Die Arbeit zur Entwicklung dieses Protokolls wurde von den National Institutes of Health [AR072609 unterstützt.

Grundsätze und Protokolle der mechanischen Prüfung auf Anfälligkeit für Knochenbrüche

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	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Während des gesamten Scan- und Testprozesses gibt es Momente, in denen Fehlerbehebung und Optimierung angebracht sind. Die erste davon tritt auf, wenn Knochen mit μCT gescannt werden. Während viele Systeme mit einer Halterung geliefert werden, in der ein Objekt gehalten und gescannt werden kann, können benutzerdefinierte Halterungen hergestellt werden, um mehrere Knochen gleichzeitig zu scannen. Das Scannen mehrerer Knochen kann ein hervorragender Punkt für die Optimierung sein, aber während des gesamten Scan- und ...

Die mechanische Prüfung von Knochen ist die primäre Methode, um funktionelle Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu extrahieren. In präklinischen Studien können mehrere Testmodalitäten verwendet werden, aber die bei weitem häufigste ist das Biegen von Röhrenknochen. Diese Tests sind einfach durchzuführen und können an Knochen unterschiedlicher Größe von Mensch bis Maus angewendet werden. Da Mäuse zu den am häufigsten untersuchten Tieren in der präklinischen Forschung gehören, konzentriert sich dieses Protokoll auf Biegetests, die an den Oberschenkelknochen und Tibiae von Mäusen durchgeführt werden.
Vor der Durchführung von Biegeversuchen müssen die Knochen ordnungsgemäß entnommen und gelagert werden. Die gebräuchlichsten Lagerungsmethoden waren traditionell das Einfrieren von Knochen in salzgetränkter Gaze, das Einfrieren in Kochsalzlösung allein oder das Dehydrieren von Knochen in Ethanol 1. Es hat sich gezeigt, dass in Ethanol gelagerte Knochen eine höhere Steifigkeit und einen höheren Elastizitätsmodul sowie geringere Verformungsparameter aufweisen als Knochen, die gefroren gelagert werden1. Selbst wenn die Knochen vor dem Test rehydriert werden, werden diese Eigenschaften nicht wieder auf ein normales Niveau zurückgeführt 1. Die Lagerung in Kochsalzlösung kann den Knochen schädigen, da Druck ausgeübt wird, wenn sich die Kochsalzlösung ausdehnt. Darüber hinaus wäre ein vollständiges Auftauen der Lösung erforderlich, um die Knochen für die Mikrocomputertomographie (μCT) zu entfernen. Folglich ist das Einfrieren frisch geernteter Knochen in salzgetränkter Gaze zur Standard-Lagerungsmethode geworden und wird in diesem Protokoll empfohlen.
Da die Größe und Form eines Knochens seine Volumenfestigkeit beeinflussen und viele Krankheitsmodelle die Knochengröße und -morphologie erheblich verändern, werden technische Prinzipien verwendet, um die Auswirkungen der Größe zu normalisieren und Eigenschaften zu erzeugen, die das Verhalten des Gewebes abschätzen2. Dieser Ansatz erfordert eine Querschnittsgeometrie der Versagensstelle, die am häufigsten mit μCT erfasst wird, um Scans der Knochen vor dem Test zu erstellen. μCT ist aufgrund seiner Verfügbarkeit und hohen Bildauflösung weit verbreitet. Darüber hinaus sind Beiträge von Weichgewebe nicht enthalten, und das Scannen erfordert keine chemische Fixierung oder andere Modifikationen des Knochens 3,4. Bei allen Formen der CT wird eine Röntgenquelle auf ein Objekt fokussiert, während ein Detektor auf der anderen Seite des Objekts die resultierende Röntgenenergie misst. Dadurch entsteht ein Röntgenschatten der Probe, der in ein Bildumgewandelt werden kann 3,5. Das zu scannende Objekt wird gedreht (oder die Röntgenquelle und der Detektor werden um die Probe gedreht), wodurch Bilder erzeugt werden, die in einen dreidimensionalen Datensatz rekonstruiert werden können, der das Objekt5 darstellt.
Die Scanauflösung, d. h. wie nahe zwei Objekte einzeln beieinander liegen und dennoch aufgelöst werden können, wird durch Ändern der nominalen Voxelgröße oder der Größe eines Pixels im resultierenden Bild gesteuert. Es ist allgemein anerkannt, dass Objekte mindestens doppelt so groß sein müssen wie ein einzelnes Voxel3, aber ein höheres Verhältnis ermöglicht eine verbesserte Präzision. Darüber hinaus sind größere Voxel anfälliger für Teilvolumeneffekte: Wenn ein einzelnes Voxel Gewebe unterschiedlicher Dichte enthält, wird ihm der Durchschnitt dieser Dichten und nicht die spezifische Dichte eines einzelnen Gewebes zugewiesen, was zu einer Über- oder Unterschätzung der Gewebebereiche und der Mineraldichte führen kann3. Diese Probleme können zwar durch die Wahl kleinerer Voxelgrößen gemildert werden, aber die Verwendung einer höheren Auflösung gewährleistet nicht die Eliminierung von Teilvolumeneffekten und erfordert möglicherweise längere Scanzeiten3. Beim Ex-vivo-Scan von Knochen wird im Allgemeinen eine Voxelgröße von 6-10 μm empfohlen, um die trabekuläre Architektur von Mausknochen genau beurteilen zu können. Für kortikalen Knochen kann eine größere Voxelgröße von 10-17 μm verwendet werden, obwohl die kleinste sinnvolle Voxelgröße verwendet werden sollte. Dieses Protokoll verwendet eine Voxelgröße von 10 μm, die klein genug ist, um wichtige trabekuläre Eigenschaften zu differenzieren und Teilvolumeneffekte ohne lange Scanzeit zu minimieren.
Auch die Einstellungen für Röntgenenergie und Energiefilter müssen sorgfältig gewählt werden, da die hohe Mineraldichte und Dicke des Knochengewebes das transmittierte Röntgenenergiespektrum stark abschwächt und verändert. Es wird allgemein angenommen, dass, da das emittierte Röntgenspektrum äquivalent zu dem Spektrum ist, das das Objekt6 verlässt, die Verwendung von niederenergetischer Röntgenstrahlung auf dichte Objekte wie Knochen zu einem Artefakt führen kann, das als Strahlhärtung7 bekannt ist. Beim Scannen von Knochenproben wird eine höhere Spannung von 50-70 kVp empfohlen, um das Auftreten dieser Artefakte zu reduzieren5. Darüber hinaus erzeugt das Einsetzen eines Aluminium- oder Kupfer-Energiefilters einen konzentrierteren Energiestrahl, wodurch Artefakte weiter minimiertwerden 4,7. Während dieses Protokolls wird ein 0,5-mm-Aluminiumfilter verwendet.
Schließlich steuern der Scan-Rotationsschritt und die Rotationslänge (z. B. 180°-360°) zusammen die Anzahl der aufgenommenen Bilder, die die Menge des Rauschens im endgültigen Scan4 bestimmt. Die Mittelung mehrerer Frames in jedem Schritt kann das Rauschen reduzieren, aber die Scanzeit verlängern4. Dieses Protokoll verwendet einen Rotationsschritt von 0,7 Grad und eine Frame-Mittelung von 2.
Eine letzte Anmerkung zum Scannen: Hydroxylapatit-Kalibrierphantome sollten mit den gleichen Scaneinstellungen wie die experimentellen Knochen gescannt werden, um die Umrechnung der Dämpfungskoeffizienten in die Mineraldichte in g/cm35 zu ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet Phantome von 0,25 g/cm3 und 0,75 g/cm3 Hydroxylapatit, obwohl verschiedene Phantome verfügbar sind. Beachten Sie, dass einige Scansysteme interne Phantome als Teil der täglichen Systemkalibrierung verwenden.
Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden die Winkelprojektionen zu Querschnittsbildern des Objekts rekonstruiert, in der Regel mit der begleitenden Software des Herstellers. Unabhängig davon, welches System verwendet wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass der gesamte Knochen bei der Rekonstruktion erfasst wird und dass die Schwellenwerte angemessen festgelegt werden, um die Erkennung von Knochen und Nicht-Knochen zu ermöglichen. Nach der Rekonstruktion ist es wichtig, alle Scans dreidimensional zu drehen, damit die Knochen konsistent ausgerichtet und richtig mit der Querachse ausgerichtet sind, wiederum mit der Software des Herstellers.
Nach der Rotation können Regions of Interest (ROI) für die Analyse ausgewählt werden, je nachdem, ob kortikale Eigenschaften, trabekuläre Eigenschaften oder Bruchgeometrie für die mechanische Normalisierung gewünscht werden. Bei letzterem sollten ROIs nach dem Test ausgewählt werden, indem der Abstand von der Frakturstelle zu einem Ende des Knochens gemessen und die Voxelgröße verwendet wird, um die entsprechende Schichtposition in der Scandatei zu bestimmen. Die ausgewählte Region sollte mindestens 100 μm lang sein, wobei der Bruchpunkt ungefähr in der Mitte des ROI liegen sollte, um eine angemessene Schätzung zu ermöglichen4.
Wenn ROIs ausgewählt sind, werden zwei Eigenschaften für die mechanische Normalisierung (zur Berechnung der Biegespannung und -dehnung) benötigt: der maximale Abstand von der neutralen Biegeachse zur Oberfläche, an der das Versagen ausgelöst wird (angenommen wird die unter Spannung belastete Fläche, die durch den Versuchsaufbau bestimmt wird) und das Flächenträgheitsmoment um die neutrale Achse (ebenfalls abhängig vom Versuchsanordnung). Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung eines benutzerdefinierten Codes, um diese Werte zu bestimmen. Für den Zugriff auf den Code wenden Sie sich direkt an den korrespondierenden Autor oder besuchen Sie die Lab-Website unter https://bbml.et.iupui.edu/ für weitere Informationen.
Sobald der μCT-Scan abgeschlossen ist, kann mit der mechanischen Prüfung begonnen werden. Biegeversuche können entweder in Vierpunkt- oder Dreipunktkonfiguration durchgeführt werden. Vier-Punkt-Biegeversuche werden bevorzugt, da sie die Scherspannung im Knochen zwischen den Belastungspunkten eliminieren und eine reine Biegung in diesem Bereich ermöglichen3. Der Knochen bricht dann aufgrund der Spannung, wodurch ein Versagen entsteht, das repräsentativer für die wahren Biegeeigenschaften des Knochensist 3. Der Knochen muss jedoch so belastet werden, dass er an beiden Belastungspunkten die gleiche Last abgibt (dies kann mit einem schwenkbaren Ladekopf erleichtert werden). Bei Dreipunktbiegeversuchen gibt es eine große Änderung der Scherspannung an der Stelle, an der der Belastungspunkt auf den Knochen trifft, was dazu führt, dass der Knochen an dieser Stelle aufgrund von Scherung bricht, nicht aufgrund von Spannung3. Die ASTM-Normen empfehlen, dass Materialien, die gebogen werden, ein Verhältnis von Länge zu Breite von 16:1 haben sollten, was bedeutet, dass die Länge der Stützspannweite 16-mal größer sein sollte als die Breite des Knochens, um die Auswirkungen der Scherungzu minimieren 8,9. Dies ist bei der Prüfung kleiner Nagetierknochen oft nicht zu erreichen, daher wird die Belastungsspanne einfach so groß wie möglich gemacht, aber mit einer möglichst geringen Veränderung der Querschnittsform. Darüber hinaus sollte bei der Durchführung der Vier-Punkt-Beugung das Verhältnis zwischen den Längen der unteren und oberen Spannweite ~3:18 betragen, was normalerweise im Schienbein erreicht werden kann, aber im kürzeren Oberschenkelknochen schwierig ist. Darüber hinaus machen die dünneren kortikalen Wände der Oberschenkelknochen sie anfällig für ringförmige Verformungen, die die Form des Knochenquerschnitts während des Tests verändern (dies kann bei Vierpunkttests akzentuiert werden, da im Vergleich zur Dreipunktbiegung eine größere Kraft erforderlich ist, um das gleiche Biegemoment zu induzieren). Daher wird die Drei-Punkt-Beugung für den Oberschenkelknochen der Maus verwendet, während die Vier-Punkt-Beugung für die Tibiae während des gesamten Protokolls verwendet wird.
Schließlich ist es wichtig, die Studie für die statistische Analyse richtig mit Strom zu versorgen. Eine allgemeine Empfehlung für mechanische Tests ist eine Stichprobengröße von 10-12 Knochen pro Versuchsgruppe, um Unterschiede erkennen zu können, da einige mechanische Eigenschaften, insbesondere Nachstreckungsparameter, sehr variabel sein können. In einigen Fällen kann dies bedeuten, dass mit einer höheren Stichprobengröße begonnen wird, da es während der Studie zu einer Abnutzung kommen könnte. Die Analyse der Stichprobengröße anhand vorhandener Daten sollte vor dem Versuch einer Studie abgeschlossen werden.
Es gibt zahlreiche Einschränkungen und Annahmen, aber Biegeversuche können recht genaue Ergebnisse liefern, insbesondere wenn relative Unterschiede zwischen Gruppen von Interesse sind. Diese Eigenschaften, zusammen mit der Analyse der trabekulären Architektur und der kortikalen Morphologie, können einen besseren Einblick in Krankheitszustände und Behandlungsschemata ermöglichen. Wenn die Aspekte des Experiments, die in unserer Kontrolle liegen (z. B. Ernte, Lagerung, Scannen und Testen), sorgfältig behandelt werden, können wir sicher sein, dass genaue Ergebnisse erzielt wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

Die Zerbrechlichkeit des Skeletts, die zu Frakturen führt, ist eine Krise der öffentlichen Gesundheit in den USA, die jedes Jahr zu 1,5 Millionen Frakturen und 18 Milliarden US-Dollar an direkten Pflegekosten führt. Die Fähigkeit, die Mechanismen, die Knochenerkrankungen zugrunde liegen, und das Ansprechen auf die Behandlung zu verstehen, ist nicht nur erwünscht, sondern entscheidend. Die mechanische Prüfung von Knochen ist eine wertvolle Technik, um die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu verstehen und zu quantifizieren. Obwohl diese Methode einfach durchzuführen erscheint, können unangemessene und ungenaue Schlussfolgerungen gezogen werden, wenn maßgebliche Annahmen und wichtige Schritte vom Benutzer missachtet werden. Dies ist disziplinübergreifend zu beobachten, da weiterhin Studien mit Missbrauch von Methoden und falscher Interpretation der Ergebnisse veröffentlicht werden. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Prinzipien, die mit mechanischen Tests verbunden sind, sowie für die Anwendung dieser Techniken - von Überlegungen zur Probengröße über die Gewebeentnahme und -lagerung bis hin zur Datenanalyse und -interpretation. Auf diese Weise können wertvolle Informationen über die Frakturanfälligkeit eines Knochens gewonnen werden, die das Verständnis sowohl für die akademische Forschung als auch für klinische Lösungen fördern.

Mechanical testing of bone is the primary method to extract functional information related to a bone&#39;s susceptibility to fracture. In preclinical studies, several testing modalities can be used but by far the most common is the bending of long bones. These tests are easy to perform and can be used on bones ranging in size from human to mouse. As mice are one of the most commonly studied animals in preclinical research, this protocol will focus on bending tests performed on the femora and tibiae of mice.
Prior to performing bending tests, bones must be properly harvested and stored. The most common storage methods have traditionally been freezing bones in saline-soaked gauze, freezing in saline alone, or dehydrating bones in ethanol 1. Bones stored in ethanol have been shown to have increased stiffness and elastic modulus and decreased deformation parameters versus those stored frozen1. Even rehydrating the bones prior to testing does not recover these properties back to normal levels 1. Storing submerged in saline could cause damage to the bone since pressure is exerted as the saline expands. In addition, a complete thaw of the solution would be required to remove the bones for microcomputed tomography (&#181;CT) scanning. Consequently, freezing freshly harvested bones in saline-soaked gauze has become the standard storage method and is recommended throughout this protocol.
Because the size and shape of a bone affect its bulk strength and many disease models significantly alter bone size and morphology, engineering principles are used to normalize away the effects of size to produce properties that estimate the behavior of the tissue2. This approach requires cross-sectional geometry of the failure location, which is most commonly acquired using &#181;CT to create scans of the bones prior to testing. &#181;CT is widely used due to its availability and high image resolution. Moreover, contributions of soft tissue are not included, and scanning does not require chemical fixation or other modifications to the bone3,4. In all forms of CT, an X-ray source is focused on an object while a detector on the other side of the object measures the resulting X-ray energy. This produces an X-ray shadow of the sample that can be converted into an image3,5. The object being scanned is rotated (or the X-ray source and detector are rotated around the sample), generating images that can be reconstructed into a three-dimensional data set representing the object5.
Scan resolution, or how close together two objects can be and still be resolved individually, is controlled by changing the nominal voxel size or the size of a pixel in the resulting image. It is generally accepted that objects must be at least two times the size of a single voxel to be identified3, but a higher ratio will allow for improved precision. Further, larger voxels are more prone to partial volume effects: when a single voxel contains tissues of varying densities, it is assigned the average of these densities, rather than the specific density of a single tissue, which may lead to an over- or under-estimation of tissue areas and mineral density3. While these issues can be mitigated by choosing smaller voxel sizes, using a higher resolution does not ensure the elimination of partial volume effects and may require longer scan times3. When scanning bones ex vivo, a voxel size of 6-10 &#181;m is generally recommended to accurately assess the trabecular architecture of mouse bones. A larger voxel size of 10-17 &#181;m can be used for cortical bone, although the smallest reasonable voxel size should be used. This protocol uses a 10 &#181;m voxel size, which is small enough to differentiate key trabecular properties and minimize partial volume effects without extensive scan time.
X-ray energy and energy filter settings must also be selected carefully, as the high mineral density and thickness of bone tissue greatly attenuates and alters the transmitted X-ray energy spectrum. It is generally assumed that because the emitted X-ray spectrum is equivalent to the spectrum that exits the object6, using low-energy X-rays on dense objects such as bone can lead to an artifact known as beam hardening7. A higher voltage of 50-70 kVp is recommended when scanning bone samples to reduce the incidence of these artifacts5. In addition, inserting an aluminum or copper energy filter creates a more concentrated energy beam, further minimizing artifacts4,7. A 0.5 mm aluminum filter will be used throughout this protocol.
Finally, the scan rotation step and rotation length (e.g., 180&#176;-360&#176;), together control the number of images captured, which determines the amount of noise in the final scan4. Averaging multiple frames in each step can reduce noise but may increase scan time4. This protocol uses a rotation step of 0.7 degrees and a frame averaging of 2.
One final note about scanning: hydroxyapatite calibration phantoms should be scanned using the same scan settings as the experimental bones to enable the conversion of attenuation coefficients to mineral density in g/cm35. This protocol uses phantoms of 0.25 g/cm3 and 0.75 g/cm3 of hydroxyapatite, although different phantoms are available. Note that some scanning systems use internal phantoms as part of daily system calibration.
Once scanning is complete, the angular projections are reconstructed into cross-sectional images of the object, typically using the manufacturer&#39;s accompanying software. Whatever system is used, it is important to ensure that the whole bone is captured in the reconstruction and that thresholding is set appropriately to allow for the recognition of bone versus non-bone. After reconstruction, it is critical to rotate all scans in three dimensions so that bones are oriented consistently and properly aligned with the transverse axis, again using the manufacturer&#39;s software.
Following rotation, regions of interest (ROI) for analysis may be selected based on whether cortical properties, trabecular properties, or fracture geometry for mechanical normalization are desired. For the latter, ROIs should be selected after testing by measuring the distance from the fracture site to one end of the bone and using voxel size to determine the corresponding slice location in the scan file. The selected region should be at least 100 &#181;m in length, with the fracture point at the approximate center of the ROI, to provide adequate estimation4.
With ROIs selected, two properties are needed for mechanical normalization (to calculate bending stress and strain): the maximum distance from the neutral bending axis to the surface where failure is initiated (assumed to be the surface loaded in tension, determined by the testing setup), and the area moment of inertia around the neutral axis, (also dependent on testing setup). This protocol recommends the use of a custom code to determine these values. For access to the code, contact the corresponding author directly or visit the lab website at&#160;https://bbml.et.iupui.edu/ for more information.
Once &#181;CT scanning has been completed, mechanical testing can begin. Bending tests can be performed in either four-point or three-point configurations. Four-point bending tests are preferred as they eliminate shear stress in the bone between loading points, allowing for pure bending to occur in this region3. The bone will then fracture due to tension, creating a failure that is more representative of the true bending properties of the bone3. However, the bone must be loaded in such a way as to deliver the same load at both loading points (this can be facilitated with a pivoting loading head). In three-point bending tests, there is a large change in shear stress where the load point meets the bone, which causes the bone to break at this point due to shear, not tension3. ASTM standards recommend materials undergoing bending should have a length-to-width ratio of 16:1, meaning the length of the support span should be 16 times larger than the width of the bone to minimize impacts of shear8,9. This is often impossible to achieve when testing small rodent bones, so the loading span is simply made as large as possible but with as small of a change in cross-sectional shape as possible. Moreover, when performing four-point bending, the ratio between the lengths of the lower and upper span should be ~3:18, which can usually be achieved in the tibia, but it is difficult in the shorter femur. In addition, the thinner cortical walls of femurs make them susceptible to ring-type deformation which changes the shape of the bone cross-section during the test (this can be accentuated in four-point tests as a greater force is required to induce the same bending moment compared to three-point bending). Therefore, three-point bending will be utilized for mouse femora while four-point bending will be used for tibiae throughout this protocol.
Finally, it is important to properly power the study for statistical analysis. A general recommendation for mechanical testing is to have a sample size of 10-12 bones per experimental group to be able to detect differences, as some mechanical properties, especially postyield parameters, can be highly variable. In some cases, this may mean starting with a higher animal sample size given attrition that could occur during the study. Sample size analysis using existing data should be completed prior to attempting a study.
There are numerous limitations and assumptions, but bending tests can provide quite accurate results, especially when relative differences between groups are of interest. These properties, together with the analysis of trabecular architecture and cortical morphology, can provide better insight into disease states and treatment regimens. If care is taken with those aspects of the experiment that are in our control (e.g., harvesting, storing, scanning, and testing), we can feel confident that accurate results have been generated.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei Biegetests für ganze Knochen 

Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

The current experimental challenges of bending tests include:Consistent placing of the bones in the same orientation, documenting the break progress of the bone during the test, and interpretation of complex results. Our protocol provides a guide not only for the testing procedure and data analysis for whole-bone bending tests, but also for sample preparation and storage. And this is the first instance where the entire protocol has been presented.Whole-bone mechanical testing is a quick and simple method to obtain measures of bone fracture susceptibility when compared to other testing methods.

Nach Abschluss der CT-Untersuchung können die meisten unzureichenden Scans bei der Rekonstruktion erfasst werden. Schlechte Scans weisen häufig eine hohe Fehlausrichtungskompensation auf, die ein klarer Indikator für einen Fehler während des Scans ist. In anderen Schritten können jedoch Fehler auftreten, die ebenfalls zu ungenauen Daten führen können. Diese Fehler sind oft bei der Untersuchung der einzelnen berechneten architektonischen Eigenschaften zu erkennen. Wenn die Werte weit außerhalb des Bereichs der and...

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Die mechanische Prüfung von Nagetierknochen ist eine wertvolle Methode, um Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu gewinnen. Mangels angemessenem praktischem Verständnis können die Ergebnisse überinterpretiert werden oder keine Gültigkeit haben. Dieses Protokoll dient als Leitfaden, um sicherzustellen, dass mechanische Tests genau durchgeführt werden, um gültige und funktionsfähige Daten zu liefern.

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen von Biegeversuchen gehören: Konsequentes Platzieren der Knochen in gleicher Orientierung, Dokumentation des Bruchverlaufs des Knochens während des Tests und Interpretation komplexer Ergebnisse. Unser Protokoll bietet nicht nur einen Leitfaden für das Testverfahren und die Datenanalyse für Ganzknochenbiegetests, sondern auch für die Probenvorbereitung und -lagerung. Und dies ist der erste Fall, in dem das gesamte Protokoll vorgestellt wurde.Die mechanische Prüfung des gesamten Knochens ist eine schnelle und einfache Methode, um die Anfälligkeit für Knochenbrüche im Vergleich zu anderen Testmethoden zu messen.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

578 Aufrufe.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen von Biegeversuchen gehören: Konsequentes Platzieren der Knochen in gleicher Orientierung, Dokumentation des Bruchverlaufs des Knochens während des Tests und Interpretation komplexer Ergebnisse. Unser Protokoll bietet nicht nur einen Leitfaden für das Testverfahren und die Datenanalyse für Ganzknochenbiegetests, sondern auch für die Probenvorbereitung und -lagerung. Und dies ist der erste Fall, in dem das gesamte Protokoll vorgestellt wur...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei Biegetests für ganze Knochen 

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Forschung

Biotechnik

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#39;s Susceptibility to Fracture

Mechanical Testing Procedure to Check Bone&#039;s Susceptibility to Fracture  

After harvesting the femur and tibia from the euthanized mouse, obtain a six to 10 micrometer resolution micro CT scan reconstructed for each sample to calculate for exercise geometry. Thaw all the bones for testing, and ensure to test all bones from the same experiment in one session. Now locate a load cell with sensitivity and capacity suitable for the specimen.Considering the failure range of the specimen, select a load cell with 50%more capacity while maximizing sensitivity. Locate the loading and support span fixtures. Install the load cell and fixtures by screwing the load cell onto the upper support of the tester, attaching the upper loading fixture to the load cell and mounting the lower fixture to the bottom support of the tester.Then select a support span length, which will remain constant for all samples. Use the shortest bone in the sample set to determine the support span distance, and properly orient the bone between the fixtures. To perform a three-point bending test of the femur.place the anterior surface of the bone against the support span, ensuring the position is within the diaphysis of the sample. Exclude the third trochanter on the proximal end and the transition point where the bone widens into the metaphysis and condyles on the distal end. Ensure the loading span is centered within the support span and contains a uniform region of the bone.Then measure and record the support span distance. Once the support span has been set and recorded, bring the lower fixture close to the upper fixture with enough room between the two for a bone to be placed. Place the bone back into saline or rehydrated with a saline bolus.Ensure all fixture parts are tight and free of movement. In the mechanical tester software, design a bending test profile with a slow displacement ramp rate to avoid viscoelastic effects to load the bone until it fails. After creating a testing profile, create distinct folders for every study group.Select a properly thawed bone, then measure and record its full length using calipers. Load the bone sample onto the fixture in the proper orientation. Alter the file name to reflect the particulars of the sample being tested and save each test in its corresponding folder.Zero the load and activate the system's mover, ensuring it's not in load or displacement control. Carefully apply a slight preload to the bone to secure its position. Avoid compromising the sample.Aim for a preload of about 0.25 Newtons. Make sure the desired bone orientation is kept consistent before moving forward. Hydrate the sample by generously dousing it with saline.On the software, initiate the bending test by selecting start or run. It's crucial to observe the sample for the duration of the test accurately, noting down any occurrences of issues. Monitor closely as the bone starts to fracture.Tests stop automatically when they reach their set limits. But if there's a failure, stop the test manually to avoid damaging the load cell. Once testing is complete, measure the length from the distal end to the breakpoint using calipers and record it.