.</li>
	<li>Entsalzen Sie die getrockneten Proben gemäß den Schritten 5.8.1 bis 5.8.8. Verwenden Sie reines Wasser in Massenspektrometriequalität als Lösungsmittel für die Reagenzien.<ol><li>Geben Sie 100 μl 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA) zu jeder Probe, um die getrockneten Peptide vollständig aufzulösen.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl 100 % Acetonitril (ACN) in jede Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie bei 400 × g für 3 Minuten bei RT und verwerfen Sie das Abwasser. Dann 100 μl 50 % ACN hinzufügen, 3 Minuten lang bei 400 × g zentrifugieren und das Abwasser entsorgen.</li>
		<li>Geben Sie 100 μl 0,1 % TFA in jede Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 400 × g und entsorgen Sie das Abwasser.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 5.8.3.</li>
		<li>Die in Schritt 5.8.1 gelösten Peptide werden in die Entsalzungskolonne pipettiert, bei 400 × g für 3 min zentrifugiert und das Abwasser gewonnen. Wiederholen Sie den Probenladeschritt, damit die Peptidprobe in die Entsalzungssäule adsorbiert werden kann.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 5.8.3 zweimal.</li>
		<li>Geben Sie 50 μl 50 % ACN (mit 0,1 % TFA) in die Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 400 × g und sammeln Sie das Abwasser (Peptide) in einem neuen Zentrifugenröhrchen in Massenspektrometriequalität.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Trocknen der entsalzten Peptide
<ol><li>Trocknen Sie die entsalzten Peptide in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator (Einstellungen: V-AQ-Modus , Temperatur: 45 °C und Zeit: 50 min) und verwenden Sie sie für die anschließende massenspektrometrische Analyse. HINWEIS: Der Extraktionsprozess der Peptide von sEVs sollte so weit wie möglich auf Eis durchgeführt werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Alle verwendeten Reagenzien wurden mit Wasser in Massenspektrometrie-Qualität hergestellt, um eine Kontamination des Kunststoffs zu vermeiden. Für Schritt 5.8 führt die Entsalzung zum unvermeidlichen Verlust der Peptidproben. Dieser Verlust kann durch Wiederholung der Schritte 5.8.5 und 5.8.7 verringert werden.</li>
</ol>7. Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Analyse
HINWEIS: Analysieren Sie die Peptidprobe mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), insbesondere mit dem Orbitrap Q Exactive HF-X-Massenspektrometer, das mit einem EASY-nLC 1000 Nano-Hochleistungs-LC-System verbunden ist (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Die Proben werden auf einer analytischen C18-Säule (1,9 μm Korndurchmesser, 15 cm Länge x 150 μm Innendurchmesser) bei einer Flussrate von 60 nL/min mit einem 65-minütigen Gradienten getrennt: 4 %-15 % für 4 min, 15 %-28 % für 28 min, 28 %-40 % für 10 min, 40 %-69 % für 10 min, 95 % konstant für 7 min, 95 % verringerten sich für 1 Minute auf 6 % und blieben 5 min konstant (Lösungsmittel A, Wasser mit 0,1 % Ameisensäure [FA]; Lösungsmittel B, 80 % Acetonitril mit 0,1 % FA, v/v).</li>
	<li>Ionisieren Sie die eluierten Peptide in einem Nano-Elektrospray-Ionisationssprühgerät (Nano-ESI) bei 320 °C Kapillartemperatur und einer Sprühspannung von 2,2 kV.</li>
	<li>Erfassen Sie die Massenspektraldaten im datenabhängigen Erfassungsmodus mit einem Auflösungsvermögen von 120.000 im Full-Scan-Modus und 15.000 im MS /MS-Modus .<ol><li>Führen Sie vollständige Scans im Orbitrap von 250 m/z bis 1800 m/z und Isolationsfenster mit 1,6 m/z durch.</li>
		<li>Wählen Sie die 20 intensivsten Ionen für die Fragmentierung der höherenergetischen Kollisionsdissoziation (HCD) mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 29 % aus und messen Sie sie im Ionenseparator. ANMERKUNG: Typische massenspektrometrische Bedingungen waren wie folgt: Die Ziele für die automatische Verstärkungsregelung (AGC) waren 3 x 106 Ionen für vollständige Scans und 2 x 105 für MS/MS-Scans; Die maximale Injektionszeit betrug 80 ms für vollständige Scans und 19 ms für MS/MS-Scans; und dynamischer Ausschluss wurde für 13 s verwendet.</li>
	</ol></li>
</ol>

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel und Extraktion ihres Peptidoms

<ol>
	<li>Kalluri, R., LeBleu, V. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics.">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach.">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li><li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome:+Chaos+or+inevitability.">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).</li><li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins.">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li><li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa.">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Bei der Untersuchung der Funktion von sEVs ist es unerlässlich, hochreine sEVs aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt13, und unter diesen Methoden haben auf differentieller Ultrazentrifugation basierende Methoden eine relativ hohe Reinheit von sEVs gezeigt. In dieser Studie wurden 200 ml Zellüberstand für 6 h gesammelt und etwa 200-300 μg sEVs wurden durch differentielle Ul...

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm sind in fast allen Arten von Körperflüssigkeiten vorhanden und werden von allen Arten von Zellen sezerniert, einschließlich Urin, Schweiß, Tränen, Liquor cerebrospinalis und Fruchtwasser1. Ursprünglich wurden sEVs als Behälter für die Entsorgung von zellulärem Abfall in Betracht gezogen, was im folgenden Jahrzehnt zu minimaler Forschung führte2. In jüngster Zeit gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass sEVs spezifische Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und andere Metaboliten enthalten. Diese Moleküle werden zu den Zielzellen3 transportiert und tragen zur interzellulären Kommunikation bei, durch die sie an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, wie z. B. Gewebereparatur, Angiogenese, Immunität4 und Entzündung 5,6, Tumorentwicklung und Metastasierung 7,8,9 usw.
Um die Untersuchung von sEVs zu erleichtern, ist es unerlässlich, sEVs aus komplexen Proben zu isolieren. Basierend auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften von sEVs, wie z. B. ihrer Dichte, Partikelgröße und Oberflächenmarkerproteinen, wurden verschiedene Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt. Zu diesen Techniken gehören auf Ultrazentrifugation basierende Methoden, partikelgrößenbasierte Methoden, auf Immunaffinitätsabscheidung basierende Methoden, sEVs-fällungsbasierte Methoden und mikrofluidikbasierte Methoden10,11,12. Unter diesen Techniken ist die auf Ultrazentrifugation basierende Methode weithin als Goldstandard für die Isolierung von sEVs anerkannt und die am häufigsten verwendete Technik13.
Immer mehr Hinweise deuten auf das Vorhandensein einer Vielzahl unentdeckter biologisch aktiver Peptide in den Peptidomen verschiedener Organismen hin. Diese Peptide tragen maßgeblich zu zahlreichen physiologischen Prozessen bei, indem sie Wachstum, Entwicklung, Stressreaktion 14,15 und Signaltransduktion16 regulieren. Das Ziel des Peptidoms von sEVs ist es, die von diesen sEVs getragenen Peptide aufzudecken und Hinweise auf ihre biologischen Funktionen zu geben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation vor, gefolgt von der Extraktion von Peptiden aus diesen sEVs zur weiteren Analyse ihres Peptidoms.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>AF1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357003</td>
			<td>High-speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8220</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Cell World</td>
			<td>N?A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP94</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>20292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti JXN-26</td>
			<td>Centrifuge rotor (JA-25.50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)</td>
			<td>National Institute of Biological Sciences, China</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l1149</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td>1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-high-performance LC system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EASY-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight NTA3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Bimake</td>
			<td>B14002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (TLA 55)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AF8258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Scientz</td>
			<td>SCIENTZ-IID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDocXRs</td>
			<td>Image lab 4.0 (beta 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3853</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of peptides of small extracellular vesicles from bone marrow-derived macrophages

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) werden typischerweise durch die Exozytose von multivesikulären Körpern (MVBs) sezerniert. Diese Nanovesikel mit einem Durchmesser von <200 nm sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden. Diese sEVs regulieren verschiedene biologische Prozesse wie Gentranskription und -translation, Zellproliferation und -überleben, Immunität und Entzündung durch ihre Ladungen wie Proteine, DNA, RNA und Metaboliten. Derzeit wurden verschiedene Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen entwickelt. Unter ihnen gilt die auf Ultrazentrifugation basierende Methode als Goldstandard und wird häufig für die Isolierung von Elektrofahrzeugen eingesetzt. Bei den Peptiden handelt es sich um natürliche Biomakromoleküle mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren. Diese Peptide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit biologischer Aktivität beteiligt, wie z. B. Hormone, Neurotransmitter und Zellwachstumsfaktoren. Das Peptidom soll körpereigene Peptide in spezifischen biologischen Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) systematisch analysieren. Hier haben wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation und extrahiertes Peptidom zur Identifizierung mittels LC-MS/MS eingeführt. Diese Methode identifizierte Hunderte von sEVs-abgeleiteten Peptiden aus aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen.

Small extracellular vesicles (sEVs) with a diameter of less than 200 nm are present in almost all types of body fluids and secreted by all kinds of cells, including urine, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid1. Initially, sEVs were considered as receptacles for disposing of cellular waste, which led to minimal research in the subsequent decade2. Recently, increasing evidence indicates that sEVs contain specific proteins, lipids, nucleic acids, and other metabolites. These molecules are transported to target cells3, contributing to intercellular communication, through which they participate in various biological processes, such as tissue repair, angiogenesis, immunity4 and inflammation5,6, tumor development and metastasis7,8,9, etc.
To facilitate the study of sEVs, it is imperative to isolate sEVs from complex samples. Different sEVs isolation methods have been developed based on the physical and chemical properties of sEVs, such as their density, particle size, and surface marker proteins. These techniques include ultracentrifugation-based methods, particle size-based methods, immunoaffinity capture-based methods, sEVs precipitation-based methods, and microfluidics-based methods10,11,12. Among these techniques, the ultracentrifugation-based method is widely recognized as the gold standard for sEVs isolation and is the most commonly used technique13.
An increasing amount of evidence suggests the presence of a multitude of undiscovered biologically active peptides in the peptidomes of various organisms. These peptides significantly contribute to numerous physiological processes by regulating growth, development, stress response14,15, and signal transduction16. The objective of sEVs&#39; peptidome is to uncover the peptides carried by these sEVs and provide clues to their biological functions. Here, we present a protocol of isolating sEVs through differential ultracentrifugation, followed by extraction of peptides from these sEVs for further analysis of their peptidome.

Autor im Rampenlicht: Peptidom-Extraktion aus kleinen extrazellulären Vesikel, die aus Makrophagen aus dem Knochenmark isoliert wurden 

Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark

We explore the functional roles of extracellular vesicles in innate immunity. We have developed a protocol to isolate small extracellular vesicles, or sEVs, via differential ultracentrifugation and identify the peptidome by LC-MS/MS, revealing the key biological functions of the peptides in sEVs. The extracellular vesicles have been shown to mediate intercellular communication by transporting cargo to recipient cells, such as proteins, lipids, and nucleic acids.By releasing antimicrobial components, they act the first line of defense against invading microbes in innate immunity. While differential ultracentrifugation yields highly pure small extracellular sEVs, it can be time-consuming and often results in low yields. In our study, these are major challenges for the stable identification of low-abundance peptides in the sEVs.

Für die durch differentielle Ultrazentrifugation isolierten sEVs (Abbildung 1) haben wir ihre Morphologie, Partikelgrößenverteilung und Proteinmarker gemäß der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17 bewertet.
Zunächst wurde die Morphologie von sEVs mittels TEM beobachtet und zeigte eine typische becherartige Struktur (Abbildung 2A). NTA zeigte, dass isolierte sEVs meist bei 136 nm konze...

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Wir untersuchen die funktionelle Rolle extrazellulärer Vesikel in der angeborenen Immunität. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mittels differentieller Ultrazentrifugation zu isolieren und das Peptidom mittels LC-MS/MS zu identifizieren, wodurch die biologischen Schlüsselfunktionen der Peptide in sEVs aufgedeckt werden. Es wurde gezeigt, dass die extrazellulären Vesikel die interzelluläre Kommunikation vermitteln, indem sie Fracht zu Empfängerzellen transportieren, wie z. B. Proteine, Lipide und Nukleinsäuren.Durch die Freisetzung antimikrobieller Komponenten fungieren sie als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroben in der angeborenen Immunität. Während die differentielle Ultrazentrifugation hochreine, kleine extrazelluläre sEVs liefert, kann sie zeitaufwändig sein und führt oft zu niedrigen Ausbeuten. In unserer Studie sind dies große Herausforderungen für die stabile Identifizierung von Peptiden mit geringer Häufigkeit in den sEVs.

identification-peptides-small-extracellular-vesicles-from-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

1.2K Aufrufe.  Anhui Medical University. Wir untersuchen die funktionelle Rolle extrazellulärer Vesikel in der angeborenen Immunität. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mittels differentieller Ultrazentrifugation zu isolieren und das Peptidom mittels LC-MS/MS zu identifizieren, wodurch die biologischen Schlüsselfunktionen der Peptide in sEVs aufgedeckt werden. Es wurde gezeigt, dass die extrazellulären Vesikel die interzelluläre Kommunikation vermitteln, indem sie Fracht zu Empfängerze...

Serie: Autor im Rampenlicht: Peptidom-Extraktion aus kleinen extrazellulären Vesikel, die aus Makrophagen aus dem Knochenmark isoliert wurden 

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of &lt;200 nm are present in various body fluids. These sEVs regulate various biological processes such as gene transcription and translation, cell proliferation and survival, immunity and inflammation through their cargos, such as proteins, DNA, RNA, and metabolites. Currently, various techniques have been developed for sEVs isolation. Among them, the ultracentrifugation-based method is considered the gold standard and is widely used for sEVs isolation. The peptides are naturally biomacromolecules with less than 50 amino acids in length. These peptides participate in a variety of biological processes with biological activity, such as hormones, neurotransmitters, and cell growth factors. The peptidome is intended to systematically analyze endogenous peptides in specific biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Here, we introduced a protocol to isolate sEVs by differential ultracentrifugation and extracted peptidome for identification by LC-MS/MS. This method identified hundreds of sEVs-derived peptides from bone marrow-derived macrophages.

This protocol describes a procedure to isolate small extracellular vesicles from macrophages by differential ultracentrifugation and extract the peptidome for identification by mass spectrometry.

Forschung

Biochemie

Isolating Small Extracellular Vesicles (sEVs) by Differential Ultracentrifugation

Isolating Small Extracellular Vesicles (SEVs) by Differential Ultracentrifugation  

To begin, centrifuge FBS overnight in an ultracentrifuge at 110, 000 G and four degrees Celsius to remove the endogenous sEVs. Sterilize the supernatant by filtering it through a 0.2 micron ultrafiltration membrane to yield sEVs-free FBS. Next in a 150 millimeter culture dish, plate about 3 times 10 to the seventh immortalized bone-marrow-derived macrophages in 20 milliliters of DMEM culture medium.Incubate the dish at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide overnight prior to collecting the sEVs from the macrophages. The next day, after discarding the medium, wash the cells with phosphate-buffered saline or PBS. Replace the medium with DMEM containing 10%sEVs-free free fetal bovine serum before incubating the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Based on the experiment's requirements, collect and transfer the cells'supernatant to 50 milliliter centrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 300 G for 10 minutes to remove the cells. Transfer the result in supernatant from each tube to a new 50 milliliter centrifuge tube and discard the pellet.This time, centrifuge the supernatant at 2000 G for 10 minutes to remove dead cells. Then transfer the supernatant to new high-speed centrifuge tubes and discard the pellets. Next to remove debris and microvesicles, centrifuge the obtained supernatant at 10, 000 G for 30 minutes using a high-speed centrifuge.Transfer the resulting supernatant to new ultracentrifuge tubes by adding 35 milliliters in each tube and discarding the pellets. Centrifuge the ultracentrifuge tubes in a swinging bucket rotor centrifuge at 110, 000 G for 70 minutes before discarding the supernatant. Wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with one milliliter of PBS.Again, add one milliliter of PBS to the washed pellet in one of the tubes, and mix by pipetting continuously. Transfer the one milliliter of resultant PBS suspension to another tube containing the pellet, and repeat the same until all pellets in the tubes are mixed by pipetting. Transfer the resultant one milliliter of sEVs-rich PBS to a new ultracentrifuge tube.Then centrifuge the new tube in a tabletop ultracentrifuge at 110, 000 G for 70 minutes. After discarding the supernatant, wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with 100 microliters of PBS. Add 1.2 milliliters of protein preparation solution in a standard protein tube to dissolve the 30 milligrams of BSA present in it.Dilute the resulting protein standard solution with PBS to reduce its concentration from 25 to 0.5 milligrams per milliliter. Add eight different volumes of the diluted protein standard solution into wells of a 96-well plate, and bring the volume to 20 microliters in each well using PBB. Add 18 microliters of HEPES lysis buffer to the sample wells, followed by the addition of two microliters of the sEVs samples.Next, add 200 microliters of BCA working solution prepared per the manufacturer's instructions into each well. Allow the plate to rest at room temperature for 20 to 30 minutes. Finally, measure the absorbance at 562 nanometers using a microplate reader.Calculate the total protein content in the sEVs using the obtained results. The transmission electron microscopy images of the isolated sEVs displayed a typical cup-like morphology. Nanoparticle tracking analysis showed that the isolated sEVs were mostly concentrated at 136 nanometers.Western blot showed that isolated sEVs were significantly enriched of sEVs markers, including CD9, beta-actin, and TSG101. The endoplasmic reticulate marker GRP94 was only detected in the whole-cell lysate. The results indicated that the method employed yielded sEVs with a high level of purity.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) durch differentielle Ultrazentrifugation

Extraction of Peptides from Isolated Small Extracellular Vesicles (sEVs)

To begin, wash the isolated small extracellular vesicles or SEVs twice by ultracentrifugation at 110, 000 G and four degrees Celsius for 70 minutes. Re-suspend the vesicles in 500 microliters of phosphate buffered saline or PBS. Then, add five microliters of 100X protease inhibitor to it.Subject the sample to ultrasonic crushing at 40 watts for 10 minutes, with three second ultrasonic time, and five second interval time. Centrifuge the crushed mixture at 13, 700 G for 15 minutes at four degrees Celsius. To the obtained supernatant, add dithiothreitol to a final concentration of 50 millimolar.And incubate it in a water bath at 56 degrees Celsius for 30 minutes. Then add 50 microliters of one molar iodoacetamide to the supernatant. And allow it to react at room temperature for 20 minutes in the dark.Centrifuge the mixture at 13, 700 G and four degrees Celsius for 15 minutes. And transfer the supernatant containing the crude peptide extract to a 10 kilodalton ultracentrifuge tube. Remove protein from the crude peptide by centrifuging the ultra filtration tube at 13, 700 G and four degrees Celsius for one hour.Dry the collected effluent in a vacuum centrifugal concentrator at 45 degrees Celsius. For desalting, use mass spectrometry grade pure water as a solvent for all reagents. First, dissolve the dry peptides in 100 microliters of 0.1%trifluoracetic acid or TFA, and keep it aside.Then add 100 microliters of pure acetonitrile to each desalting column. Centrifuge the columns at 400 G for three minutes at room temperature, and discard the effluent. Then add 100 microliters of 50%acetonitrile per desalting column, and repeat the centrifugation as mentioned previously before discarding the effluent.Next, add 100 microliters of 0.1%TFA to each desalting column before centrifuging as mentioned previously. Once again, discard the effluent. Now, pipet the desalt peptides into the desalting column.Centrifuge the columns as mentioned previously to load the sample. Add the recovered effluent back to the desalting column to repeat the loading. Then, add 100 microliters of 0.1%TFA.Centrifuge as mentioned previously, and discard the effluent. Finally, add 50 microliters of 50%acetonitrile containing 0.1%TFA to the peptide in the desalting column. After centrifusion, as mentioned previously, collect the effluent in a new mass spectrometry grade centrifuge tube.