Die Autoren würdigen die Beiträge von Dr. Cesar Ramirez bei der Entwicklung der ersten Methoden. Diese Forschung wurde durch die NIAID-Zuschüsse finanziert, die an FGN, Projekt 22-21244S, R21AI167849 der Czech Science Foundation, Tschechische Republik, an MN vergeben wurden.

1. Vorbereitung der Probe
<ol><li>Insekten-Dissektion<ol><li>Präparieren Sie die Eierstöcke der Aedes aegypti-Mücke im Alter von 7 Tagen in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung mit Mikronadeln.</li>
		<li>Sammeln Sie acht Eierstöcke aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Mikronadeln und lagern Sie sie in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 °C.</li>
		<li>Sammeln Sie Eierstöcke in biologischen Replikaten.</li>
	</ol></li>
	<li>Extraktion von Lipiden<ol><li>Geben Sie 10 μl internen Standard (ISTD) in einer Konzentration von 1 ppm in die acht entnommenen Eierstöcke. Das ISTD ist ein markiertes Lipidgemisch mit sieben Deuterium von 1-Pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin-D7 (15: 0-18:1 (D7) PC), Lysophosphatidylcholin-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamin-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-Dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-Octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), Cholesteryloleat-D7 (18:1 (D7) Cholester).</li>
		<li>Warten Sie, bis es bei Raumtemperatur trocken ist. 100 μl Butanol/Methanol und 3 μl butyliertes Hydroxytoluol zugeben. 10 s lang manuell mit 1,5 mL Polypropylen-Stößeln homogenisieren.</li>
		<li>Den Stößel mit 200 μl Butanol/Methanol spülen und mit der homogenisierten Lösung vermengen.</li>
		<li>Beschallen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur und mittlerer Leistung für 30 min.</li>
		<li>Zentrifugenröhrchen bei 1600 x g für 10 min bei 20 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein Autosampler-Fläschchen mit 300 μl silanisierten Glaseinsätzen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Einrichtung des Instruments
<ol><li>Vorbereitung der mobilen Phase<ol><li>Bereiten Sie die mobile Phase mit einer Zusammensetzung von 30:40:30 (mobile Phase A) und 10:5:85 (mobile Phase B) unter Verwendung von Acetonitril, Wasser und Isopropanol als jeweiligem Verhältnis vor. In beiden mobilen Phasen werden 10 mmol/l Ammoniumformiat in Wasser und 0,1 % Ameisensäure zugegeben, um eine Pufferbedingung zu schaffen.</li>
		<li>Wiegen Sie 3,15 g Ammoniumformiat in 10 ml Wasser ab. Geben Sie 500 μl dieser Lösung in 12,5 ml Wasser. Nacheinander in einen 250-ml-Messkolben geben und etwa 2/3 des Kolbens mit Isopropanol füllen. Durch Schwenken mischen.</li>
		<li>Geben Sie 250 μl Ameisensäure (85 %), füllen Sie es mit 25 mL Acetonitril und Isopropanol bis zur Fülllinie von 250 mL und mischen Sie.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmen Sie im MS-System auf der linken Seite des Bildschirms bei den MS-Einstellungen den Massenbereich, indem Sie 50 als Minimum und 1850 als maximale Scan-Einstellung auswählen.<ol><li>Wählen Sie Polarität als positiven Ionenmodus. Wählen Sie den Scan-Modus als DIA-PASEF aus. Wählen Sie dazu Analysemethode aus einer vorherigen DDA-Methode mit den folgenden LC-Parametern optimieren und öffnen.<ol><li>Für die Gradiententrennung: Probeninjektion: 0% B, Haltezeit 1 min. Auf 55% B erhöhen, bis 6.4 Min. halten. Auf 65% B erhöhen, bis 24 Min. halten. Auf 88% B erhöhen, bis 40.8 min halten. Auf 95% B erhöhen, bis 48.1 Min. halten. Auf 35% B abnehmen, bis 56 min halten. Auf 0% B abnehmen, bis 60 min halten.</li>
			<li>Für HPLC-Bedingungen: Injektionsvolumen: 5 μL Lösungsmittelrate: 0,25 mL/min Gesamtlaufzeit: 60 min, davon 5 min zur Vorkonditionierung der Säule.</li>
			<li>Bereiten Sie den Flüssigkeitschromatographen vor, indem Sie die Säule in den Flüssigkeitschromatographen einsetzen. Führen Sie eine Rohlinge aus, um die Säule zu reinigen und auf Undichtigkeiten zu prüfen. Dies zeigt sich darin, dass das Instrument keinen Druck oder Durchfluss hält.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Um eine neue Methode zu erstellen, führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus (Abbildung 1 und Abbildung 2).<ol><li>Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf Alle Instrumente verbinden. Wenn die Verbindung erfolgreich hergestellt wurde, piept das LC-System einmal, und auf dem Steuerungsbildschirm wird HyStar im Statusfeld ohne Fehlermeldungen angezeigt.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Akquisition . Suchen Sie im Beispieltabellen-Navigator das Dropdown-Menü für das Tag, und wählen Sie eine vorherige Methode aus.</li>
		<li>Verdoppeln Sie die letzte Beispieltabelle. Klicken Sie auf Speichern unter... und speichern Sie die neue Probenliste im Format: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX), wobei (XXXX) ein kurzer Deskriptor der Analyse ist.</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Trennmethode und klicken Sie auf Methode bearbeiten. Klicken Sie auf Modulmethode bearbeiten.</li>
		<li>Klicken Sie auf Download. Wenn erfolgreich, wird Download erfolgreich angezeigt. Schließen Sie den Bildschirm ohne Speichermethode.</li>
		<li>Gehen Sie unter MS-Einstellungen zu TIMS-Einstellungen, wählen Sie 1/k0 Start bei 0,70 und 1/k0 Ende bei 1,85. Legen Sie die Rampenzeit auf 150 ms fest. Damit werden das Tastverhältnis und die Rampenrate automatisch angepasst.</li>
		<li>Wählen Sie im unteren Fenster die Registerkarte Quelle aus. Wählen Sie den Quellentyp als ESI und stellen Sie den Offset der Endplatte auf 800 V und die Kapillare auf 4500 V ein. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen des Verneblers und stellen Sie den Druck auf 4,0 bar ein. Stellen Sie das Trockengas auf 4,0 l/min und die Trockentemperatur auf 250 °C ein.</li>
		<li>Wählen Sie rechts neben der Registerkarte "Quelle" die Registerkarte "Optimieren" aus. Klicken Sie auf die Registerkarte "Allgemein " und stellen Sie unter der Überschrift "Übertragung" die folgenden Parameter sicher: Auslenkung 1 Delta: 70 V Trichter 1 RF: 250 vpp isCID-Energie: 0 eV Trichter 2 RF: 250 vpp Mehrpolig HF: 500 S/S.<ol><li>Stellen Sie unter der Überschrift der Kollisionszelle die folgenden Parameter sicher: Kollisionsenergie: 6,0 eV Kollision RF: 1200 vpp.</li>
			<li>Stellen Sie unter der Überschrift Quadrupol die folgenden Parameter sicher: Ionenenergie: 6 eV Geringe Masse: 250 m/z.</li>
			<li>Stellen Sie auf der Registerkarte "Pre-TOF" im Fokus die folgenden Parameter sicher: Übertragungszeit: 45 μs Vor-Impuls-Speicher: 5,0 μs.</li>
		</ol></li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Unterverarbeitung (Processing Sub). Bei der Massenspektren-Peak-Detektion werden die folgenden Parameter sichergestellt: Absolute Schwelle: 667 Absoluter Schwellenwert (pro 100 ms AccuTime): 445.<ol><li>Bei der Erkennung von Mobilitätsspitzen sind folgende Parameter zu beachten: Absolute Schwelle: 30,00.</li>
		</ol></li>
		<li>Klicken Sie auf die Unterregisterkarte TIMS . Stellen Sie auf der Registerkarte Versätze die folgenden Parameter sicher: Δt1: -20 V Δt2: -150 V Δt3: 70 V Δt4: 150 V Δt5: 0 V Δt6: 150 V Kollisionszelle: 300 V.</li>
		<li>Klicken Sie rechts neben der Registerkarte "Optimieren" auf die Registerkarte "MS/MS ". Stellen Sie auf der Registerkarte "Vorläuferionen" die folgenden Parameter sicher: Anzahl der PASEF-Rampen: 8 Mindestgebühr: 1 Maximale Ladung: 1.<ol><li>Klicken Sie auf der Registerkarte Planung auf Erweitert , und stellen Sie sicher, dass die folgenden Parameter vorhanden sind: Intensitäten: 0,1500, 5000, 10000 Wiederholung: 1, 10, 5, 1 Schwellenwert für Intensität: 1500.</li>
			<li>Stellen Sie auf der Registerkarte "Aktiver Ausschluss" die folgenden Parameter sicher: Häkchen für aktiven Ausschluss Freigabe nach: 0,4 min.</li>
			<li>Unter den Einstellungen für die Kollisionsenergie sind folgende Parameter zu beachten: K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60 Kollisionsenergie (eV): 20.00, 35.00.</li>
			<li>Stellen Sie bei der Isolation die folgenden Parameter sicher: Masse (m/z): 622, 1222 Breite (m/z): 1,00 2,50.</li>
		</ol></li>
		<li>DIA -PASEF einrichten: Wählen Sie DIA-PASEF aus den MS-Einstellungen auf der linken Seite aus. Wählen Sie auf der Registerkarte MS/MS die Option Fenstereditor aus. Stellen Sie hier die folgenden Parameter sicher (Abbildung 3): Fenstereinstellungen: Massenbreite: 50 Da; Massenüberlappung: 0,0 Da; Berechnen Sie aus Polygon: Massenschritte; Anzahl der Mobilitätsfenster: 1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kalibrierung
<ol><li>Kalibrierung des Geräts (Abbildung 4)<ol><li>Klicken Sie auf dem Unterreiter Kalibrierung auf m/z, wählen Sie Tuning Mix aus dem Dropdown-Feld und klicken Sie auf Kalibrieren in der unteren rechten Ecke.</li>
		<li>Klicken Sie weiter auf Kalibrieren , bis eine Punktzahl von 100 % erreicht ist.</li>
		<li>Wählen Sie nun die Registerkarte Mobilität und führen Sie die gleichen Schritte wie oben aus, bis die Kalibrierungsbewertung von 100 % erreicht ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrierkurve<ol><li>Spike-Lipid-interne Standardmischung mit 10 μl deuterierter interner Standardmischung. Verwenden Sie sieben Kalibrierpunkte von 0,1 bis 500 ng/ml Standardgemisch mit 10 μl des deuterierten internen Standardgemisches.</li>
		<li>Annotation der Fettsäureketten auf der Grundlage der bereits inNummer 2 beschriebenen PASEF MS/MS-Muster manuell.</li>
	</ol></li>
	<li>Effizienz der SIL-Etikettierung<ol><li>Berechnen Sie das Verhältnis der Fläche der SIL, die Isotope enthält, zur Fläche der Nicht-SIL, die Isotope enthält.</li>
		<li>Berechnen Sie das theoretische Muster, indem Sie die Wahrscheinlichkeit bestimmen, ein markiertes Atom an einer beliebigen Stelle zu finden.</li>
		<li>Berechnen Sie die SIL-Anreicherung, indem Sie die experimentellen Isotopenprofile an das theoretische Muster anpassen, das auf einer Datenanalysesoftware simuliert wurde.</li>
	</ol></li>
	<li>Starten des Laufs<ol><li>Aktivieren Sie den Säulenofen, indem Sie auf die Schaltfläche Thermometer klicken. Aktivieren Sie die Pumpen, indem Sie auf die Schaltfläche Ventil klicken.</li>
		<li>Legen Sie die MS-Methode auf die zuvor gespeicherte Methode fest. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 5 μl beträgt und dass Leitung 1 auf das Fläschchen 20:1 abzielt.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Fläschchen 20:1 50 % IPA/ACN enthält. Beispielliste speichern.</li>
		<li>Starten Sie die Sequenz und überprüfen Sie, ob eine erfolgreiche Injektion erfolgt ist (bestätigt durch eine Meldung, die auf dem System angezeigt wird, die besagt, dass injiziert wurde).</li>
		<li>Kopieren Sie Zeile 1 und fügen Sie sie unten ein, um eine neue Zeile zu generieren. Befüllen Sie Zeile 2 je nach aktuellem Experiment mit Proben. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position im Autosampler verwendet wird.</li>
		<li>Wenn die mobile Phase frisch ist, führen Sie zuerst einen Peak-Shape-Test durch, indem Sie die Lipidmischungsstandards vom Hersteller injizieren. Vergleichen Sie mit früheren Ergebnissen. 2 Bei den Standards handelt es sich um ein Lipidgemisch aus 1-Pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (15:0-18:1 PC), Lysophosphatidylcholin (18:1 Lyso PC), 1-Pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-phosphoethanolamin (15:0-18:1 PE), 1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (15:0-18:1 PS), 1,2- Dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-Octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), Cholesteryloleat (18:1 Cholester).</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass neue Linien die richtige Trennmethode und nicht die in Linie 1 verwendete Vorkonditionierungsmethode haben. Stellen Sie sicher, dass die MS-Methode korrekt ist (Methode des aktuellen Tages).</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die richtige Verarbeitungsmethode geladen ist und dass Automatisierten Prozess ausführen aktiviert ist.</li>
		<li>Speichern Sie die Beispielliste, um sicherzustellen, dass die Proben nach Abschluss des aktuellen Laufs analysiert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Offene Datenanalysesoftware (Abbildung 5). Klicken Sie in der oberen linken Ecke auf die Schaltfläche Datei und wählen Sie Öffnen...</li>
	<li>Wählen Sie die gewünschten Dateien aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dateinamen und wählen Sie Eigenschaften.<ol><li>Wählen Sie Calibration Status (Kalibrierungsstatus ) aus (Abbildung 6). Wählen Sie im Dropdown-Feld die Option Erstkalibrierung für das Massenspektrometer aus. Stellen Sie sicher, dass alle Fehler kleiner als 1 ppm sind.</li>
		<li>Wählen Sie als Nächstes Initial Mobility Calibration aus , und bestätigen Sie, dass der Fehler kleiner als 1 ppm ist.</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Chromatogramm , und wählen Sie Chromatogramm bearbeiten (Abbildung 6C). Klicken Sie unter Typ auf das Dropdown-Feld, und wählen Sie Extrahiertes Ionenchromatogramm aus (Abbildung 6D). Wählen Sie unter Filter die Option Alle MS und im Scanmodus Alle aus. Dies dient dazu, die Peaks für das interessierende Molekül und nicht nur seine Fragmente zu betrachten.<ol><li>Darunter gibt es zwei Filteroptionen für die Molekülauswahl: Massen oder Formel. Wenn Massen ausgewählt ist, kann man das theoretische m/z der interessierenden Moleküle auswählen. Wählen Sie für diesen Fall 829,7985 m/z. Wenn Formel ausgewählt ist, kann man sowohl die Formel für das Molekül als auch die Ionenformen auswählen, die für das Chromatogramm von Interesse sind. Wählen Sie in diesem Fall Ammonium [M+NH4]. Dies ist auf den Ammoniumpuffer in der mobilen Phase zurückzuführen, der die Ionisation in dieser Ionenform begünstigt (Abbildung 7).</li>
			<li>Wählen Sie für die Breite ±1 aus. Stellen Sie bei der Polarität sicher, dass der positive Modus beibehalten wird. Wählen Sie unter Mobilität die Option 1.455-1.465 aus. Dies geschieht, um alle Moleküle herauszufiltern, die nicht innerhalb dieser Werte liegen, und das interessierende Molekül zu isolieren.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem Sie die Parameter ausgewählt haben, klicken Sie oben rechts auf Hinzufügen > OK . Nach kurzer Zeit verarbeitet die Software die Selektionen und gibt ein Chromatogramm aus.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Basislinie am Anfang des Peaks of Interest und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste bis zum Ende des Peaks. Diese manuelle Integration liefert ein Live-Massenspektrum von Fragmenten innerhalb dieser Retentionszeit.</li>
	<li>Mobilogramm<ol><li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf der linken Seite des Bildschirms auf Mobilogramm , und wählen Sie Mobilogramm bearbeiten (Abbildung 8). Das Fenster mit dem Namen Mobilogramm-Traces bearbeiten wird angezeigt. Führen Sie die gleichen Schritte von C.e.i.1 bis C.e.i.5 aus (Abbildung 9).</li>
		<li>Geben Sie bei Retentionszeit die Retentionszeit des Peaks of Interest ein. In diesem Fall 37.45-37.55 min.</li>
		<li>Sobald Sie die Parameter ausgewählt haben, klicken Sie oben rechts auf Hinzufügen > OK . Nach kurzer Zeit verarbeitet die Software die Selektionen und gibt ein Chromatogramm aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Wiederholen Sie für extrahierte Ionen die Schritte 4.2.3.1 bis 4.3.2.2, bis eine Liste von Ionen gebildet ist.</li>
	<li>Wählen Sie am unteren Rand des MS-Fensters "MS profilieren " und "MS fragmentieren" aus. Dies ermöglicht eine Spektralansicht von Ionen aus dem Full Scan und PASEF.<ol><li>Klicken Sie in der Spektrumansicht mit der rechten Maustaste und wählen Sie Zusammengesetzte Spektren kopieren. Mit den Spektraldaten, die auf der rechten Seite erscheinen, kann man weitere Informationen über die eigene Verbindung finden, wie z. B. Auflösungsvermögen, Intensität und Signal-Rausch-Verhältnis (S/N; Abbildung 10).</li>
	</ol></li>
	<li>Verarbeitung<ol><li>Um die Daten zu verarbeiten, integrieren Sie das Chromatogramm und die Mobilitätsspitzen manuell, um wertvolle Informationen über das interessierende Molekül zu erhalten (Abbildung 10).</li>
		<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Suchen , und wählen Sie Nur Chromatogramm oder Mobilogramm integrieren (Abbildung 11). Klicken Sie mit der linken Maustaste und markieren Sie den gewünschten Peak. Zu diesen Informationen gehören die Verweildauer, die Fläche, S/N und Mobilität.</li>
	</ol></li>
</ol>

Screening von Lipidstrukturen mittels stabiler Isotopenmarkierung

<ol>
	<li>Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotopically+labeled+internal+standards+in+quantitative+bioanalysis+using+liquid+chromatography/mass+spectrometry:+Necessity+or+not.">Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).</li><li>Tose, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+stable+isotope+labeling+and+liquid+chromatography-trapped+ion+mobility+spectrometry-time-of-flight-tandem+mass+spectrometry+for+de+novo+mosquito+ovarian+lipid+studies.">Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies.</a> Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).</li><li>Meier, F., Park, M. A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+ion+mobility+spectrometry+and+parallel+accumulation-serial+fragmentation+in+proteomics.">Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).</li><li>Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+mobility+mass+spectrometry+enhances+low-abundance+species+detection+in+untargeted+lipidomics.">Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics.</a> Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+parallel+accumulation-serial+fragmentation+(PASEF)+with+a+novel+trapped+ion+mobility+mass+spectrometer.">Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer.</a> Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).</li><li>Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analyses+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometric+approaches:+DIA,+WiSIM-DIA,+and+untargeted+DIA.">Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA.</a> Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).</li><li>Fern&#225;ndez-Costa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+identification+strategy+on+the+reproducibility+of+the+DDA+and+DIA+results.">Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results.</a> J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+data+acquisition+and+processing+strategies+with+increased+throughput+and+selectivity:+PSMART+analysis+for+global+qualitative+and+quantitative+analysis.">Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).</li><li>Tsou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIA-umpire:+Comprehensive+computational+framework+for+data-independent+acquisition+proteomics.">DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics.</a> Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).</li><li>Triebl, A., Wenk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+considerations+of+stable+isotope+labelling+in+lipidomics.">Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics.</a> Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).</li></ol>

Matthew Willetts und Melvin A. Park sind Mitarbeiter von Bruker Daltonics Inc., dem Hersteller des kommerziellen Instruments timsTOF. Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Bei der Bewertung der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Parameter DIA-PASEF und MS/MS auf die betreffenden Triglyceride anwendbar sind. Insbesondere sollten die Mobilitätsfenster und die Fensterbreite dem Muster der Triglyceride folgen. Dies kann mit einem vorherigen Lauf mit der DDA-Methode ermittelt werden. Bei der Verfolgung der Triglyceride im internen Standard sollten die Fenster für die DIA-Einrichtung alle vorab identifizierten Moleküle von Interesse abdecken. Die Fenster sol...

Bei der Analyse von Lipiddaten ist die Markierung stabiler Isotope (SIL) eine effektive Methode, um Stoffwechselwege in lebenden Organismen zu beurteilen. Bei dieser Methode werden Atome innerhalb eines Analyten durch stabile Isotope ersetzt, die 13C oder 2H enthalten. Diese Isotope werden weiter in Vorläufer eingebaut, die später in die Fettsäuren eingebettet werden und die Bereiche markieren, in denen sie sich befinden. Mit diesen Isotopen ist man in der Lage, die Verteilung und den Stoffwechsel von Lipiden zu identifizieren, da sie sich vom unmarkierten Hintergrundabheben 1. Gängige Massenspektrometrie-Plattformen sind nicht in der Lage, das Signal, das von endogenen Molekülen ausgeht,zu unterscheiden 2. Der Erfolg von SIL erfordert den Einsatz ultrahochauflösender Analysewerkzeuge. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit der hochauflösenden Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen, der sequentiellen Fragmentierung, der Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ermöglicht die Trennung von markierten und unmarkierten Spezies2. Der Vorteil der LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-Analyse besteht darin, dass das MS-Signal nach der Retentionszeit (RT) und Mobilität gefiltert werden kann, wodurch potenzielle Interferenzen endogener Moleküle sowie die Quantifizierung und Trennung aller gewünschten Spezies reduziert werden2. Bei TIMS wird ein Ion zunächst gegen eine gasmobile Phase stationär gehalten und anschließend entsprechend ihrer Beweglichkeit wieder freigesetzt. Dies bietet hochauflösende Mobilogramme und arbeitet gleichzeitig mit einer niedrigeren Spannung als frühere IMS-Instrumente3. Mobilogramme sind Diagramme der Masse zu Ladung im Vergleich zur Driftzeit, die zur Unterscheidung zwischen Verbindungen auf der Grundlage ihrer Driftzeit und des Ausmaßes der Überlappungverwendet werden können 4.
Durch die Verwendung einer zusätzlichen PASEF-Technik wird die Sequenzierungsgeschwindigkeit erheblich erhöht, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen5. Die PASEF-Theorie beinhaltet die Akkumulation von Ionen, gefolgt von ihrer sequentiellen Freisetzung in der Reihenfolge ihrer Mobilität. Dies geschieht durch die Akkumulation von Ionen in paralleler Ausrichtung zu ihrer Beweglichkeit. Die Akkumulation auf diese Weise verhindert den Ionenverlust. Darüber hinaus erfolgt die Auswahl der Vorläuferionen gleichzeitig mit der Akkumulation und Freisetzung der Ionen. Bei dieser Methode wählt PASEF bei jedem TIMS-Scan mehrere Vorläufer in Reihe aus, anstatt der einzelnen Vorläufer pro Scan, die für ein TIMS-Gerät typisch sind, das PASEF nicht verwendet. Wenn die Vorläuferionen gleichzeitig akkumuliert und in 2-ms-Spitzen innerhalb eines TIMS-Scans von etwa 100 ms pro Frame freigesetzt werden, wird das Signal um mehr als eine Größenordnung verstärkt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis3 erhöht wird. Die PASEF-Ergänzung des TIMS erhöht die Effizienz des MS/MS. Da TIMS-PASEF mit MS/MS gekoppelt ist, ist eine effizientere Fragmentierung möglich. Im Gegensatz zur herkömmlichen MS/MS-Detektion wird das Vorläufersignal vom TIMS-PASEF komprimiert, und die Fragmentionen werden gleichzeitig mit der TIMS-Elutionszeit und der Ionenmobilitätsposition des Vorläufers3 detektiert.
Bei der Datenerfassung von einem Massenspektrometer gibt es Optionen im gewünschten Scan-Modus. Bei der datenabhängigen Erfassung (DDA) werden Vorläuferionen aus dem MS1-Scan basierend auf ihren Häufigkeiten ausgewählt, bevor sie fragmentiert und der MS2-Scan durchgeführt wird. In diesem Scan-Modus werden so viele Vorläufer wie möglich fragmentiert. Der DDA-Ansatz ist zielgerichtet, und die Ergebnisse hängen von der Ionenauswahlab 3. Allerdings hat DDA-PASEF oft Probleme bei der Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten. Während DDA ein großartiges Werkzeug für eine fokussierte Analyse ist, haben komplexe Mischungen größere Schwierigkeiten bei der Datenerfassung6. Dies liegt daran, dass nur eine kleine Menge an Ionen gleichzeitig überwacht werden kann3. Die datenunabhängige Erfassung (DIA) ist eine Methode, bei der vorausgewählte Fenster von m/z unabhängig von ihrer Intensität fragmentiert werden und alle innerhalb des Bereichs7 gescannt werden. Mit diesem Scan-Modus werden ganze Ionenwolken vom IMS zum Massenspektrometer3 übertragen. In Proteomik-Studien führt dies dazu, dass im Vergleich zu DDA größere Mengen an Proteinen in kürzerer Zeit quantifiziert werden können. Darüber hinaus fehlen bei DIA im Vergleich zu DDA weniger m/z-Werte. Daher hat diese Alternative große Verbesserungen bei der Reproduzierbarkeit der Daten im Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Quantifizierung als DDA gezeigt. In der vorliegenden Arbeit ist es unser Ziel, DIA in die von Tose et al.2 beschriebene Methode zu implementieren. Wir verbesserten die Reproduzierbarkeit und Intensität der Signale und lieferten weitere und schlüssigere Informationen über die Mobilisierung, Verteilung und den Metabolismus von SIL-Lipiden in biologischen Proben, indem wir die Vorteile der DDA- und DIA-Akquisition nutzten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accucore C30 colum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>27826-252130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Compass Data Analysis</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>2363525870</td>
			<td>Version 5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Glucose-13C6</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>389374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EquiSplash Lipidomix</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330731-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-417-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heavy water (2H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>1.13366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polypropylene pestles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BAF199230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>L20234651907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silanized glass inserts</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-251-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose-13C12</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>605417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>timsTOF</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td>1.84443E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuning Mix Calibration Standard</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracing de novo lipids using stable isotope labeling lc-tims-tof ms/ms

Lipide sind sehr vielfältig, und kleine Veränderungen in der Lipidstruktur und -zusammensetzung können tiefgreifende Auswirkungen auf kritische biologische Funktionen haben. Die Markierung stabiler Isotope (SIL) bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung der Lipidverteilung, -mobilisierung und des Metabolismus sowie für die De-novo-Lipidsynthese . Die erfolgreiche Implementierung der SIL-Technik erfordert die Entfernung von Interferenzen durch endogene Moleküle. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein analytisches Hochdurchsatzprotokoll für das Screening von SIL-Lipiden aus biologischen Proben; Es werden Beispiele für die De-novo-Identifizierung von Lipiden während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken gezeigt. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen und Massenspektrometrie ermöglicht die Trennung und Zuordnung von Lipiden aus einer einzelnen Probe in einem einzigen Scan (<1 h). Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der datenabhängigen Erfassung und der datenunabhängigen Erfassung, indem er parallele Akkumulation in der Mobilitätsfalle verwendet, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Die Messung von SIL auf der Ebene der Fettsäurekette zeigt Veränderungen in der Lipiddynamik während der Entwicklung der Eierstöcke von Mücken. Die De-novo-Strukturen der Lipide werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugeordnet.

When analyzing lipid data, stable isotope labeling (SIL) is an effective method to assess metabolic pathways in living organisms. In this method, atoms within an analyte are replaced by stable isotopes containing 13C or 2H. These isotopes are further incorporated into precursors, which are later embedded within the fatty acids, labeling the areas in which they reside. With these isotopes, one is able to identify the distribution and metabolism of lipids, as they will contrast against the unlabeled background1. Common mass spectrometry platforms are not able to distinguish the signal coming from endogenous molecules2. The success of SIL requires the use of ultrahigh-resolution analytical tools. Liquid chromatography coupled to high-resolution trapped ion mobility spectrometry-parallel accumulation sequential fragmentation-time-of-flight tandem mass spectrometry (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) allows the separation of labeled and nonlabelled species2. The advantage of LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS analysis is that the MS signal can be filtered by the retention time (RT) and mobility, thus reducing potential interferences of endogenous molecules, as well as quantification and separation of all desired species2. In TIMS, an ion is first held stationary against a gas-mobile phase and subsequently released according to its mobility. This provides high-resolution mobilograms while operating at a lower voltage than earlier IMS instrumentation3. Mobilograms are plots of mass to charge versus drift time that can be used to distinguish between compounds based off of their drift time and amount of overlap4.
By using an additional PASEF technique, sequencing speed is greatly increased without sacrificing sensitivity5. The PASEF theory involves the accumulation of ions followed by their sequential release in the order of their mobility. This is done by accumulating ions in parallel alignment to their mobility. The accumulation in this fashion prevents ion loss. Furthermore, the precursor ion selection occurs simultaneously with the accumulation and release of the ions. With this method, PASEF selects multiple precursors in series during each TIMS scan, rather than the individual precursors per scan typical of a TIMS instrument that does not use PASEF. When the precursor ions are concurrently accumulated and released in 2 ms peaks within a TIMS scan of approximately 100 ms per frame, the signal is amplified by over one order of magnitude, therefore increasing the signal-to-noise ratio3. The PASEF addition to the TIMS increases the efficiency of the MS/MS. As the TIMS-PASEF is coupled with MS/MS, a more efficient fragmentation is possible. Unlike conventional MS/MS detection, the precursor signal is compressed from the TIMS-PASEF, and the fragment ions are detected simultaneously to the TIMS elution time and ion mobility position of the precursor3.
When acquiring data from a mass spectrometer, there are options in the scan mode desired. Data dependent acquisition (DDA) selects precursor ions from the MS1 scan based on their abundances, before fragmenting them and performing the MS2 scan. This scan mode fragments as many precursors as possible. The DDA approach is targeted, and results will depend on the ion selection3. However, DDA-PASEF often has problems in the reproducibility between replicates. While DDA is a great tool in a focused analysis, complex mixtures have greater difficulty in their data acquisition6. This is because only a small amount of ions can be monitored simultaneously3. Data independent acquisition (DIA) is a method where preselected windows of m/z are fragmented independently from their intensity, and all are scanned within the range7. With this scan mode, entire ion clouds are transmitted from the IMS to the mass spectrometer3. In proteomics studies this results in greater amounts of proteins being quantified in a shorter time span compared to DDA. In addition, DIA misses fewer m/z values compared to DDA. Therefore, this alternative has shown great improvements in data reproducibility in signal to noise ratio and better quantification than DDA. In this present work, our goal is to implement DIA to the method reported by Tose et al.2. We improved the reproducibility and intensity of signals, yielding further and more conclusive information on SIL lipids mobilization, distribution and metabolism in biological samples taking advantage of DDA and DIA acquisition.

Autor im Rampenlicht: Quantifizierung komplexer lipidomischer Proben mittels stabiler Isotopenmarkierung

De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

This research intends to implement more specific quantification in lipidomic samples using stable isotope labeling. This allows us to understand lipid panels and highly diverse samples from insects to humans. There currently is a gap in this field regarding the standardization of LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomic investigations.Here we provide a method for tracking biomass remains for this purpose. In the future, our research will involve the investigation of epigenetics and metabolomics present in the biological process using the LC team staff, MS/MS, involve DDA and DIA methods.

Die Markierung stabiler Isotope erleichtert die Visualisierung von Triglyceriden in Lipiddynamikstudien an weiblichen Mücken-Eierstöcken. Im 2D-Mobilitätsbereich wird das Triglycerid 48:1 in einer Region mit einer spezifischen Retentionszeit in Bezug auf die Mobilität 1/K0 angezeigt. Die Intensität des Triglycerids kann durch eine dunklere blaue Linie dargestellt werden. Andere Flecken stellen zusätzliche Triglyceride dar, die sich im Eierstock befinden. Die Verweilzeiten und Mobilitäten variieren aufgr...

Hier wird eine Methode zum Screening von Lipidstrukturen durch Markierung stabiler Isotope unter Verwendung ihrer Retentionszeit, Mobilität und Fragmentierung vorgestellt.

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

Diese Forschung zielt darauf ab, eine spezifischere Quantifizierung in lipidomischen Proben unter Verwendung der Markierung stabiler Isotope durchzuführen. Dies ermöglicht es uns, Lipid-Panels und sehr unterschiedliche Proben von Insekten bis hin zum Menschen zu verstehen. In diesem Bereich gibt es derzeit eine Lücke in Bezug auf die Standardisierung von LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomischen Untersuchungen.Hier stellen wir zu diesem Zweck eine Methode zur Verfolgung von Biomasseresten zur Verfügung. In Zukunft wird unsere Forschung die Untersuchung der Epigenetik und Metabolomik, die im biologischen Prozess vorhanden ist, mit den Mitarbeitern des LC-Teams, MS/MS, unter Einbeziehung von DDA- und DIA-Methoden umfassen.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

697 Aufrufe.  Florida International University. Diese Forschung zielt darauf ab, eine spezifischere Quantifizierung in lipidomischen Proben unter Verwendung der Markierung stabiler Isotope durchzuführen. Dies ermöglicht es uns, Lipid-Panels und sehr unterschiedliche Proben von Insekten bis hin zum Menschen zu verstehen. In diesem Bereich gibt es derzeit eine Lücke in Bezug auf die Standardisierung von LC, TIMS, Top, MS/MS in lipidomischen Untersuchungen.Hier stellen wir zu diesem Zweck eine Methode zur Verfolgung von Biomasserest...