Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenreduktion, die für erfolgreiche Neutronenspin-Echo-Studien von kollektiven Membranfluktuationen erforderlich sind, die für biologische Funktionen und praktische Anwendungen von Lipidmembranen relevant sind. NSE greift direkt auf die Membrandynamik auf den Nanosekunden-Zeitskalen wichtiger Membranfunktionen zu, mit dem einzigartigen Vorteil der Isotopenempfindlichkeit für die Untersuchung selektiver Membranmerkmale, die mit anderen Techniken nicht zugänglich sind. Untersuchungen der Membrandynamik auf der Nanoskala sind unerlässlich, um die zugrunde liegenden Membraneigenschaften des molekularen Mechanismus und die Membran-Protein-Interaktionen zu verstehen, die an verschiedenen Zellpathologien beteiligt sind.
Die Methode bietet Forschern, die neu bei NSE sind, detaillierte Richtlinien zum Entwerfen, Vorbereiten und Charakterisieren von Lipidvesikeln für erfolgreiche Experimente und die anschließende Datenanalyse und -interpretation. Teshani Kumarage und Julie Nguyen, eine Doktorandin und studentin aus dem Labor, demonstrieren das Verfahren. Bereiten Sie die Lipidsuspension in einer Haube vor, indem Sie genau gewogene Lipide in einem Milliliter Lösungsmittel mit manuellem Mischen auflösen.
Trocknen Sie die Lipidlösung, indem Sie vorsichtig ein Inertgas in die Durchstechflasche strömen lassen, während Sie es langsam in einem Winkel drehen. Um das Restlösungsmittel gründlich zu entfernen, legen Sie die Fläschchen über Nacht in einen Vakuumofen bei 35 Grad Celsius. Am nächsten Tag den Lipidfilm mit zwei Millilitern schwerem Wasser hydratisieren, um eine Lipidkonzentration von 50 Milligramm pro Milliliter zu erhalten, und die hydratisierte Lipidsuspension vortexen, bis der Lipidfilm vollständig aufgelöst ist.
Führen Sie als Nächstes fünf Gefrier-Tau-Zyklen durch, indem Sie die Durchstechflasche mit hydratisierter Lipidsuspension bei minus 80 Grad Celsius aufbewahren, bis sie eingefroren ist. Und dann in ein 35 Grad Celsius heißes Wasserbad übertragen, um die Lipidsuspension aufzutauen. Wirbeln Sie die aufgetaute Suspension bis zur Homogenität, bevor Sie mit dem nächsten Zyklus fortfahren.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, montieren Sie den Extruderaufbau mit einer Polybicarbonatmembran zwischen zwei Membranträgern und fügen Sie zwei Papierfilter auf jeder Seite hinzu, um zusätzliche Unterstützung zu bieten. Verwenden Sie luftdichte Glasspritzen, um die Polycarbonatmembran zu hydratisieren, indem Sie 0,3 Milliliter schweres Wasser mehrmals durch die Membrananordnung geleitet werden. Nach dem Hydratisieren der Membran wird eine ein Milliliter gasdichte Spritze mit einer vorbereiteten milchig-weißen Lipidlösung in ein Ende und eine leere Spritze in das gegenüberliegende Ende der Extruderapparatur eingesetzt.
Sobald die Spritzen angeschlossen sind, legen Sie die Baugruppe in den Extruderblock. Programmieren Sie die Pumpe, indem Sie die Taste Rate gedrückt halten, um die Extrusionsrate einzugeben, und drücken Sie die Durchmessertaste, um den Spritzendurchmesser einzugeben. Drücken Sie dann Zurückziehen, bis das Licht aufleuchtet.
Drücken Sie Start und warten Sie, bis die Probe in die leere Spritze abgegeben wird. Drücken Sie die Stop-Taste, kurz bevor die Probenspritze vollständig leer ist. Nehmen Sie die ausgegebene Lautstärke auf und halten Sie dann die Taste Rate gedrückt, bis Phase eins auf dem Bildschirm angezeigt wird.
Halten Sie die Auszugsanzeige ausgeschaltet, und drücken Sie die Lautstärketaste, um die zuvor aufgezeichnete Lautstärke einzugeben. Drücken Sie erneut die Taste Rate und verwenden Sie den Pfeil nach rechts nach oben, um auf Phase zwei zuzugreifen. Drücken Sie volume, um den gleichen Wert des zuvor aufgezeichneten dosierten Volumens einzugeben.
Drücken Sie in dieser Phase die Taste "Auszahlen", bis die Auszugsanzeige leuchtet. Wiederholen Sie den Zyklus für Phase drei, indem Sie die Lautstärketaste drücken, bis LP:SE auf dem Bildschirm erscheint, und stellen Sie ihn auf 20 ein. Drücken Sie abschließend die Rate-Taste, greifen Sie auf Phase vier zu und drücken Sie die Lautstärketaste, um zur Stop-Funktion zu gelangen, um die Pumpeneinrichtung abzuschließen.
Nachdem die Pumpe programmiert wurde, drücken Sie Start, um den Extrusionszyklus zu starten. Führen Sie 15 bis 20 Extrusionszyklen durch, bevor Sie die transparente opalblau extrudierte Lipidsuspension in einer sauberen Durchstechflasche für Messungen sammeln. Öffnen Sie die DAVE-Software und wählen Sie im Menü Datenreduktion die Option NSE-Daten reduzieren aus.
Laden Sie die Datendateien über verschiedene Q-Werte hoch, indem Sie die Option Echodateien öffnen aus dem Menü Datei verwenden. Die hochgeladenen Dateien werden unter den verfügbaren Datensätzen angezeigt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ausgewählte Datei und beschriften Sie sie entsprechend der Messung, der sie entspricht, z. B. Probe, Zelle oder Auflösung.
Gruppieren Sie auf der Registerkarte Datensatz die Detektorpixel in 2 x 2, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Wenden Sie dieselbe Binning auf alle Dateien von Resolution, Cell und Sample an. Überprüfen Sie die Daten über alle Pixelgruppen und maskieren Sie diejenigen mit schlechten Signalen, indem Sie die End-Taste auf der Tastatur drücken.
Drücken Sie die Eingabetaste, um auf ein Popup-Fenster zuzugreifen, in dem Sie die gleiche Maske auf alle vier Mal anwenden können. Maskierte Pixel werden grün. Stellen Sie sicher, dass die gesammelten Daten in Form eines Echosignals vorliegen.
Beginnen Sie mit dem Anpassen der Auflösungsdatei aus der Liste der hochgeladenen Dateien, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Datei klicken und im Popupmenü "Vorgänge anpassen", "Echoauflösung anpassen" auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Passung der Echosignale angemessene Anpassungsparameter ergibt. Um den Fehler zu überprüfen, der jedem Formstückparameter über den gesamten Detektor zugeordnet ist, wählen Sie Bildoptionen und dann den gewünschten Formstückparameter aus.
Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Detektorbild, um auf ein Popup-Fenster mit einer Fehlerleistenzuordnung zuzugreifen. Wenn die Anpassung über ein bestimmtes Pixel nicht zufriedenstellend ist, passen Sie das Signal über diesem Pixel neu an, indem Sie es auswählen, die Registerkarte Anpassen drücken und dann Pixel anpassen drücken. Geben Sie auf der Registerkarte Formstück neue Startparameter für die Phase und den Zeitraum ein.
Reduzieren Sie die Beispieldatei, indem Sie die entsprechende Datei aus der Liste der hochgeladenen und beschrifteten Dateien auswählen. Überprüfen Sie alle Pixel und maskieren Sie die schlechten wie oben beschrieben. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie Anpassungsvorgänge, Importphasen.
Passen Sie für die Auflösungsdatei die Echosignale wie zuvor beschrieben mit den Werten des Zeitraums unverändert und des aus der Auflösung importierten Echophasenpunkts an. Geben Sie das Strahlzentrum für alle Datendateien ein, indem Sie auf die Registerkarte Allgemein zugreifen und X- und Y-Strahlzentrumswerte eingeben, die aus dem Experiment aufgezeichnet wurden. Sobald die Anpassung abgeschlossen ist, berechnen Sie die normalisierte Zwischenstreufunktion, indem Sie aus der Liste der angepassten Dateien mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Beispieldatei klicken und im Popupmenü I von Q berechnen auswählen.
Geben Sie die erforderlichen Informationen für die Auflösungs- und Zellendateien sowie die Anzahl der Q-Arcs in das Popup-Fenster ein und drücken Sie dann OK, um die Ergebnisse anzuzeigen. Beachten Sie, dass die Daten in Cyan aufgrund von Detektorrandeffekten ein schlechtes Signal zeigen und beim Kompilieren verschiedener Q-Datensätze eliminiert werden sollten. Speichern Sie abschließend die reduzierten Datensätze als ASCII-Dateien und speichern Sie die gesamte Sitzung als DAVE-Projekt im gewünschten Ordner.
In dieser Studie wurden die NSE-Messungen von liposomalen Proben durchgeführt, die mit verschiedenen Deuterationsschemata hergestellt wurden. NSE-Messungen von Membranbiegeschwankungen werden an vollständig kontrastierten Liposomen durchgeführt. Dieses Deuterationsschema führt zu einem großen Streulängenunterschied zwischen dem Membrankern und der deuterierten Flüssigkeitsumgebung, wodurch das Streusignal der liposomalen Membranen signifikant verbessert und die Messstatistik der Biegedynamik verbessert wird.
Andererseits zeigen NSE-Messungen von Membrandickenschwankungen von Liposomen Abweichungen relativ zur Q- zur dritten Abhängigkeit von Biegeschwankungen. Um das Dickenfluktuationssignal zu isolieren, wird das erhaltene Signal durch Q in das Drittel geteilt und die überschüssige Dynamik wird an eine Lorentzsche Funktion in Q angepasst.Diese Methode hängt von qualitativ hochwertigen Daten ab, die mit Proben hoher Konzentrationen und starker Streusignale besser erreichbar sind. Die von NSE untersuchte Dynamik kann synergistisch durch Deuterium-NMR-Relaxometrie und molekulardynamische Simulationen untersucht werden, um zu veranschaulichen, wie molekulare Lipidstrukturen und Packungsmotive die Membranfunktionen beeinflussen.
NSE-Studien an Lipidmembranen werfen ein neues Licht auf die Membranbiophysik, die komplizierten Beziehungen von Membranstruktur und -dynamik und wie sie sich auf Membranfunktionen und Membran-Protein-Interaktionen auswirken.
