Unsere Forschung zielt darauf ab, die Rolle der neutrophilen Untergruppen zu verstehen und zu verstehen, wie sie zur Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen wie Lupus beitragen. Im weiteren Sinne zeigt unsere Arbeit auch die Heterogenität von Neutrophilenpopulationen in der Humanbiologie und wie sich diese aufgrund unterschiedlicher physiologischer Zustände ändern kann. Neue Forschungsergebnisse zeigen, dass die Populationen von Neutrophilen beim Menschen heterogen sind.
Neutrophile werden jedoch weiterhin als einzelne Population untersucht, da es schwierig ist, Subtypen zuverlässig ohne Aktivierung und in ausreichender Menge zu isolieren. Unser Protokoll bietet eine Methode zur unberührten Isolierung und grundlegenden Charakterisierung von neutrophilen Subtypen, um diese Probleme zu überwinden. Neuere Forschungen, wenn auch begrenzt, haben gezeigt, dass neutrophile Subtypen, wie z. B. Neutrophile mit niedriger Dichte, eine Rolle bei veränderten physiologischen Zuständen wie Schwangerschaft und Entzündungen sowie bei Krankheiten wie Tuberkulose, Autoimmunität und Krebs spielen.
Unser Protokoll wird eine reproduzierbare, robuste Erforschung des Beitrags dieser Zellen zur menschlichen Gesundheit und Krankheit ermöglichen. Jetzt, da wir ein getestetes, robustes Protokoll für die Trennung von Neutrophilen niedriger Dichte von Neutrophilen normaler Dichte haben, konzentrieren wir uns auf die Beantwortung grundlegender Fragen darüber, wie sich diese Neutrophilen niedriger Dichte bei entzündlichen Zuständen präsentieren. Wir interessieren uns besonders dafür, wie sich diese von Neutrophilen normaler Dichte in ihrer Zellzahl, ihrem Immunphänotyp, ihrem Immunstoffwechsel und mehr unterscheiden.
Zu Beginn markieren Sie vier konische 50-Milliliter-Röhrchen für isotonische Arbeitslösungen von 100 %81 %70 % und 55 %Geben Sie 27 Milliliter Dichtegradientenmedium in das erste Röhrchen mit der Bezeichnung 100 %Fügen Sie 3 Milliliter 10X PBS hinzu. Messen Sie als Nächstes die erforderlichen Volumina an isotonischen 100%-Arbeitslösungen und 1X PBS für jede Konzentration der Arbeitslösungen. Geben Sie es in die entsprechenden konischen Röhrchen.
Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um gründlich zu mischen, um eine Homogenität zu gewährleisten. Schichten Sie nun vorsichtig 3 Milliliter der isotonischen 81%igen Arbeitslösung auf den Boden eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens. Schichten Sie dann langsam und vorsichtig 3 Milliliter der isotonischen 70%-Arbeitslösung darauf und achten Sie darauf, dass sich die Schichten nicht vermischen.
Zur Herstellung des Zelltrennungspuffers werden 2 % fötales Rinderserum, 1 Millimol EDTA und PBS zu einem Gesamtvolumen von 500 Millilitern kombiniert. Pipette pipettieren, um sie gründlich zu mischen, um eine Gleichmäßigkeit zu gewährleisten. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen 30 Sekunden lang gründlich ein, um sicherzustellen, dass sie vor der Verwendung vollständig resuspendiert sind.
Für jeden Spender aliquotieren Sie 4 Milliliter Vollblut in drei separate 14-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden. Pipettieren Sie 200 Mikroliter Neutrophilen-Isolationscocktail und 200 Mikroliter magnetische Kügelchen in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig, um die Mischung vor der Inkubation zu resuspendieren, damit die Reagenzien an unerwünschte Zellen binden können.
Geben Sie dann den Zelltrennpuffer in jedes Röhrchen, um das Volumen auf 12 Milliliter zu erhöhen, und mischen Sie gut. Legen Sie die Röhrchen ohne Deckel auf ein Magnetgestell und inkubieren Sie. Verwenden Sie nun eine serologische Pipette, um die klare Zellsuspension mit den Neutrophilen aus jedem Röhrchen vorsichtig in ein neues, sauberes Röhrchen zu übertragen.
Entfernen Sie dann das Originalrohr vom Magneten. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen erneut für 30 Sekunden ein. Geben Sie 200 Mikroliter der magnetischen Kügelchen in die neu übertragene Zellsuspension, bevor Sie sie resuspendieren und inkubieren, wie zuvor gezeigt.
Setzen Sie die Röhrchen ohne Deckel wieder auf den Magneten. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Klarzellsuspension mit den isolierten Neutrophilen in ein neues Röhrchen überführt. Ziehen Sie die isolierten neutrophilen Suspensionen, die aus Vollblut gewonnen wurden, in ein einzelnes 50-Milliliter-Röhrchen.
Füllen Sie das Röhrchen mit dem Zelltrennpuffer auf ein Gesamtvolumen von 50 Millilitern auf. Zentrifugieren Sie mit eingeschaltetem Break, verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das neutrophile Pellet in 1 Milliliter Zelltrennpuffer. Nachdem Sie die Suspension erneut zentrifugiert haben, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das neutrophile Pellet in 3 Millilitern des Gradientenmediums mit 55 % Dichte.
Schichten Sie die 3 Milliliter des 55%igen Dichtegradientenmediums, das die Zellsuspension enthält, langsam auf die vorgefertigten Dichtegradientenröhrchen, um eine Störung des Gradienten zu vermeiden. Die Röhrchen werden 30 Minuten lang bei 720 g zentrifugiert, ohne die Pause zu verwenden. Behandeln Sie die Röhrchen nach dem Zentrifugieren vorsichtig, um eine Störung der Schichten zu vermeiden.
Isolieren Sie mit einer Transferpipette vorsichtig die separaten Schichten, die Neutrophile mit niedriger und normaler Dichte enthalten, und übertragen Sie sie in separate markierte 15-Milliliter-Röhrchen. Um das restliche Dichtegradientenmedium abzuwaschen, geben Sie PBS zu jedem 15-Milliliter-Röhrchen bis zur 15-Milliliter-Marke. Anschließend bei 400 g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, wobei die Pause eingeschaltet ist.
Zählen Sie die Zellen in jeder Fraktion auf einem Hämozytometer, bevor Sie weitere Experimente durchführen. Die Schichtung der Gesamtneutrophilen über das Dichtegradientenmedium führte zur erfolgreichen Bildung von zwei unterschiedlichen Banden. Dabei bilden die Neutrophilen mit niedriger Dichte ein oberes Band und die Neutrophilen mit normaler Dichte ein unteres Band.
Die Überlastung des Dichtegradientenmediums mit Neutrophilen über 5-6 Millionen Zellen pro Milliliter führte dazu, dass die Banden diffus erschienen, was das Risiko einer Vermischung des Subtyps erhöhte. Die durchschnittliche Isolationsreinheit betrug 93,8 % für Neutrophile niedriger Dichte und 96,3 % für Neutrophile mit normaler Dichte mit minimaler Kontamination durch andere Zelltypen.
