Wir danken Valentina Greco für die K14-mCherry-H2B Mäuse. Wir danken der Maschinenwerkstatt des Emory University Physics Department für die Herstellung der Deckglasscheiben. Diese Arbeit wurde finanziert durch den Career Development Award #IK2 BX005370 des US Department of Veterans Affairs BLRD Service an LS, die NIH Awards RF1-AG079269 und R56-AG072473 an MJMR und den I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award an MJMR.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Emory University und des Atlanta Veterans Affairs Medical Center für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Einbau des Live-Imaging-Einsatzes auf den inversen Mikroskoptisch
<ol><li>Erstellen Sie die Einfügung mithilfe von STL-Dateien (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3), die die 3D-Abmessungen und das Design angeben (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2A), einen 3D-Drucker und Polymilchsäure (PLA).</li>
	<li>Setzen Sie den Einsatz (Abbildung 2B,C) vorsichtig in die große Nut des Mikroskoptisches ein (Abbildung 2C und Abbildung 3A). Befestigen Sie den Einsatz mit Schrauben über vier Schraubenlöcher in jeder Ecke des Einsatzes (Abbildung 2B-C). HINWEIS: Der Einsatz ist bidirektional und kann je nach Ausrichtung des Mikroskoptisches und des Anästhesiegeräts um 180° gedreht werden.</li>
	<li>Schieben Sie die Heizplatte mit der Seite nach unten in den Einsatzstopfen (Abbildung 2D), sodass das Gerät auf den unteren Einsatznuten liegt und der Steckeranschluss unter dem Tisch verläuft (Abbildung 3B).</li>
	<li>Richten Sie die gerillte kreisförmige Öffnung im Einsatz mit einem 40-fachen Silikonöl-Tauchobjektiv aus (Abbildung 3C) und tragen Sie Silikonöl auf die Mitte des Objektivs auf.<ol><li>Wenn Sie über einen längeren Zeitraum (>1 h) fotografieren, tragen Sie einen großzügigen Klecks Öl auf, der während der gesamten Bildgebung an der Schnittstelle zwischen Deckglas und Objektiv verbleibt. Achten Sie darauf, dass kein Öl über die Ränder des Objektivs läuft.</li>
	</ol></li>
	<li>Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Vakuumfett entlang der gerillten kreisförmigen Öffnung auf und legen Sie die Deckglasscheibe darauf, um den Einsatz zu versiegeln (Abbildung 3D). HINWEIS: Die Deckglasscheibe wird hergestellt, indem die Wände einer 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschale mit Glasboden entfernt werden (durchgeführt von einer Maschinenwerkstatt).</li>
	<li>Heben Sie das 40-fache Objektiv an, bis das Öl die Unterseite des Deckglases küsst.</li>
</ol>2. Isofluran-Konfiguration und Mausvorbereitung
<ol><li>Positionieren Sie die Komponenten des elektronischen Verdampfers mit geringem Durchfluss (Anästhesiekammer, Schlauch, Verdampfer, Aktivkohlekanister) so, dass der Nasenkonus und der angeschlossene Schlauch den Einsatz erreichen können (Abbildung 3A). VORSICHT: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden, um ein Verschütten zu vermeiden und die Exposition des Menschen zu minimieren.</li>
	<li>Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche vor Gebrauch und protokollieren Sie. Befestigen Sie die Kappe des elektronischen Vaporizers an der Isofluranflasche.</li>
	<li>Schließen Sie das Netzkabel an den elektronischen Vaporizer an. Schließen Sie die blauen Nasenkonus-Clips und öffnen Sie die weißen Induktionskammer-Clips, um einen Luftstrom durch die Kammer in den Aktivkohlekanister zu ermöglichen. Entfernen Sie die rote Umgebungsluftkappe von der linken Seite des Geräts, um den Luftstrom zu ermöglichen.</li>
	<li>Lassen Sie das System 5 Minuten lang bei 200 ml/min (geringer Durchfluss) und 2 % Isofluran aufwärmen. HINWEIS: Obwohl die Nasenkonuseinstellung ausgewählt ist, sollte die blaue Nasenkonusleitung geschlossen bleiben und die weiße Induktionskammerleitung offen bleiben.</li>
	<li>Sobald das System richtig ausbalanciert ist, spülen Sie die Leitungen, um das verbleibende Isofluran aus der Kammer zu entfernen.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer und wählen Sie High Flow. Schließen Sie alle Vorbereitungen für die Maus ab (d. h. Haarentfernung, topische Verabreichung von Medikamenten, Auftragen von Augensalbe usw.), bevor Sie den Körper des Tieres auf den Einsatz legen. Vergewissern Sie sich, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie die Zehenkneifreflexmethode anwenden.<ol><li>Verwenden Sie mit gestrecktem Bein einen Fingernagel, um den Zeh fest einzuklemmen, ohne körperliche Schäden zu verursachen. Wenn die Maus eine positive Reaktion auf den Reiz zeigt (z. B. Zurückziehen des Beins, Zucken des Fußes usw.), setzen Sie die Verabreichung des Anästhetikums in der Kammer fort, bis keine Reaktion mehr beobachtet wird. Nach entsprechender Betäubung sollte sich die Atemfrequenz der Maus auf ~55-65 Atemzüge pro Minute verlangsamen18.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn die Maus vollständig betäubt ist, wählen Sie erneut High Flow, um die Isofluran-Verabreichung zu stoppen. Spülen Sie die Kammer vor dem Öffnen und stellen Sie die Clips (blau: offen; weiß: geschlossen) so ein, dass Isofluran durch den Nasenkonus abgegeben wird. Wählen Sie Low Flow, während der Nasenkonus an der Maus befestigt ist, um die Verabreichung von Isofluran fortzusetzen.</li>
	<li>Isofluran-Schlauch mit dem aufgesetzten Nasenkonus durch die Eckrohrhalterung am Einsatz führen (Abbildung 3A und Abbildung 5).</li>
</ol>3. Platzierung der Maus auf dem Einsatz für die intravitale Bildgebung
<ol><li>Schließen Sie die Heizplatte an den Controller an (mit angeschlossener Analsonde), schalten Sie sie ein und lassen Sie die Platte 36 °C erreichen (Abbildung 4A).</li>
	<li>Nehmen Sie die betäubte Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie quer über die Heizplatte (Abbildung 4B und Abbildung 5A). Führen Sie den Transfer von der Kammer zum Einsetzen schnell durch, um die Zeit zu minimieren, in der die Maus ohne Inhalationsanästhesie aktiv ist.</li>
	<li>Befestigen Sie den Nasenkonus an der Maus (Abbildung 4B, C und Abbildung 5). Verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um den Winkel und die Positionierung des Nasenkonus weiter zu sichern.</li>
	<li>Führen Sie die Analsonde ein und stellen Sie die Temperatur des Reglers ein, bis die Körpertemperatur der Maus stabil bei ~36 °C liegt (Abbildung 4A,B). Nachdem die Maus richtig positioniert ist, verwenden Sie bei Bedarf eine Frischhaltefolie, um die Wärme einzufangen und die entsprechende Körpertemperatur weiter zu unterstützen (Abbildung 4C).</li>
	<li>Positionieren Sie die Maus so, dass der Kopf mit der Deckglasscheibe ausgerichtet ist, und fixieren Sie das Ohr mit einem Ohrclip aus Metall (Abbildung 5A,B) oder Klebeband (Abbildung 5C) in der Mitte des Deckglases. HINWEIS: Der Druck des Ohrclips aus Metall auf das Ohr kann durch Lösen der Schraube, mit der der Clip am Einsatz befestigt ist, eingestellt werden. Eine Metallfeder kann hinzugefügt werden, um die Flexibilität beim Anziehen des Clips zu erhöhen.<ol><li>Um die Position des Ohrclips zu ändern, lösen Sie die Schraube mit einem 2,5-mm-Inbusschlüssel und übertragen Sie sie an die sekundäre Stelle (Abbildung 2B,C). Wenn Sie den Ohrclip wieder zusammenbauen, legen Sie den Clip an den Einsatz, gefolgt von der Unterlegscheibe darauf. Befestigen Sie den Clip mit einer Schraube mit leichtem Kraftaufwand, um den Clip zu schwenken.</li>
	</ol></li>
	<li>Passen Sie die Z-Positionierung des Objektivs an, bis sich die Zellen innerhalb der Fokusposition befinden (Abbildung 6A,D). Stellen Sie den Z-Stapel und die Zeitrafferparameter entsprechend den experimentellen Zielen ein und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. HINWEIS: Wenn die richtige Einstellung erreicht ist, kann das Mausohr für mindestens 3 aufeinanderfolgende Stunden abgebildet werden (Abbildung 6A',D').<ol><li>Sobald die Z-Stack-Grenzen festgelegt sind, passen Sie die Laserleistung und -verstärkung an, um sicherzustellen, dass keine Z-Ebene übersättigt ist, um das Photobleaching zu minimieren. Bestimmen Sie die Zeitrafferparameter anhand der Gesamtdicke des Z-Stapels, der Schrittnummern (Nyquist-Abtastung empfohlen) und der Zeitintervalle.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Bildgebungsparameter (Zeitintervalle, Gesamtbildgebungszeit usw.) anhand mehrerer Faktoren, einschließlich der Lebensfähigkeit des Tieres unter Narkose, laserinduzierter Photobleichung/Phototoxizität und des Ziels der Live-Bildgebung (d. h. Zellteilungsdynamik, Zell-Zell-Interaktionen usw.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beendigung der Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie das wasserumwälzende Heizkissen ein und stellen Sie es mindestens 30 Minuten lang auf Dauerzyklus und 35 °C ein, bevor die Bildaufnahme beendet wird.</li>
	<li>Wählen Sie nach Abschluss der Bildgebung Low Flow auf dem elektronischen Vaporizer, um die Isofluran-Abgabe zu stoppen, und bewegen Sie die Maus auf ein Wärmekissen, bis sie gehfähig ist.</li>
	<li>Sobald Sie wach sind, bewegen Sie die Maus zurück zum Transferbehälter, während Sie sie weiterhin auf einem Wärmekissen halten, bis Sie vollständig gehfähig sind. Überwachen Sie die Maus konsequent, während sie sich auf dem Wärmekissen befindet, bis sie reagiert.</li>
	<li>Klicken Sie auf dem elektronischen Vaporizer auf Menü auswählen > Anästhesiesteuerung > leer. Nehmen Sie die Isofluranflasche aus dem System und setzen Sie die Kappe des Herstellers wieder auf die Flasche.</li>
	<li>Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche und des Aktivkohlekanisters und tragen Sie die Gewichte in das Protokoll ein. Sobald der Aktivkohlekanister 50 g über dem Ausgangswert wiegt, entsorgen Sie den Kanister und ersetzen Sie ihn durch ein neues Gerät. Lege das Isofluran zurück in den Tresorkasten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Deckglas und wischen Sie es mit Linsenpapier und Linsenlösung ab. Richtig lagern, um Kratzer bei der Wiederverwendung zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Anästhesieschlauch aus der Einsatzhalterung und schrauben Sie den Einsatz vom Mikroskoptisch ab.</li>
</ol>

Intravitale Bildgebung mit einem inversen Mikroskop zur Verfolgung der Dynamik von Hautzellen

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. 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J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung von intakten Hautepithelien der Maus auf inversen konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Diese Erfindung besteht aus PLA, dem gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-druckbaren Material; Alle internen 3D-Druckkosten für diesen Einsatz belaufen sich auf 5 <$. Die beiden separaten Einlegeteile (Abbildung 1, Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) las...

Die intravitale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Überwachung des Zellverhaltens in ihrer ungestörten In-vivo-Umgebung ermöglicht. Diese einzigartige Methode hat wichtige Einblicke in das Innenleben komplexer Organsysteme von Säugetieren geliefert, darunter Lunge1, Gehirn2, Leber3, Brustdrüse4, Darm5 und Haut6. Darüber hinaus hat dieser Ansatz Zellverhaltensänderungen während der Tumorentwicklung7, der Wundheilung8,9, der Entzündung10 und anderer verschiedener Pathologien in situ aufgedeckt. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Verbesserung der Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie zur Abbildung von Live-Epithel- und Stromadynamik in intakter Maushaut. Das Verständnis des Zellverhaltens in der Haut von Säugetieren ist aufgrund der bemerkenswerten regenerativen und tumorigenen Fähigkeit dieses Gewebes von großer klinischer Bedeutung.
Die intravitale Bildgebung bei Mäusen wurde hauptsächlich mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen durchgeführt, da diese eine hochauflösende Bildgebung in Gewebetiefen >100 μm ermöglichen11,12. Nichtsdestotrotz fehlt diesen Instrumenten die Vielseitigkeit und allgemeinere Zugänglichkeit von inversen konfokalen Mikroskopen, die benutzerfreundlicher und kostengünstiger sind, die Möglichkeit bieten, kultivierte Zellen abzubilden, bei der Bildaufnahme keine völlige Dunkelheit erfordern und im Allgemeinen sicherer sind, neben anderen bemerkenswerten Vorteilen13,14. In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das die Zugänglichkeit der intravitalen Bildgebung erheblich verbessert, indem es diesen Ansatz für inverse konfokale Mikroskope adaptiert.
Hier präsentieren wir ein 3D-gedrucktes, kundenspezifisches Tischeinsatzdesign, das mehrere Schlüsselfunktionen enthält, um eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung der Ohrhaut von Mäusen auf einem inversen konfokalen Mikroskop zu ermöglichen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5). Zu diesen speziellen Merkmalen gehört ein versetztes Objektivloch, das es ermöglicht, dass der gesamte Körper einer erwachsenen Maus während der Bildgebung völlig flach liegt. Dies minimiert die Vibrationsstörung der Körperbewegungen von Mäusen bei der Bildgebung und eliminiert die Notwendigkeit, Ketamin und Xylazin zu verabreichen, um die Atmung zu dämpfen, eine Praxis, die oft mit intravitaler Bildgebung gekoppelt ist6. Darüber hinaus positionieren Eckklammern am Einsatz einen Isofluran-Nasenkonus korrekt, um sich an der Vorderseite der Maus auszurichten, ein Ohrclip aus Metall immobilisiert das Mausohr an einer speziell angefertigten Deckglasscheibe, und eine optionale abnehmbare Biofeedback-Heizplatte mit geschlossenem Regelkreis liegt bündig im Einsatz, um die Körpertemperatur der Maus bei langen Bildgebungssitzungen zu unterstützen. Die maßgeschneiderte Deckglasscheibe, die eine flache Oberfläche bietet, die für das flache Liegen des Mauskopfes und des Ohrs unerlässlich ist, wurde in einer Maschinenwerkstatt hergestellt, indem die Wände einer generischen Deckglasschale mit Zellkulturschalen entfernt wurden. Die Verwendung einer 40-fachen Silikonöl-Immersionslinse (1,25 numerische Apertur [N.A.], 0,3 mm Arbeitsabstand) in Verbindung mit der Deckglasscheibe und dem benutzerdefinierten Tischeinsatz liefert hochauflösende Bilder >50 μm tief in die Ohrdermis.
Um die Funktionalität dieses neuen inversen Mikroskoptischeinsatzes zu testen, haben wir Z-Stapel, die alle epidermalen Epithelschichten umfassen, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr einer lebenden transgenen K14-H2B-mCherry15 adulten Maus aufgenommen (Epithelkerne in dieser Mauslinie enthalten eine rot fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6A-A'). Wir haben auch Z-Stapel aufgenommen, die sich über mehrere Fibroblastenschichten innerhalb der Hautdermis erstrecken, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr eines lebenden transgenen Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adulte Maus (Fibroblastenkerne in dieser Mauslinie enthalten nach Doxycyclin-Induktion eine grün fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6B-D'). Unsere hochauflösenden Daten zeigen eine gleichbleibende Stabilität durch keine Drift in der x-, y- und z-Ebene und belegen damit die Wirksamkeit dieses neuen intravitalen Bildgebungswerkzeugs für den Einsatz an inversen Mikroskopen. Wichtig ist, dass die Abmessungen dieses 3D-gedruckten Tischeinsatzes angepasst werden können, wie in Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3 beschrieben, um in jedes inverse Mikroskop zu passen, und die Positionierung der Objektivöffnung kann an alternative Stellen innerhalb des Einsatzes verschoben werden, um der Abbildung eines bestimmten Gewebe- und/oder Tiermodells von Interesse besser gerecht zu werden. Diese Erfindung kann somit einzelne Laboratorien oder Forscher mit konfokalem Zugang zu Kerneinrichtungen in die Lage versetzen, dieses Werkzeug an ihre einzigartigen intravitalen Bildgebungsanforderungen anzupassen und dadurch die Bewertung verschiedener In-vivo-Zellbiologie zu rationalisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

Das Verständnis des normalen und aberranten Verhaltens von In-vivo-Zellen ist notwendig, um klinische Interventionen zu entwickeln, die den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit vereiteln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, bildgebende Verfahren zu optimieren, die die Beobachtung der Zelldynamik in situ ermöglichen, wo die Gewebestruktur und -zusammensetzung ungestört bleiben. Die Epidermis ist die äußerste Barriere des Körpers und die Quelle der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen, nämlich des Hautkarzinoms. Die Zugänglichkeit von Hautgewebe bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Epithel- und Hautzellen bei intakten Tieren mit nicht-invasiver intravitaler Mikroskopie zu überwachen. Nichtsdestotrotz wurde dieser ausgeklügelte Bildgebungsansatz in erster Linie mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen erreicht, die für die meisten Forscher eine erhebliche Eintrittsbarriere darstellen. In dieser Studie wird ein speziell entwickelter, 3D-gedruckter Mikroskoptischeinsatz vorgestellt, der für die Verwendung mit inversen konfokalen Mikroskopen geeignet ist und die intravitale Langzeitbildgebung der Ohrhaut in lebenden transgenen Mäusen optimiert. Wir glauben, dass diese vielseitige Erfindung, die an die Marke und das Modell des inversen Mikroskops angepasst und an die Abbildung zusätzlicher Organsysteme angepasst werden kann, sich als unschätzbar wertvoll für die größere wissenschaftliche Forschungsgemeinschaft erweisen wird, indem sie die Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie erheblich verbessert. Dieser technologische Fortschritt ist entscheidend für unser Verständnis der Dynamik lebender Zellen in normalen und krankheitsbedingten Kontexten.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Werkzeugs für den Einsatz von inversen konfokalen Mikroskopen für die In-vivo-Intravitalbildgebung 

Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

Die korrekte Montage des Live-Imaging-Einsatzes auf einem inversen konfokalen Mikroskop und die geeignete Ausrichtung einer transgenen Maus auf dem Einsatz wird durch die Erfassung von Z-Stapeln von fluoreszenzmarkiertem, lebendem Ohrgewebe über einen Zeitverlauf von ≥1 h mit minimalen Anzeichen einer Drift in der x-, y- und z-Achse validiert. Die Bilder sollten in gleichmäßigen Intervallen aufgenommen werden (die Intervallzeit hängt von der biologischen Fragestellung, der Stärke des Fluoreszenzsignals usw. ab), d...

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Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug zur Vereinfachung der intravitalen Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie dar.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Wir haben ein Werkzeug entwickelt, um intravitale Bildgebung an lebenden Mäusen mit einem inversen konfokalen Mikroskop durchzuführen. Dies ermöglicht es uns, die Dynamik der Hautzellen während der gesamten Homöostase zu verfolgen und das Zellverhalten während des Krankheitsbeginns und -fortschreitens zu vergleichen. Die Multiphotonenmikroskopie ist der primäre Ansatz, um eine intravitale Zellverfolgung zu erreichen.Zu den Nachteilen dieser Mikroskope gehören jedoch die begrenzte Vielseitigkeit der täglichen Bildgebung, die hohen Kosten und die technische Komplexität. Unser neues Tool ermöglicht den Einsatz vielseitiger inverser konfokaler Mikroskope für die In-vivo-Intravital-Bildgebung. Durch Modifikation der Designdatei können die Abmessungen des Tischeinsatzes an jedes inverse Mikroskop angepasst werden.Das Objektivloch kann in der Größe geändert und neu positioniert werden, um es an jedes Tiermodell und Gewebe Ihrer Wahl anzupassen.

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Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K Aufrufe.  Emory University School of Medicine. Wir haben ein Werkzeug entwickelt, um intravitale Bildgebung an lebenden Mäusen mit einem inversen konfokalen Mikroskop durchzuführen. Dies ermöglicht es uns, die Dynamik der Hautzellen während der gesamten Homöostase zu verfolgen und das Zellverhalten während des Krankheitsbeginns und -fortschreitens zu vergleichen. Die Multiphotonenmikroskopie ist der primäre Ansatz, um eine intravitale Zellverfolgung zu erreichen.Zu den Nachteilen dieser Mikroskope gehören jedoch die begrenz...

Serie: Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Werkzeugs für den Einsatz von inversen konfokalen Mikroskopen für die In-vivo-Intravitalbildgebung 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Forschung

Biologie

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

Installieren des Live-Imaging-Einsatzes auf einem inversen Mikroskoptisch

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.