Diese Arbeit wurde gefördert durch den Europäischen Forschungsrat ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). Das DDI dankt der Alexander von Humboldt-Stiftung für ein Postdoc-Stipendium.

1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Biotinyliertes disiLID (b-disiLID) und mOrange-Nano (siehe Materialtabelle) exprimieren und reinigen nach den zuvor beschriebenen Verfahren 7,8.</li>
	<li>Bereiten Sie Lipidmischungen in Glasfläschchen mit der ausgewählten Lipidzusammensetzung und den ausgewählten Konzentrationen vor. Zuerst werden die Lipide in Chloroform aufgelöst, um eine endgültige Lipidlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu erhalten.<ol><li>Lipide werden gemischt, um eine Zusammensetzung von 94,9 mol% 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 5 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminN-(cap biotinyl)natriumsalz (DOPE-biotin) und 0,1 mol% 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanin (DiD) zu erhalten (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die Lipidmischung kann mit unterschiedlichen Verhältnissen und DOPE-Biotin-Konzentrationen und/oder verschiedenen Membranfarbstoffen eingestellt werden. Die empfohlene DOPE-Biotin-Konzentration (5 mol%) ermöglicht die Bildung einer Streptavidin (SAv)-Schicht mit hoher Dichte in den folgenden Schritten.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs) nach den zuvor beschriebenen Methoden 7,8,12. Für diesen Schritt empfiehlt es sich, SUVs mit einem Durchmesser ≤100 nm vorzubereiten.</li>
	<li>Für diese Studie wird die Beschallungsmethode eingesetzt. Zuerst wird die Chloroformlösung im Glasfläschchen mit einem Stickstoffstrom verdampft, während die Fläschchen gedreht werden, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Sie anschließend das restliche Chloroform für mindestens 1 h unter Vakuum.<ol><li>Rehydrieren Sie den getrockneten Film in Reinstwasser mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml Lipiden durch Vortexen. Zum Schluss beschallen Sie die erhaltene Lösung 10 Minuten lang, bis die undurchsichtige Lösung klar wird. HINWEIS: Lagern Sie die Lipidmischung in einem Mikrozentrifugenröhrchen im Kühlschrank für maximal 2 Wochen. Es können auch verschiedene SUV-Aufbereitungsmethoden (z. B. Extrusionsverfahren) verwendet werden, solange die Größe der endgültigen SUVs ≤ 100 nm beträgt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. mOrange-Nano-Rekrutierung zu disiLID-funktionalisierten SLBs
<ol><li>150 μl 2 M NaOH in jede Vertiefung der 18-Well-Glasbodenkammer mit μ Objektträger geben (siehe Materialtabelle) und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie anschließend das NaOH und waschen Sie die Vertiefungen 3-5 Mal, zuerst mit 150 μL Reinstwasser, dann 3 Mal mit 150 μL Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) mit 10 mM CaCl2.</li>
	<li>Geben Sie 15 μl frisch zubereitete SUVs (Stammkonzentration 1 mg/ml in Wasser) in die Vertiefungen mit 150 μl Puffer mit 10 mM CaCl2 , um eine Verdünnung von SUVs um etwa den Faktor 10 im Puffer zu erhalten. Lassen Sie die SUVs 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubationszeit werden biotinylierte SLBs gebildet.</li>
	<li>Waschen Sie die SLBs mindestens 7 Mal mit Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) ohne CaCl2 , indem Sie zuerst die Lösung entfernen und anschließend in jedem Schritt frischen Puffer hinzufügen. Es wird empfohlen, für jeden Waschschritt 80 μl Puffer zu verwenden. HINWEIS: Eine optimale Reinigung der SLBs wird erreicht, indem die frische Lösung mehrmals auf und ab pipettiert wird, ohne die Oberfläche zu berühren. Das Pipettieren der Lösung in den Vertiefungen, die die neu gebildeten SLBs enthalten, sollte schonend erfolgen, um die Bildung kleiner Luftblasen zu reduzieren, die die gebildeten SLBs beschädigen würden. Ab diesem Zeitpunkt sollten die Vertiefungen ein ausreichendes Volumen an Puffer enthalten, um ein Austrocknen der SLBs zu verhindern.</li>
	<li>Für die weitere Funktionalisierung der biotinylierten SLBs mit SAv wird eine Lösung von SAv bis zu einer Endkonzentration von 250 nM zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Entfernen Sie anschließend den Überschuss an SAv, indem Sie ihn mindestens 5 Mal mit einem Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) waschen.</li>
	<li>Halten Sie die Proben von diesem Moment an unter rotes Schutzlicht, um eine unerwünschte Photoaktivierung von photoschaltbaren Proteinen zu vermeiden. Geben Sie b-disiILD (siehe Materialtabelle) zu einer Endkonzentration von 1 μM in der Vertiefung hinzu. Entfernen Sie nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur das überschüssige Protein, indem Sie es mindestens 5 Mal mit Puffer waschen.</li>
	<li>Geben Sie mOrange-Nano (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 200 nM und halten Sie die Probe im Dunkeln, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.</li>
	<li>Legen Sie den μ-Objektträger unter das Fluoreszenzmikroskop und passen Sie die Bildgebungseinstellungen an. Stellen Sie den 552 nm Laser für die Anregung von mOrange-Nano ein. Passen Sie den Emissionsbereich an, um das mOrange-Signal zu optimieren. Die Photoaktivierung von disiLID wird mit einem 488 nm Laser unter Verwendung von Lichtpulsen im Abstand von 2,58 s erreicht.</li>
</ol>3. Vorbereitung von GUVs
<ol><li>Eine 5%ige (w/v) Lösung von Polyvinylalkohol (PVA, siehe Materialtabelle) (MW: 145 000 g/mol) mit 100 mM Saccharose in Reinstwasser herstellen und über Nacht bei 80 °C bei 400 U/min mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lipidlösung in Chloroform mit der gewünschten Zusammensetzung vor (Endkonzentration 10 mg/ml). Für diese Methode wird eine Zusammensetzung empfohlen, die aus 10 mg/ml POPC, 10 mol% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG), 2 mol% DOPE-biotin und 1 mol% DiD besteht (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereiten Sie GUVs mit der Hydratationstechnik 7,8 vor. Zuerst werden 40 μl der vorbereiteten PVA-Lösung als homogene dünne Schicht auf einen 60 mm x 24 mm großen Objektträger verteilt, vorzugsweise mit einer Pipettenspitze. Anschließend die dünne Schicht bei 50 °C 30 min trocknen.</li>
	<li>5 μl der Lipidlösung mit einer Nadel auf die PVA-Schicht verteilen und bei 30 °C 1 h trocknen lassen.</li>
	<li>Montieren Sie eine Kammer auf dem funktionalisierten Glasobjektträger mit einem Abstandshalter (~40 mm × 24 mm × 2 mm, siehe Materialtabelle) und einem zweiten Objektträger.</li>
	<li>1 ml Rehydrationspuffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) für 1 h bei Raumtemperatur in die Kammer geben, um GUVs zu bilden. Nach 1 h die Kammer umdrehen und mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Glasoberflächen klopfen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Glasschieber auf einer Seite, um die gebaute Kammer zu öffnen, und entnehmen Sie die GUVs mit einer Pipette.</li>
	<li>Geben Sie die Lösung in ein Plastikröhrchen und lassen Sie die GUVs 2 Stunden lang absetzen.</li>
</ol>4. mOrange-Nano Rekrutierung zu disiLID-funktionalisierten GUVs
<ol><li>Geben Sie eine Lösung von SAv zu den frisch geernteten GUVs und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen. HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten mit rotem Schutzlicht durchgeführt werden, um eine Photoaktivierung von disiLID zu vermeiden.</li>
	<li>Geben Sie 1 μM b-disiLID in die GUVs-Lösung und legen Sie die Probe 30 Minuten lang in die Dunkelheit, wobei Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.</li>
	<li>Eine 18-Well-Glasbodenkammer mit μ Objektträger 10 Minuten lang mit 150 μl BSA-Lösung (3 % w/v in Wasser) vorbehandeln. Entfernen Sie anschließend die BSA-Lösung und waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit 150 μl Reinstwasser.</li>
	<li>Geben Sie 145 μl 200 nM mOrange-Nano in Puffer (10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl) in die Vertiefung.</li>
	<li>Geben Sie anschließend 5 μl mit b-disiLID dekorierte GUVs in die Lösung und warten Sie ~15 Minuten, bis sich die GUVs abgesetzt haben.</li>
	<li>Legen Sie den μ-Objektträger unter das konfokale Mikroskop. Die Probe wird bei 552 nm angeregt, um die mOrange (λex = 557 nm; λem = 576 nm) Fluoreszenz sichtbar zu machen, und bei 638 nm, um DiD (λex = 644 nm; λem = 665 nm) in den GUV-Membranen sichtbar zu machen. Die mOrange-Nano-Rekrutierung wird alle 5,3 s mit blauen Lichtpulsen (488 nm, Intensität 1%) ausgelöst, um unerwünschte Photobleaching-Effekte zu minimieren. HINWEIS: Die Anregungswellenlängen können je nach verwendetem Mikroskoptyp angepasst werden. Andere gängige Anregungswellenlängen, die für Mikroskope verfügbar sind, sind 532 nm oder 561 nm und 633 nm, 647 nm, 639 nm oder 640 nm Laser.</li>
</ol>

Lichtgesteuerte reversible Proteinstrukturierung auf Lipidmembranen

<ol>
	<li>Kretschmer, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+on+membranes+and+its+role+in+bacterial+cell+division.">Pattern formation on membranes and its role in bacterial cell division.</a> Curr Opin Cell Biol. 38, 52-59 (2016).</li><li>Yang, H. W., Collins, S. R., Meyer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+excitable+Cdc42+signals+steer+cells+during+chemotaxis.">Locally excitable Cdc42 signals steer cells during chemotaxis.</a> Nat Cell Biol. 18 (2), 191-201 (2016).</li><li>Caldwell, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optochemical+control+of+protein+localization+and+activity+within+cell-like+compartments.">Optochemical control of protein localization and activity within cell-like compartments.</a> Biochem. 57 (18), 2590-2596 (2018).</li><li>Kennedy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells.">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (1), 112-117 (2015).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).</li><li>Bartelt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+blue+light-switchable+protein+patterns+on+giant+unilamellar+vesicles.">Dynamic blue light-switchable protein patterns on giant unilamellar vesicles.</a> Chem Commun. 54 (8), 948-951 (2018).</li><li>Di Iorio, D., Bergmann, J., Higashi, S. L., Hoffmann, A., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+disordered+tether+to+iLID+improves+photoswitchable+protein+patterning+on+model+membranes.">A disordered tether to iLID improves photoswitchable protein patterning on model membranes.</a> Chem. Commun. 59 (29), 4380-4383 (2023).</li><li>Hartzell, E. J., Terr, J., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+blue+light+inducible+Spytag+system+(BLISS).">Engineering a blue light inducible Spytag system (BLISS).</a> J Am Chem Soc. 143 (23), 8572-8577 (2021).</li><li>Xu, D., Bartelt, S. M., Rasoulinejad, S., Chen, F., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+light+lithography:+a+general+strategy+to+create+active+protein+and+cell+micropatterns.">Green light lithography: a general strategy to create active protein and cell micropatterns.</a> Mater Horiz. 6 (6), 1222-1229 (2019).</li><li>Jia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+printing+of+protein+structures+on+membranes+in+vitro.">Light-induced printing of protein structures on membranes in vitro.</a> Nano Lett. 18 (11), 7133-7140 (2018).</li><li>Di Iorio, D., Verheijden, M. L., vander Vries, E., Jonkheijm, P., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+Multivalent+Binding+of+influenza+hemagglutinin+nanoparticles+at+a+sialoglycan-functionalized+supported+lipid+bilayer.">Weak Multivalent Binding of influenza hemagglutinin nanoparticles at a sialoglycan-functionalized supported lipid bilayer.</a> ACS Nano. 13 (3), 3413-3423 (2019).</li><li>Kasahara, M., Torii, M., Fujita, A., Tainaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMN+binding+and+photochemical+properties+of+plant+putative+photoreceptors+containing+two+LOV+domains,+LOV/LOV+proteins.">FMN binding and photochemical properties of plant putative photoreceptors containing two LOV domains, LOV/LOV proteins.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34765-34772 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben eine Methode zur lokalisierten Rekrutierung von mOrange-Nano-Proteinen auf Modellmembranen, wie z.B. gestützten Lipiddoppelschichten und riesigen unilamellären Vesikel, unter Verwendung des photoschaltbaren Proteins disiLID8 beschrieben. Aspekte, die zur Qualität des Musters beitragen, sind unter anderem die Qualität der Proteine sowie die gute Qualität der SLBs und GUVs.
Um eine gute Proteinqualität nach der Expression und Aufreinigung zu gewährleisten, ist es wichtig, zunächst die photoschaltbaren Eigenschaften von disiLID zu bewerten. Zu diesem Zweck muss die Absorption des FMN-Cofaktors im Dunkeln und nach Blaulichtbeleuchtung gemessen werden. Es wird erwartet, dass die UV-Vis-Spektren von disiLID den charakteristischen Triple-Peak des Cofaktors FMN im Dunkeln zeigen, der bei Blaulichtbeleuchtung deutlich abnimmt und sich im Dunkeln erholt13. Dieses photoschaltbare Verhalten ist entscheidend, um in den folgenden Schritten eine reproduzierbare und reversible Rekrutierung zu erhalten. Die Arbeit mit schützendem rotem Licht und die Exposition von disiLID mit minimaler externer Beleuchtung während der Probenvorbereitung erhöht die Leistung der Experimente.
Ein weiterer kritischer Schritt, und vielleicht der entscheidendste, ist die Bildung geeigneter SLBs. Defekte in den Membranen und/oder die Bildung inhomogener SLBs (d.h. das Vorhandensein von Multilayern oder gepatchten SLBs) beeinträchtigen die Qualität der Proteinstrukturierung. Daher wird unerfahrenen Anwendern empfohlen, das Protokoll zu reproduzieren, indem die SUVs mit einigen Membranfarbstoffen wie DiD und DiO markiert werden, um fluoreszenzmarkierte SLBs zu bilden. Auf diese Weise können die Eigenschaften und die Qualität von SLBs mit der Fluoreszenzmikroskopie gut charakterisiert werden. FRAP-Messungen stellen einen typischen Ansatz zur Beurteilung der Qualität eines SLB dar, indem die Fließfähigkeit der Membranen bewertet wird. Alternativ kann im Falle von biotinylierten SLBs, wie sie in diesem Protokoll beschrieben werden, fluoreszenzmarkiertes SAv (z. B. Atto 488-SAv) verwendet werden, um die Qualität von SLBs sichtbar zu machen und zu bewerten.
Der erste Teil des Protokolls beschreibt die Bildung von Mustern auf SLBs. Um ein optimales Ergebnis zu gewährleisten, ist es wichtig, mOrange-Nano auf die SLBs zu geben und die Probe 15 Minuten lang im Dunkeln inkubieren zu lassen. Bei der Photoaktivierung ist die Auswahl des ROI nicht auf eine bestimmte Größe beschränkt. Allerdings müssen die Laserintensität und die Belichtungszeit reguliert werden, um unerwünschtes Photobleaching der fluoreszierenden Proteine zu reduzieren.
Diese Methode ist nicht auf biotinylierte Proteine beschränkt, und andere Ansätze können verwendet werden, um disiLID an SLBs zu verankern. Zum Beispiel kann His-markiertes disiLID exprimiert und an Ni-NTA-haltigen SLBs verankert werden. Es ist jedoch entscheidend, Nano und disiLID mit unterschiedlichen Tags zu exprimieren, um einen Ersatz der Proteine auf den SLBs zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht es auch, die Reihenfolge der Proteine umzukehren, wodurch SLBs mit Nano funktionalisiert und disiLID (oder disiLID-fusionierte Proteine) bei Blaulichtbeleuchtung rekrutiert werden.
Zur dynamischen Kontrolle der Proteinlokalisation sollte die reversible Lokalisierung des Proteins in die ausgewählte Region wiederholt möglich sein. Um dies zu erreichen, ist die Konzentration von Nano (200 nM) in der Lösung ein kritischer Parameter, um eine hohe Reversibilität zu erreichen.
Ein weiteres Problem ist die Rekrutierung von Nano auf der disiLID-funktionalisierten GUV-Oberfläche. Wie im Fall der Proteinstrukturierung auf SLBs kann diese Methode auf verschiedene Membranfunktionalisierungsstrategien erweitert werden. In diesem Protokoll wurde das gesamte GUV mit blauem Licht beleuchtet, um mOrange-Nano auf der gesamten GUV-Oberfläche zu rekrutieren. Die Selektion kleiner ROIs, die auf der GUV-Membran lokalisiert sind, sollte jedoch zu einer präzisen Lokalisierung von Proteinen in einem engeren Bereich führen.
Diese Methode stellt nur eine Einschränkung dar, die mit der Wahl des Fluorophors zusammenhängt, das für die Abbildung der Nanorekrutierung an der Membran der SUVs oder GUVs verwendet wird. Insbesondere müssen Fluorophore mit einem Anregungsspektrum im Blaulichtbereich vermieden werden, da ihre Verwendung die Photoaktivierung von (dis)iLID stört. Daher wird für diese Art von Experimenten die Wahl von Fluorophoren im Grün- oder Rotlichtbereich (z. B. mOrange oder Cy5) empfohlen.
Das disiLID-Design bietet eine einfache und anpassungsfähige Möglichkeit, die lokale Proteinrekrutierung an Membranen zu verbessern und erweitert den Dynamikbereich von iLID und Nano aus der Optogenetik4. Diese Methoden konzentrieren sich auf die Rekrutierung von Nano auf mimische Membranen wie Lipiddoppelschichten und GUVs. Dennoch ist dieser Ansatz auf die zahlreichen optogenetischen Werkzeuge in Zellen erweiterbar, bei denen (dis)iLID oder Nano an eine Membran gebunden sind.

Die Bildung von Proteinmustern auf Zellmembranen innerhalb subzellulärer Regionen führt zu zahlreichen biologischen Prozessen, einschließlich Migration, Teilung und lokalisierter Zell-zu-Zell-Kommunikation 1,2. Diese Proteinmuster sind räumlich und zeitlich reguliert und hochdynamisch. Die Replikation solcher Proteinmuster in synthetischen Zellen ist unerlässlich, um zelluläre Prozesse, die aus ihnen entstehen, nachzuahmen und um besser zu verstehen, wie eine solche Regulation auf molekularer Ebene funktioniert. Analog zu dem, was für Membranen in lebenden Zellen beobachtet wird, müssen Methoden zur Erzeugung von Proteinmustern auf künstlichen Membranen deren Dynamik erfassen und eine präzise raumzeitliche Kontrolle ermöglichen.
Unter den verschiedenen Reizen zeichnet sich das Licht durch die höchste raumzeitliche Kontrolle und mehrere zusätzliche Vorteile aus3. Durch die Regulierung mit Licht ist es einfach, einen gewünschten Bereich zu jeder gewünschten Zeit mit unübertroffener Präzision zu beleuchten. Darüber hinaus bietet das Licht eine hohe Abstimmbarkeit, da sowohl die Lichtintensität als auch die Impulsdauer eingestellt werden können. Darüber hinaus ist sichtbares Licht für Biomoleküle, einschließlich Proteine, ungefährlich, und es ist sogar möglich, mehrere Funktionalitäten mit unterschiedlichen Wellenlängen zu adressieren. Daher erweisen sich lichtempfindliche Ansätze, die auf sichtbarem Licht basieren, als vielversprechende Wege für die kontrollierte und biorthogonale Regulation von Proteinmustern in Raum und Zeit 4,5,6. Die Verwendung von photoschaltbaren Proteinpaaren aus der Optogenetik, die als lichtinduzierbare Dimerizer wirken, bietet eine einfache Methode zur Rekrutierung spezifischer Proteine für Membranen. Insbesondere wurden Proteinmuster auf künstlichen Membranen erfolgreich unter Verwendung der durch blaues Licht ausgelösten Wechselwirkung zwischen iLID (verbessertes lichtinduzierbares Dimer, basierend auf der photoschaltbaren LOV2-Domäne von Avena sativa) und Nano (Wildtyp-SspB)7,8, dem blaulichtinduzierbaren SpyTag-System (BLISS)9, dem grünlichtresponsiven Proteintetramer CarH10 und der rotlichtinduzierbaren Wechselwirkung zwischen PhyB und PIF611 gebildet.
Es wurde gezeigt, dass die photoschaltbare Wechselwirkung zwischen iLID und Nano5 genutzt werden kann, um Proteine auf Modellmembranen mit blauem Licht zu photostrukturieren7. Die iLID/Nano-Wechselwirkung ist im Dunkeln reversibel, hochspezifisch und funktioniert unter physiologischen Bedingungen. Die Verankerung von iLID an Lipidmembranmodellen, wie z. B. riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) oder gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs), ermöglicht eine lichtregulierte Rekrutierung von Nano an diese Membranen, die im Dunkeln reversibel ist. Insbesondere haben wir beobachtet, dass die Einführung einer ungeordneten Domäne in den N-Terminus von iLID (was zu einem Protein namens disiLID führt) als Bindung an eine Modelllipidmembran die Effizienz der Nanorekrutierung und die Reversionsdynamik verbessert8.
Unter Verwendung der disiLID/Nano-Wechselwirkung haben wir eine Methode entwickelt, mit der sich kontrastreiche Muster von Nano-fusionierten Proteinen (POI) auf SLBs und den externen Membranen von GUVs erzeugen lassen. Diese Methode ermöglicht die Erstellung von Proteinmustern mit bemerkenswerter räumlicher und zeitlicher Auflösung und hoher Reversibilität innerhalb von Minuten. Das detaillierte Protokoll beschreibt den Prozess der lokalen Rekrutierung von Proteinen auf künstlichen Membranen. Konkret wird dies durch die Immobilisierung einer biotinylierten Version von disiLID auf SLBs und GUVs durch die Biotin-Streptavidin (SAv)-Interaktion erreicht. Anschließend wird fluoreszenzmarkiertes Nano (mOrange-Nano) unter Blaulichtbeleuchtung an diese disiLID-funktionalisierten Membranen rekrutiert. Unser experimentelles Protokoll bietet einen unkomplizierten und anpassungsfähigen Ansatz, um eine lokalisierte Proteinrekrutierung an Membranen zu erreichen. Wichtig ist, dass diese Methodik nicht auf die berichteten SLB- und GUV-Grenzflächen oder mOrange-Nano beschränkt ist. Es kann auf andere disiLID-funktionalisierte Materialien und Proteine ausgeweitet werden, die mit Nano fusioniert sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 Well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81817</td>
			<td>For SLB preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#181;L Microliter Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Model 702 N</td>
			<td>For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870273C</td>
			<td>For SUVs preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 (Calcium chloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>For SLB formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips 24 mm x 60 mm</td>
			<td>Engelbrecht</td>
			<td>K12460</td>
			<td>For GUVs formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;- 
			Tetramethylindodicarbocyanine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td>Membrane dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disiLID</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH 
			HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA 
			IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA 
			GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG 
			AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA 
			GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT 
			DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR 
			EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK 
			IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK 
			FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG 
			VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK 
			TAFQIAEAANDENYF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td>For SUVs lipid composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Protein LoBind 
			microcentrifuge tubes</td>
			<td>Merk</td>
			<td>EP0030108116-100EA</td>
			<td>For collecting freshly made GUVs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mOrange-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI 
			WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT 
			GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG 
			DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA 
			EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN 
			GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP 
			PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM 
			FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY 
			ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF 
			LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN 
			KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN 
			YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA 
			GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE 
			GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA 
			KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM 
			SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA 
			LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI 
			EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI 
			IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE 
			GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG 
			PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH 
			PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN 
			FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK 
			VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG 
			WEASSERMYPEDGALKGEIKMR 
			LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV 
			QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE 
			QYERAEGRHSTGGMDELYKGG 
			SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN 
			SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK 
			DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ 
			FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA 
			RENGDGVMFEPEEIYDELNIG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (Sodium chloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>For buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH (Sodium hydroxide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1064980500</td>
			<td>For surface activation in SLB formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC (1-Palmitoyl-2- 
			oleoylphosphatidylcholine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>For GUVs lipid composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-racglycerol))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>For GUVs lipid composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8148940101</td>
			<td>For GUVs formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>TermoFisher</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>84097</td>
			<td>For GUVs formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>For buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic light-induced protein patterns at model membranes

Die präzise Lokalisierung und Aktivierung von Proteinen an der Zellmembran zu einem bestimmten Zeitpunkt führt zu vielen zellulären Prozessen, darunter die Polarisation, Migration und Teilung von Zellen. Daher sind Methoden zur Rekrutierung von Proteinen zur Modellierung von Membranen mit subzellulärer Auflösung und hoher zeitlicher Kontrolle unerlässlich, um solche Prozesse in synthetischen Zellen zu reproduzieren und zu kontrollieren. Hier wird ein Verfahren zur Herstellung lichtregulierter reversibler Proteinmuster an Lipidmembranen mit hoher raumzeitlicher Präzision beschrieben. Zu diesem Zweck immobilisieren wir das photoschaltbare Protein iLID (improved light-inducible dimer) auf gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) und auf der äußeren Membran von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs). Bei lokaler Blaulichtbeleuchtung bindet iLID an seinen Partner Nano (Wildtyp-SspB) und ermöglicht die Rekrutierung eines beliebigen mit Nano fusionierten Proteins (POI) von der Lösung in den beleuchteten Bereich auf der Membran. Diese Bindung ist im Dunkeln reversibel, was eine dynamische Bindung und Freigabe des POI ermöglicht. Insgesamt handelt es sich um eine flexible und vielseitige Methode, um die Lokalisierung von Proteinen mit hoher Präzision in Raum und Zeit mittels blauem Licht zu regulieren.

The formation of protein patterns on cell membranes within subcellular regions gives rise to numerous biological processes, including migration, division, and localized cell-to-cell communication1,2. These protein patterns are regulated in space and time, and are highly dynamic. Replicating such protein patterns in synthetic cells is essential for mimicking cellular processes that arise from them and for gaining a better understanding of how such regulation works at a molecular level. Analogous to what is observed for membranes in living cells, methods for generating protein patterns on artificial membranes must capture their dynamics and provide precise spatiotemporal control.
Among various stimuli, light stands out for providing the highest spatiotemporal control and several additional advantages3. Through regulation with light, it is straightforward to illuminate a desired area at any desired time with unmatched precision. In addition, light provides high tunability as both the light intensity and the pulse durations can be adjusted. Furthermore, visible light is harmless to biomolecules, including proteins, and it is possible to even address multiple functionalities with different wavelengths. Hence, light-responsive approaches based on visible light emerge as promising avenues for the controlled and biorthogonal regulation of protein patterns in space and time4,5,6. Utilizing photoswitchable protein pairs from optogenetics, acting as light-inducible dimerizers, provides a straightforward method for recruiting&#160;specific proteins to membranes. In particular, protein patterns have successfully been formed on artificial membranes using the blue light-triggered interaction between iLID (improved light-inducible dimer, based on the photoswitchable LOV2 domain from&#160;Avena sativa) and Nano (wild-type SspB)7,8, the blue light-inducible SpyTag system (BLISS)9, the green light-responsive&#160;protein tetramer CarH10 and the red light-inducible interaction between PhyB and PIF611.
It has been demonstrated that the photoswitchable interaction between iLID&#160;and Nano5 can be used to photo-pattern proteins on model membranes using blue light7. The iLID/Nano interaction is reversible in the dark, highly specific, and operates under physiological conditions. Anchoring iLID onto lipid membrane models, such as giant unilamellar vesicles (GUVs) or supported lipid bilayers (SLBs), enables light-regulated recruitment of Nano to these membranes, which is reversible in the dark. Notably, we observed that introducing a disordered domain to the N-terminus of iLID (resulting in a protein named disiLID) as a tether to a model lipid membrane enhances Nano recruitment efficiency and reversion dynamics8.
By employing the disiLID/Nano interaction, we have developed a method for generating high contrast patterns of Nano-fused proteins of interest (POI) on SLBs and the external membranes of GUVs. This method allows for the creation of protein patterns with remarkable spatial and temporal resolution and high reversibility within minutes. The detailed protocol outlines the process for locally recruiting proteins onto artificial membranes. Specifically, this is achieved by immobilizing a biotinylated version of disiLID on SLBs and GUVs through the biotin-streptavidin (SAv) interaction. Subsequently, fluorescently labeled Nano (mOrange-Nano) is recruited to these disiLID functionalized membranes under blue light illumination. Our experimental protocol offers a straightforward and adaptable approach for achieving localized protein recruitment to membranes. Importantly, this methodology is not confined to the reported SLB and GUV interfaces or mOrange-Nano; it can be extended to other disiLID-functionalized materials and proteins fused to Nano.

Autor im Rampenlicht: Photoschaltbare Proteinrekrutierung für reversible Musterbildung in künstlichen zellulären Systemen

Dynamische lichtinduzierte Proteinmuster an Modellmembranen

In our work, we aim to reproduce cellular processes in artificial cell-like models that require the precise localization of proteins in a given spot at a certain time. Here, as an example, we demonstrate the formation of dynamic protein patterns on model lipid membranes with high precision and high spatial temporal control using photoswitchable proteins and visible light. One of the current experimental challenge consists of reproducing dynamic protein patterns on model lipid membranes.Here, we need to manipulate these protein patterns fast and reversably with high precision in a biocompatible and non-invasive way. We use photoswitchable proteins to recruit and pattern proteins of interest on supported lipid bilayers and giant unilamellar vesicles. We achieve rapid and localized protein recruitment, and the protein patterning is fully reversible in the dark and can be repeated multiple times.In our protocol, we employ visible light to form protein patterns. Light is an attractive triggers to control interactions with high spatiotemporal resolution and tunability. Light is also not invasive and doesn't damage biomolecules.

Die beschriebenen Verfahren ermöglichen die Bildung von SLBs, um mOrange-Nano auf den synthetischen Membranen zu rekrutieren. Die Bildung von definiertem mOrange-Nano, das auf den mit b-disiLID funktionalisierten SLBs strukturiert ist, ist in Abbildung 1A dargestellt. Wenn eine quadratische (24 μm × 24 μm) Region of Interest (ROI) auf dem SLB mit 488 nm blauem Licht beleuchtet wird, wird ein schneller Anstieg des Fluoreszenzsignals im mOrange-Kanal (rot dargestellt) im ROI innerhalb von 200 s beobachtet. Das Muster zeigt sehr definierte und scharfe Kanten (Abbildung 1B), was auf eine hohe räumliche Kontrolle über den photoaktivierten Bereich hinweist. Die Interaktion ist schnell und vollständig reversibel, da die Beleuchtung mit blauem Licht unterbrochen wird. Diese Methode ermöglicht auch die Bildung von Mustern über mehrere Beleuchtungszyklen (Abbildung 2). Wechselnde Zyklen von ~200 s blauem Licht und 200 s dunklem Licht führen zu einer reversiblen Rekrutierung von mOrange-Nano im ausgewählten Bereich für ein Vielfaches mit vergleichbaren Werten der Δ-Intensität der Fluoreszenz in den Mustern.
Abbildung 3 zeigt die schematische Darstellung der GUVs-Aufbereitung. Die Rekrutierung von mOrange-Nano wird auch auf GUVs beobachtet. Es wird gezeigt, dass GUVs, die im Dunkeln platziert werden, keine mOrange-Fluoreszenz aufweisen (Abbildung 4A). Da die GUVs global mit blauem Licht beleuchtet werden, wird mOrange-Fluoreszenz beobachtet, die mit dem GUV-Membranfarbstoff (DiD) kolokalisiert. Die Wechselwirkung ist hochgradig reversibel, da die Beleuchtung beendet wird. Die Quantifizierung der mOrange-Intensität an der GUV-Membran über die Zeit zeigt die schnelle und effektive Rekrutierung von Proteinen sowie die vollständige Reversibilität (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig01.jpg"> Abbildung 1: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von SLBs, die mit b-disiLID funktionalisiert wurden. Die Fluoreszenzbilder in Gegenwart von mOrange-Nano vor (A) und während (B) lokaler Blaulichtbeleuchtung (488 nm) in der ROI. Maßstabsbalken = 20 μm. (C) Fluoreszenzintensität von mOrange gemessen im ROI für SLBs, die mit b-disiLID funktionalisiert wurden (bei = 200 s). Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig02v3.jpg"> Abbildung 2: Fluoreszenzintensität von mOrange, die im ROI auf SLBs rekrutiert wurde, die mit b-disiLID dekoriert waren, während drei Rekrutierungszyklen. Nach jedem Photoaktivierungsschritt stieg die mOrange-Nano-Fluoreszenz innerhalb des ROI an. Das Muster erreicht die Sättigung innerhalb von 120 s, und die Fluoreszenz nimmt innerhalb von 120 s fast auf Hintergrundniveau ab. Es wird kein Verlust der Musterqualität über verschiedene Blaulicht-/Dunkelzyklen beobachtet. Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig03v2.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der GUVs-Aufbereitung mit der schonenden Hydratationsmethode. Das Schema bietet eine visuelle Darstellung der einzelnen Stufen und der Kammer, die aus zwei Glasrutschen und einem Abstandhalter gebaut wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66531/66531fig04.jpg"> Abbildung 4: Fluoreszenzmikroskopische Messungen der lichtabhängigen Rekrutierung von mOrange-Nano auf GUVs-Membranen. (A) Fluoreszenzbilder eines disiLID-funktionalisierten GUV in Gegenwart von mOrange-Nano. In Grün ist der Membranfarbstoff der GUVs und in Rot die mOrange-Fluoreszenz vor, während und nach der Beleuchtung mit blauem Licht zu sehen. Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Fluoreszenzintensität von mOrange, lokalisiert auf GUV über die Zeit. Bei Beleuchtung erreicht die mOrange-Fluoreszenz (rot dargestellt) auf der Lipidmembran innerhalb von 60 s die maximale Intensität, mit einer 5,9-fachen Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn die Beleuchtung gestoppt wird, sinkt die mOrange-Fluoreszenz innerhalb von 60 s auf fast Vorbeleuchtungswerte (mit einer Wiederfindung von 90 %). Die Abbildung ist eine Adaption von Di Iorio et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66531/66531fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Erzeugung lichtregulierter und reversibler Proteinmuster mit hoher raumzeitlicher Präzision an künstlichen Lipidmembranen beschrieben. Die Methode besteht aus der lokalisierten Photoaktivierung des Proteins iLID (improved light-inducible dimer), das auf Modellmembranen immobilisiert ist und unter blauem Licht an sein Partnerprotein Nano (Wildtyp-SspB) bindet.

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

In unserer Arbeit wollen wir zelluläre Prozesse in künstlichen zellähnlichen Modellen reproduzieren, die die genaue Lokalisierung von Proteinen an einer bestimmten Stelle zu einem bestimmten Zeitpunkt erfordern. Hier zeigen wir beispielhaft die Bildung dynamischer Proteinmuster auf Modelllipidmembranen mit hoher Präzision und hoher räumlicher zeitlicher Kontrolle unter Verwendung von photoschaltbaren Proteinen und sichtbarem Licht. Eine der aktuellen experimentellen Herausforderungen besteht darin, dynamische Proteinmuster auf Modelllipidmembranen zu reproduzieren.Hier gilt es, diese Proteinmuster schnell und reversibel mit hoher Präzision biokompatibel und nicht-invasiv zu manipulieren. Wir verwenden photoschaltbare Proteine, um Proteine von Interesse auf gestützten Lipiddoppelschichten und riesigen unilamellären Vesikeln zu rekrutieren und zu strukturieren. Wir erreichen eine schnelle und lokalisierte Proteinrekrutierung, und die Proteinstrukturierung ist im Dunkeln vollständig reversibel und kann mehrmals wiederholt werden.In unserem Protokoll verwenden wir sichtbares Licht, um Proteinmuster zu bilden. Licht ist ein attraktiver Auslöser zur Steuerung von Wechselwirkungen mit hoher raumzeitlicher Auflösung und Abstimmbarkeit. Licht ist auch nicht invasiv und schädigt die Biomoleküle nicht.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

528 Aufrufe.  University of Münster. In unserer Arbeit wollen wir zelluläre Prozesse in künstlichen zellähnlichen Modellen reproduzieren, die die genaue Lokalisierung von Proteinen an einer bestimmten Stelle zu einem bestimmten Zeitpunkt erfordern. Hier zeigen wir beispielhaft die Bildung dynamischer Proteinmuster auf Modelllipidmembranen mit hoher Präzision und hoher räumlicher zeitlicher Kontrolle unter Verwendung von photoschaltbaren Proteinen und sichtbarem Licht. Eine der aktuellen experimentellen Herausforderungen bes...

Serie: Autor im Rampenlicht: Photoschaltbare Proteinrekrutierung für reversible Musterbildung in künstlichen zellulären Systemen

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).