T.C. wurde durch das National Institute of General Medical Sciences Molecular Biophysics Training Grant GM-08295 und das National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter der Fördernummer DGE 2146752 unterstützt. R.G. und B.H. wurden durch den Zuschuss R21-GM135666 des National Institute of Health unterstützt, der R.G. und B.H. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Zuschuss R35-GM127018 des National Institute of General Medical Sciences finanziert, der an E.N. E.N. ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute.

Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern für Kryo-EM-Strukturstudien

<ol>
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R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li></ol>

Unser Protokoll beschreibt, wie Streptavidin-Affinitätsgitter erstellt und verwendet werden und wie die Daten verarbeitet werden, die das Streptavidin-Beugungssignal enthalten. Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll, die besondere Aufmerksamkeit erfordern.
Erfolglose Rasterbatches können auf mehrere häufige Fehler zurückgeführt werden. Die häufigste Fehlerquelle ist die Verwendung veralteter oder minderwertiger Reagenzien. Es ist besonders wichtig, die biotinylierte Lipidlösung genau so herzustellen, wie im Protokoll beschrieben. Darüber hinaus können Verunreinigungen, wie z. B. Waschmittelrückstände auf dem Laborgeschirr oder natürlich vorhandene Öle auf der Haut, die Qualität der Streptavidin-Kristalle und damit die Qualität der resultierenden Bilder beeinträchtigen. Es wird daher empfohlen, vor der ersten Kohlenstoffverdampfung drei Waschzyklen für die Gitter durchzuführen, um mögliche Tensidverunreinigungen beim Gitterhersteller zu entfernen (Schritt 2.1). Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Verunreinigungen oder Verunreinigungen des Rizinusöls die Kristallbildung auf dem Gitter behindern.
Das Herstellen und Aufnehmen der Lipid-Monoschicht ist eine Aufgabe, die einige Male geübt werden sollte, um ein Gefühl für die kleinen Lipidvolumina zu bekommen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass dieser Schritt die ersten zwei oder drei Male fehlschlägt, bevor eine adäquate Lipidmonoschicht hergestellt werden kann, was sich letztendlich in der Qualität der Streptavidin-Kristalle widerspiegelt, die in negativ gefärbten Gittern zu sehen sind (Abbildung 4C).
Es ist wichtig, die Rückseite (Goldseite, Lipidseite) des Gitters während des Gitterherstellungsprozesses (Schritte 3.12-3.20) niemals nass werden zu lassen. Falls die Rückseite nass wird, wird empfohlen, das Gitter zu entsorgen. Dies kann zum Auftreten großer Lipidvesikel führen, die die Bildqualität stören (Abbildung 5D) (Zeile 3, Tabelle 1). Lipidvesikel können auch aufgrund unzureichender Waschung nach dem Auftragen der Lipidmonoschicht beobachtet werden (Schritt 3.13). Drei aufeinanderfolgende Waschungen mit Kristallisationspuffer werden empfohlen, nachdem die Lipidmonoschicht vor der Zugabe von Streptavidin berührt wurde.
Nachdem eine dünne Kohlenstoffschicht auf Trehalose-eingebettete Gitter verdampft wurde, kann die Rückseite des Gitters nass werden, ohne die Gitterqualität zu beeinträchtigen. Beispielsweise wird eine Benetzung der Rückseite häufig beobachtet, wenn der Probenpuffer auch nur minimale Mengen an Reinigungsmittel enthält. Die Benetzung der Rückseite durch die Probe kann zu einer unspezifischen Bindung der Proben an den dünnen Kohlenstofffilm auf der Rückseite führen, was die Wirksamkeit der Verhinderung der Diffusion von Partikeln an die Luft-Wasser-Grenzfläche oder die Verwendung der Affinitätsbindung für netzgebundene Reinigungsstrategien verringert. Wenn möglich, geben Sie die Probe in Abwesenheit von Reinigungsmittel in das Gitter. Waschmittel und andere Zusätze können nachträglich während der Gitterwaschschritte oder in einem letzten Schritt vor der Verglasung hinzugefügt werden. Dies ist eine Einschränkung bei der Verwendung von Streptavidin-Affinitätsgittern; Wenn das Ziel jedoch darin besteht, die bevorzugte Orientierung zu verbessern, wurde die Probenvorbereitung mit Puffern, einschließlich Detergens, erfolgreich durchgeführt11.
Eine häufige Fehlerquelle kann auf das Alter der Gitter in Bezug auf beide Kohlenstoffverdampfungsschritte (Schritt 2.3 und Schritt 3.21) zurückgeführt werden. In diesem Protokoll beträgt die empfohlene Wartezeit 5-7 Tage nach der rückseitigen Kohlenstoffverdampfung, bevor Streptavidin-Gitter für Kryo-EM verwendet werden. Wenn Gitter zu früh nach der Herstellung verwendet werden, wurde beobachtet, dass das Gitter und die Lipidmonoschicht aus den Gitterlöchern mobilisiert werden. Eine ähnliche Beobachtung kann gemacht werden, wenn die Gitter zu alt sind und nach sechs Monaten verwendet werden (Abbildung 5A) (Zeile 1, Tabelle 1). Wir stellen die Hypothese auf, dass diese Beobachtung durch Änderungen in der Hydrophobizität des Kohlenstoffträgers erklärt wird, der zur Stabilisierung der Lipidmonoschicht und der Streptavidin-Kristalle aufgebracht wird. Darüber hinaus können Streptavidin-Gitter mosaikartig erscheinen (Abbildung 5B) (Reihe 3, Tabelle 1) und sowohl in der Negativfärbung als auch in der Kryo-EM gebrochen sein, wenn die Monoschicht auf Gitter aufgetragen wird, bei denen die erste Kohlenstoffverdampfungsschicht (Schritt 2.3) nicht ausreichend gealtert ist.
Eine weitere häufige Fehlerquelle kann auf die Zerbrechlichkeit der kristallinen Streptavidin-Monoschicht zurückgeführt werden (die Lipidmonoschicht ist selbst flüssig und kann sich reversibel ausdehnen oder komprimieren). Die rückseitige Kohlenstoffverdampfung (Schritt 3.21) sorgt für eine kritische Stabilität sowohl der Monoschicht als auch des Streptavidin-Gitters während des Probenadsorptions-, Wasch- und Kryo-EM-Blotting-Prozesses. In Ermangelung einer ausreichenden Kohlenstoffverdampfung auf der Rückseite des Gitters erscheinen Streptavidin-Gitter nach dem Blotting/Einfrieren oft fragmentiert (Abbildung 5C) (Reihe 2, Tabelle 1). In diesem Protokoll empfehlen wir die Verwendung eines einseitigen automatischen Tauchgefrierschranks für einseitiges Blotting. Diese Methode liefert hochgradig reproduzierbare Blotting-Bedingungen, die das Streptavidin-Gitter während des Gefrierprozesses erhalten und eine optimierte Optimierung der Probenapplikation und der Blotting-Parameter ermöglichen. Alternativ wurden andere automatische Tauchgefriergeräte in Kombination mit manuellem Blotting verwendet. Dazu wird die eigentliche Löschfunktion in den Geräteeinstellungen deaktiviert und das Raster stattdessen durch Greifen mit einer Pinzette, die Löschpapier hält, durch den seitlichen Eingang gewischt. Mit dieser Methode können qualitativ hochwertige Ergebnisse für Labore ohne einseitiges Blotting- und Tauchgefriergerät erzielt werden. Die Reproduzierbarkeit von Netz zu Netz ist jedoch eine Herausforderung.
Während die Verwendung von Streptavidin-Affinitätsgittern viele Vorteile hat, müssen einige Einschränkungen dieser Methode berücksichtigt werden. Aufgrund der Art des Verfahrens ist es in der Regel nicht möglich, die Qualität des Streptavidin-Gitters zu beurteilen, bis der gesamte Prozess abgeschlossen ist. Es wird empfohlen, die Qualität jeder Charge vor dem Einfrieren von Proben schnell durch negative Färbung zu überprüfen. Aufgrund des Signals, das das Streptavidin-Gitter zu den Rohbildern beiträgt, kann es in einigen Fällen schwierig sein, allein anhand der Bilder zu beurteilen, ob eine ausreichende Anzahl intakter, disperser Teilchen vorhanden ist. Aus dem gleichen Grund ist eine On-the-fly-Verarbeitung von Kryo-EM-Daten während der Datenerfassung nicht möglich, es sei denn, das Streptavidin-Signalsubtraktionsverfahren wurde in die Datenvorverarbeitungspipeline aufgenommen. Da das Streptavidin-Signal normalerweise von den bewegungskorrigierten Bildern und nicht von den Bildern selbst subtrahiert wird, kann das Bayes'sche Polieren, wie es in gängigen Software-Suiten implementiert ist, fehlschlagen, wenn die beschriebenen Subtraktionsverfahren verwendet werden. Es wird daher empfohlen, die Bewegungskorrektur in mehreren Patches durchzuführen, um die Partikelbewegung von Beginn der Datenverarbeitung an zu minimieren16.
Trotz dieser Einschränkungen bieten Streptavidin-Affinitätsgitter viele Vorteile. Zwei Hauptvorteile, die Streptavidin-Affinitätsgitter gegenüber Standard-Kryo-EM-Gittern mit offenem Loch bieten, sind ein Mittel zum Schutz von Proben vor der Luft-Wasser-Grenzfläche und zur Konzentration von Proben mit geringer Abundanz (10-100 nM) auf dem Gitter. Andere Stützschichten wie Kohlenstoff- und Graphenoxid können ebenfalls als Strategien zur Überwindung dieser Engpässe bei der Probenvorbereitung verwendet werden. In einem Beispiel waren Streptavidin-Affinitätsgitter die einzige Lösung, um eine intakte Rekonstruktion einer Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung zu erhalten, die mit Vernetzungsansätzen nicht kompatibel war. 12
Ein weiterer großer Vorteil, den Streptavidin-Affinitätsgitter bieten, ist eine Lösung für Proben, die an anderen Stützschichten wie Kohlenstoff oder Graphenoxid adsorbieren, mit bevorzugten Orientierungen, die die Möglichkeit einer 3D-Rekonstruktion der interessierenden Probe behindern. Die zufällige Biotinylierung von Proben mit kommerziell erhältlichen Kits ermöglicht die zufällige Bindung der interessierenden Probe an die Streptavidin-Monoschicht, um mehr potenzielle Ansichten zur Bewältigung dieser Herausforderung zu erhalten.
Darüber hinaus bieten Streptavidin-Affinitätsgitter Vorteile, die für affinitätsbasierte Gitter einzigartig sind. Die hohe Affinität und Spezifität der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung ermöglicht die Kopplung von Streptavidin-Affinitätsgittern mit anderen Arbeitsabläufen, an denen Biotin beteiligt ist, um interessante Komplexe zu reinigen. In einem veröffentlichten Beispiel immobilisierten die Autoren einen Komplex auf Streptavidin-Affinitätsgittern und inkubierten einen Bindungspartner unbekannter Stöchiometrie in großem Überschuss. Nach dem Abwaschen des ungebundenen Proteins wurde der korrekt zusammengesetzte Superkomplex erhalten und konnte sofort mit Kryo-EM11 analysiert werden. Eine mögliche zukünftige Anwendung könnte darin bestehen, Streptavidin-bindende Protein-Tags, das Avi-Tag-System oder Proximity-Marking-Ansätze mit Streptavidin-Affinitätsgittern zu kombinieren, um einzelne Proteine und/oder Proteinkomplexe direkt aus rekombinanten oder endogenen Quellen ohne aufwändige Standardaufreinigungsschemata zu extrahieren.
Durch die Bereitstellung dieses Protokolls sollten Labore in der Lage sein, die Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern leicht zu reproduzieren und sie als häufiger verwendetes Werkzeug für die Strukturanalyse von Proteinkomplexen durch Kryo-EM zu etablieren.

Die Elektronen-Kryomikroskopie (Kryo-EM) hat das Gebiet der Strukturbiologie revolutioniert, indem sie die makromolekulare Strukturbestimmung großer, flexibler und heterogener Proben ermöglicht, die bisher mit Röntgenkristallographie oder Kernspinresonanz nicht zugänglich waren1. Bei dieser Methode werden Makromoleküle in Lösung schockgefroren, um eine dünne Schicht Glaseis zu erzeugen, die anschließend mit einem Elektronenmikroskop abgebildet werden kann. In den letzten Jahren haben bedeutende Fortschritte sowohl bei der Mikroskophardware als auch bei der Bildverarbeitungssoftware die Probentypen, die für die hochauflösende Strukturbestimmung durch Kryo-EM geeignet sind, weiter erweitert.
Dennoch bleibt die Präparation dünner, verglaster Proben einer der kritischsten Schritte bei der makromolekularen Strukturbestimmung mittels Kryo-EM. Biologische Proben sind oft dynamisch, zerbrechlich, anfällig für Denaturierung und manchmal nur in geringen Mengen für Kryo-EM-Studien verfügbar. Während des Blotting-Prozesses interagieren diese Partikel mit der hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche, was zu partikelbevorzugten Orientierungen, der Demontage fragiler Komplexe, einer teilweisen oder vollständigen Denaturierung der Probe und einer Aggregation führen kann 2,3,4. Die Verwendung von Detergenzien oder anderen Tensiden, die chemische Vernetzung und die Adsorption von Proben zur Stützung von Schichten sind gängige Strategien zur Konservierung biologischer Proben während des Gefrierprozesses. Trägerschichten wie Graphenoxid 5,6,7 oder amorpher Kohlenstoff8 dienen ebenfalls dazu, Partikel durch Adsorption auf dem Gitter zu konzentrieren, wenn die Probe in begrenzten Mengen verfügbar ist. Diese Methoden sind jedoch nicht allgemein oder zuverlässig, und die Optimierung der Netzvorbereitung kann extrem zeitaufwändig sein oder ganz scheitern.
Streptavidin-Affinitätsgitter 9,10 wurden entwickelt, um diese Mängel zu überwinden und eine milde und allgemein anwendbare Methode zur Sequestrierung des interessierenden Komplexes und zum Schutz vor der Luft-Wasser-Grenzfläche bereitzustellen. Diese Gitter verwenden ein zweidimensionales (2D) Streptavidin-Kristallgitter, das auf einer Monoschicht biotinylierter Lipide auf dem Gitter gewachsen ist. Nachdem die Proben selbst biotinyliert wurden (oft spärlich und zufällig, d.h. durchschnittlich ein Biotin pro Komplex), können sie auf das Streptavidin-beschichtete Gitter aufgetragen werden. Da die Probenadsorption auf der extrem hohen Affinität zwischen Streptavidin und Biotin beruht, können mit diesen Gittern Probenkonzentrationen von nur 10 nM verwendet werden. Kommerziell erhältliche Biotinylierungskits für Proteine und biotinylierte Primer für DNA-haltige Komplexe machen es relativ einfach, die notwendigen Biotin-Einheiten an die meisten interessierenden Proben anzubringen. Neben der Konzentration der Probe und dem Fernhalten von der schädlichen Luft-Wasser-Grenzfläche während des Blottings kann die zufällige Biotinylierung eines oder nur einiger weniger Lysinreste den Orientierungsbereich des interessierenden Moleküls auf dem Kryo-EM-Gitter erheblich verbessern, wie eine Reihe von Studiengezeigt haben 11. Während das Signal des darunter liegenden Streptavidin-Kristalls in den Rohbildern vorhanden ist, können Datenverarbeitungsschemata mit Fourier-Filterung der scharfen Bragg-Reflexionen aus dem Kristall während der frühen Datenverarbeitung leicht entfernt werden, was letztendlich hochauflösende Rekonstruktionen der interessierenden Probe ermöglicht 11,12,13. Hier wird ein optimiertes, schrittweises Protokoll für die robuste Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern und die anschließende Verwendung in Kryo-EM-Experimenten bereitgestellt. Es wird erwartet, dass das bereitgestellte Protokoll über einen Zeitraum von 2 Wochen abgeschlossen wird (Abbildung 1A). Die ersten Teile des Protokolls beschreiben die Herstellung von Reagenzien, die Vorbehandlung von Gittern und die ersten Schritte der Kohlenstoffverdampfung. Als nächstes werden Anweisungen für die Herstellung der Lipidmonoschicht und das Wachstum von Streptavidinkristallen auf EM-Gittern beschrieben. Darüber hinaus werden Anweisungen für die Verwendung von Streptavidin-Affinitätsgittern in Negativfärbe-EM- und Kryo-EM-Experimenten bereitgestellt. Schließlich werden Verfahren zur Entfernung des Streptavidin-Signals aus Mikroskopaufnahmen bereitgestellt, sobald Kryo-EM-Daten erfasst wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

Streptavidin-Affinitätsgitter bieten Strategien zur Überwindung vieler häufig auftretender Herausforderungen bei der Probenvorbereitung in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), einschließlich Probendenaturierung und bevorzugter Orientierungen, die aufgrund der Luft-Wasser-Grenzfläche auftreten können. Streptavidin-Affinitätsgitter werden jedoch derzeit von wenigen Kryo-EM-Labors verwendet, da sie nicht im Handel erhältlich sind und einen sorgfältigen Herstellungsprozess erfordern. Zweidimensionale Streptavidin-Kristalle werden auf eine biotinylierte Lipid-Monoschicht gezüchtet, die direkt auf Standard-Kryo-EM-Gitter mit löchrigem Kohlenstoff aufgebracht wird. Die hochaffine Wechselwirkung zwischen Streptavidin und Biotin ermöglicht die anschließende Bindung von biotinylierten Proben, die während der Kryo-EM-Probenvorbereitung vor der Luft-Wasser-Grenzfläche geschützt sind. Darüber hinaus bieten diese Gitter eine Strategie zur Konzentration von Proben, die in begrenzten Mengen verfügbar sind, und zur Aufreinigung von Proteinkomplexen von Interesse direkt auf den Gittern. Hier wird ein schrittweises, optimiertes Protokoll für die robuste Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern für den Einsatz in Kryo-EM- und Negativfärbeexperimenten bereitgestellt. Darüber hinaus ist ein Leitfaden zur Fehlerbehebung für häufig auftretende Herausforderungen enthalten, um die Verwendung von Streptavidin-Affinitätsgittern für die größere Kryo-EM-Gemeinschaft zugänglicher zu machen.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Kryo-EM-Probenvorbereitung mit dem Streptavidin-Biotin-Ansatz

Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern für die Probenvorbereitung der Kryo-Elektronenmikroskopie

Nach der Kohlenstoffverdampfung in Schritt 3.21 (in der Regel nach einer Woche) können Streptavidin-Affinitätsgitter für die Kryo-EM oder die Probenvorbereitung mit Negativfärbung gemäß den in den Schritten 4 und 5 beschriebenen Verfahren verwendet werden. Eine repräsentative Mikroskopaufnahme, die mit einem K3-Detektor auf einem Titan-Krios bei 81.000-facher Vergrößerung und einer Pixelgröße von 1,05 Å einer biotinylierten Probe aufgenommen wurde, die mit Streptavidin-Affinitätsgittern eingefroren wurde, ist in Abbildung 4A dargestellt. Die erfolgreiche Gitterbildung wird durch das kontinuierliche Gittermuster beobachtet, das im Hintergrund des Bildes erscheint. Dies kann leichter durch das Beugungsmuster beobachtet werden, das in der schnellen Fourier-Transformation (FFT) in Abbildung 4A (rechts) dargestellt ist. Nach der Datenerfassung kann das Signal, das durch das Streptavidin-Gitter zum Bild beigetragen wird, gemäß dem in Schritt 6 dieses Protokolls beschriebenen Verfahren rechnerisch maskiert werden, um eine subtrahierte Mikroskopaufnahme (Abbildung 4B) zu erzeugen, die für nachfolgende Datenverarbeitungsschritte verwendet werden kann. Die FFT in Abbildung 4B (rechts) zeigt, dass das in Abbildung 4A (rechts) beobachtete Beugungsmuster erfolgreich aus dem Originalbild entfernt wurde.
Abbildung 4C zeigt eine Beispiel-Mikroskopaufnahme, die mit einem Tecnai 12-Mikroskop bei einer 49.000-fachen Vergrößerung und einer Pixelgröße von 1,6 Å einer biotinylierten Probe aufgenommen wurde, die an Streptavidin-Affinitätsgitter gebunden und mit Uranylformiat negativ gefärbt wurde. Die Gitter wurden nach dem in Schritt 4 dieses Protokolls beschriebenen Verfahren hergestellt und hinterließen einen dickeren Fleckenfilm.
Es gibt mehrere häufige Beobachtungen, wenn das Herstellungsverfahren des Streptavidin-Gitters nicht erfolgreich ist, die im Diskussionsabschnitt und in Tabelle 1 näher beschrieben werden. Abbildung 5 zeigt mehrere Beispiele für diese Beobachtungen. Abbildung 5A zeigt eine Mikroskopaufnahme eines negativ gefärbten Streptavidin-Affinitätsgitters, das aus einer über sechs Monate alten Charge verwendet wurde. Die Monoschicht hat sich aus den Löchern in der Kohlenstofffolie der Quantifoil-Gitter mobilisiert und wird mit ähnlichen Abmessungen wie die Löcher im Gitter beobachtet. Abbildung 5B zeigt ein Beispiel für Streptavidin-Kristalle mit hoher Mosaikität, die während der Probenvorbereitung leicht gestört werden. Abbildung 5C zeigt eine repräsentative Mikroskopaufnahme aus einem Streptavidin-Affinitätsgitter, in dem die Kohlenstoffverdampfung in Schritt 3.21 zu dünn ist oder weggelassen wird. Das Streptavidin-Gitter ist während des Kryo-EM-Probenvorbereitungsprozesses fragmentiert worden. Abbildung 5D zeigt ein negativ gefärbtes Streptavidin-Affinitätsgitter, das durch Lipidvesikel kontaminiert ist, wahrscheinlich aufgrund unzureichender Waschungen während der Schritte 3.13 oder der feuchten Goldseite des Gitters während der Schritte 3.13-3.20. Im Diskussionsabschnitt und in Tabelle 1 finden Sie Strategien zur Überwindung dieser häufigen Probleme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Herstellungsverfahrens für Streptavidin-Affinitätsgitter. (A) Überblick über die Zeitleiste des Herstellungsverfahrens für Streptavidin-Affinitätsgitter. Das gesamte Verfahren kann über zwei Wochen abgeschlossen werden, wobei zwei Kohlenstoffverdampfungsschritte und jeweils eine Woche danach erforderlich sind, damit der Kohlenstoff ausreichend altern kann. (B) Gezoomt in der Ansicht eines Gitterquadrats eines Streptavidin-Affinitätsgitters, das die Schichten zeigt, aus denen das Gitter nach Abschluss des Herstellungsprozesses besteht, einschließlich des Standard-Kryo-EM-Gitters mit Goldbarren und löchrigem Kohlenstofffilm, der ersten verdampften Kohlenstoffschicht, der Lipidmonoschicht, des 2D-Streptavidin-Kristalls und der rückseitigen verdampften Kohlenstoffträgerschicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Abbildung 2: Lipidmonoschicht und Streptavidin-Kristallisation (A) Bilder, die zeigen, wie die Lipidmonoschicht in der kleinen Petrischale erfolgreich gebildet wird, indem Talkumpuder verwendet wird, um eine Grenze für das Rizinusöl zu schaffen, die bei der Bildung der Lipidmonoschicht einen konstanten Oberflächendruck erzeugt. (B) Bilder, die zeigen, wie Streptavidin-Kristalle auf Kryo-EM-Gittern gezüchtet werden. Zuerst wird die Kohlenstoffseite der Gitter mit der Lipidmonoschicht berührt und gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Wäschen im Kristallisationspuffer. Streptavidin wird hinzugefügt und die Gitter werden 2 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Abbildung 3: Beispielparameter für die Datei process_subtraction.cfg zur Durchführung der Streptavidin-Gittersubtraktion aus Mikroaufnahmen (Schritt 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der erfolgreichen Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern. (A) Kryo-EM-Mikroskopaufnahme von biotinylierten Protein/Nukleosomen-Komplexen, hergestellt mit hausgemachten Streptavidin-Affinitätsgittern. Die FFT ist rechts dargestellt und zeigt das Beugungsmuster des Streptavidin-Kristalls. (B) Dieselbe Schliffaufnahme wie in Feld A wird nach dem Gittersubtraktionsverfahren gezeigt, um das Signal vom 2D-Streptavidin-Kristall aus dem Originalbild zu entfernen. (C) Ein Beispiel für eine Mikroskopaufnahme, die durch Negativfärbung einer biotinylierten Probe erhalten wurde, die an Streptavidin-Affinitätsgitter gebunden ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse der erfolglosen Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern. (A) Mikroskopische Aufnahme, die die Mobilisierung der Streptavidin-Monoschicht aus den Gitterlöchern zeigt, wenn die Gitter älter als sechs Monate sind. (B) Mikroskopische Aufnahme mit Streptavidin-Gittern mit hoher Mosaikität, die sowohl bei Kryo-EM als auch bei der Probenvorbereitung mit Negativfärbung leicht beschädigt werden können. (C) Mikroskopische Aufnahme der Fragmentierung des Streptavidin-Gitters während der Kryo-EM-Probenvorbereitung, wenn die Kohlenstoffverdampfungsschicht in Schritt 3.21 zu dünn ist oder weggelassen wird. (D) Repräsentative Mikroskopaufnahme, die mit Lipidvesikeln kontaminiert ist, wahrscheinlich aufgrund unzureichender Waschung während der Schritte 3.13 oder der feuchten Goldseite des Gitters während der Schritte 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Leitfaden zur Fehlerbehebung zur Überwindung häufig auftretender Herausforderungen, die bei der erfolglosen Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern auftreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung von Streptavidin-Affinitätsgittern wird für die Verwendung in Strukturstudien anspruchsvoller makromolekularer Proben durch Kryo-Elektronenmikroskopie bereitgestellt.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

In jüngster Zeit gab es viele technologische Fortschritte in der Kryo-EM, einschließlich Fortschritten in der Mikroskop-Hardware selbst, die die Gesamtqualität der Bilder verbessern, und auch Entwicklungen in der Software, die zur Verarbeitung der Kryo-EM-Bilder verwendet wird und mit der großen Heterogenität umgehen kann, die in vielen der Proben vorhanden ist. Die Probenvorbereitung ist nach wie vor einer der größten Engpässe in der Kryo-EM. Die Probenmenge kann begrenzt sein und Proteine neigen dazu, während der Vitrifikation an die hydrophobe Luft-Wasser-Grenzfläche zu absorbieren.Dies kann zu einer Denaturierung der Probe, dem Aufbrechen größerer Proteinkomplexe und bevorzugten Partikelorientierungen führen, die in den Kryo-EM-Bildern vorhanden sind. Diese Gitter nutzen die hochaffine Wechselwirkung zwischen Streptavidin und Biotin, um biotinylierte Proben zu binden und sie vor der hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche zu schützen. Wir können mit sehr geringen Probenmengen arbeiten, und die zufällige Biotin-Hochstimmung von Proben bietet eine Strategie, um bevorzugte Orientierungsprobleme zu überwinden, die bei der Verwendung anderer Stützschichten beobachtet werden können.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.6K Aufrufe.  University of California, Berkeley. In jüngster Zeit gab es viele technologische Fortschritte in der Kryo-EM, einschließlich Fortschritten in der Mikroskop-Hardware selbst, die die Gesamtqualität der Bilder verbessern, und auch Entwicklungen in der Software, die zur Verarbeitung der Kryo-EM-Bilder verwendet wird und mit der großen Heterogenität umgehen kann, die in vielen der Proben vorhanden ist. Die Probenvorbereitung ist nach wie vor einer der größten Engpässe in der Kryo-EM. Die Probenmenge kann begrenzt sein und Pr...

Serie: Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Kryo-EM-Probenvorbereitung mit dem Streptavidin-Biotin-Ansatz

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.