Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) unterstützt, um KT

Ein. Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut <ol><li> Planen EDTA-Puffer PBS-5 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung zu 95 ml Spülpuffer (1:20 Verdünnung). Degas der Puffer und halten Sie die Puffer auf Eis. WICHTIG: Failure zu entgasen kann der Puffer in weniger als optimale Ergebnisse führen bei der Isolierung von CD19 + B-Zellen, weil Blasen können die Isolation Spalte zu blockieren. </li><li> Planen 50 ml konischen Röhrchen für Dichtegradientenzentrifugation. Bestimmen Sie die Anzahl von Rohren für die Verarbeitung der Nabelschnurblut benötigt (1 Rohr 8 ml Blut verarbeiten) und 15 ml Ficoll-Paque PLUS in jedes Röhrchen. </li><li> 8 ml von Nabelschnurblut mit 24 ml DPBS (1X) und sorgfältig Schicht das verwässerte Nabelschnurblut Mischung auf der Oberseite des Ficoll-Paque PLUS in jedem der 50 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie nicht das Blut und Ficoll-Paque PLUS. WICHTIG: Zur Vermeidung von Vermischung der Nabelschnurblut und Ficoll-Paque PLUS, halten den Schlauch in einem 45 Grad-Winkel undSchicht die Blut-Gemisch langsam. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 40 min bei 20 ° C. Mononukleäre Zellen (MNC) werden zu verbleiben die Plasma-Ficoll-Paque PLUS Schnittstelle Erwägung Granulozyten und Erythrozyten sedimentieren aufgrund höherer Dichte an der osmotische Druck von Ficoll-Paque PLUS. Label sieben 5 ml Rundboden-Röhrchen, die in Teil 3 mit dem Proben-ID, Datum und wie folgt verwendet werden: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tube </td><td> Etikett </td><td> Zweck </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Unbefleckt </td><td> Ungefärbte Zellen zur Normalisierung während der Durchflusszytometrie </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Um Lebensfähigkeit während der Durchflusszytometrie bestimmt </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Enthält die Zellen, die sortiert werden </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Um CD34 + / CD19 sammeln +(Ende Pro-B - frühe Pre-BI-Zellen) </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 niedriger </td><td> / CD19 + / CD45 niedrig (pre-BI)-Zellen - zu CD34 sammeln </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> / CD19 + / CD45 med (pre-BII) Zellen - Um CD34 sammeln </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 hoch </td><td> / CD19 + / CD45 hoch (unreifen B-Zellen) - Um CD34 sammeln </td></tr></tbody></table> Coat Rohre 4, 5, 6 und 7 mit 2% FBS und legen Sie alle Röhrchen auf Eis. <ol start="5"><li> Saugen Sie die obere Plasmaschicht vorsichtig und vermeiden Sie Kontakt mit der mononukleären Zellschicht. Mit einem 10 ml Glas-Pipette vorsichtig die mononukleären Zellschicht auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Vereinen die mononukleären Zellen aus drei Rohren in einem einzigen 50-ml-Röhrchen. </li><li> Das Rohr wird mit PBS, vorsichtig mischen und bei 300 × g zentrifugiert 10 min bei20 ° C. Saugen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Wiederholen 1x. Nach dem ersten Waschen, resuspendieren Pellets und Transfer zu einem einzigen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Gently Zellpellet in 200 ul PBS. Entfernen 1 ul der Zellsuspension, fügen Sie es zu 1 ml PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und beiseite stellen für die Zählung (Anzahl Zellen nach dem Aufsetzen des 50 ml Zellsuspension in der Zentrifuge). Das Rohr wird mit PBS und Zentrifugieren bei 200 xg für 15 min, um Blutplättchen zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand vollständig ohne die Zellpellet. </li></ol> 2. Geändert B-Zell-Isolierung von mononukleären Zellen mittels MACS-Separation <ol><li> Das Pellet aus Schritt 1,7 mit 160 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. </li><li> Fügen Sie 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail. Pipettieren gut mischen und inkubieren für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen (Zell-number in Schritt 1.7) ermittelt und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min. Überstand komplett und dann das Zellpellet in 320 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. </li><li> Fügen Sie 80 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln, gut mischen und inkubieren für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Resuspendieren bis zu 100 Millionen Zellen in 500 &amp;mgr; l kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. Maßstab Puffervolumen nach Zellzahl. </li><li> Bereiten MACS Säulen und MACS Separatoren während der Zentrifugation (Schritt 2,5). Ein LS Spalte im Magnetfeld der MACS Separator, 3 ml kaltem (4 ° C) PBS-EDTA-Puffer auf die Säule gegeben und der Puffer durch die Säule tropfen. Verwenden Sie ein Gefäß, um den Durchfluss durch fangen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Legen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen unter der Spalte und Pipette die Zellsuspension auf die Säule. Lassen Sie die unmarkierte Zellen throug tropfth der Säule und in der 50 ml konischen Röhrchen. WICHTIG: Dies sind die Zellen, die für die Antikörper-Kennzeichnung und Zellsortierung verwendet werden. Nicht wegwerfen durchfließen. Um mit der Zellen aus Schritt 2.5 erholen, eine zusätzliche 1 ml kaltem (4 ° C) PBS-Puffer-EDTA zu den Wänden des konischen Rohrs. Vorsichtig mischen und pipettieren das restliche Zellsuspension auf die Säule. Wiederholen 1x. Verfahren bis 2,8 Schritt unter Verwendung der unmarkierten Zellen in der konischen Rohr nach Passieren der Kolonne gesammelt. </li><li> Füllen Sie das konische Röhrchen mit unmarkierten Zellen mit PBS und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Fügen Sie 200 ul EDTA-PBS-Puffer und sanft die Zellen resuspendieren. </li></ol> 3. Antibody Labeling und Vorbereitung für die Cell Sorting <ol><li> Absaugen 1 ul der Zellsuspension und Ort in das Rohr mit der Aufschrift &quot;ungefärbt&quot; (Schritt 1,4). Fügen Sie 500 ul EDTA-PBS-Puffer und speichern Sie die Röhrchen auf Eis. </li><li> Hinzufügen 20ul jeder Antikörper (CD19, CD34 und CD45) pro Millionen Zellen in den verbleibenden Zellsuspension. Gut mischen und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln für 30 min bei RT. CD-Antikörper sind lichtempfindlich, Schritte 2-4 mit die Lichter ausgeschaltet. </li><li> Nach 30 min Inkubation mit Antikörpern, absaugen 40 ul der Zellsuspension und legen Sie sie in das Rohr mit der Aufschrift &quot;7AAD&quot;. 1 ml PBS in die Röhre und Zentrifuge bei 500 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 100 ul Bindungspuffer. Hinzufügen 7 ul 7AAD (7-Aminoactinomycin D) und inkubieren im Dunkeln für 10 min bei RT. Während der 10-minütigen Inkubation komplette Schritt 3,4. </li><li> Hinzufügen PBS auf dem oberen Ende des Rohres mit den verbleibenden Zellen mit CD-Antikörper markiert ist. Zentrifugieren bei 500 xg für 3 min. Entfernen Sie den Überstand, 500 ul EDTA-PBS-Puffer und das Zellpellet. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension in das Rohr mit einem &quot;+ + +&quot;. Um alle der Zellsuspension einer erholendd zusätzlich 1 ml EDTA-PBS Puffer zu der 50 ml konischen Röhrchen und Transfer in das Rohr mit einem &quot;+ + +&quot;. </li><li> Nach der Inkubation (Schritt 3,3), fügen Sie 300 ul Bindungspuffer in 7AAD Röhre. Die &quot;ungefärbt&quot;, &quot;7AAD&quot; und &quot;+ + +&quot;-Proben und die &quot;34 +&quot;, &quot;45 low&quot;, &quot;45 med&quot; und &quot;45 hoch&quot; Röhren sind bereit für die Durchflusszytometrie. </li></ol> 4. Cell Sorting Mit dem MoFlo XDP Durchflusszytometer <ol><li> Set-up MoFlo für die Sortierung: Richten Laser; stabilisieren Tröpfchenstroms; bestimmen Drop Verzögerung. </li><li> Bereiten einzigen Farbkompensation Kontrollen mit Invitrogen AbC Maus bead Kit (oder ähnlich) nach den Anweisungen des Herstellers. Führen einzigen Farbe steuert, Einstellen der Spannungen von Fluoreszenz-Kanäle für eine optimale Trennung von positiven und negativen Populationen. Set Kompensationskoeffizienten und gelten ausgeglichen Parameter collection Protokoll. Wiederherstellung der Kompensationskoeffizienten bei jeder neuen Menge von Antikörper erhalten wird. </li><li> Neues Protokoll einschließlich Grundstücke wie in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Führen ungefärbten Probe eingestellt Spannung und Gewinn für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht und identifizieren negativen Fluoreszenz-Populationen. Da DNA-Gewinnung ist das Ziel von der Art, sollte die Schwelle niedrig eingestellt (≤ 1%), so dass DNA-haltigen Ablagerungen verunreinigt nicht die wiederhergestellten Proben. * Stellen Sie sicher, dass die Aerosol Evacuation System ist zu allen Zeiten die menschliche Zellen sind auf dem MoFlo laufen leben läuft. </li><li> Führen Sie einen kleinen Aliquot der + + + Probe (~ 50.000 Veranstaltungen), um die Gating-Strategie (Abbildung 2). Da B-Vorläuferzellen nicht streuen identisch mit B-Zellen reifen, Backgate die ungated CD19 + / CD34 +-Population auf den SSC vs FSC Grundstück, um sicherzustellen, die Lymphozyten-Gate potenzielle Pro-B-Zellen. Aus dieser Probe auch den negativen Fluoreszenz Bevölkerung 7AAD. </li><li> Führen Sie das 7AAD Probe zu Probe Lebensfähigkeit zu bestimmen. Einzige Art von Zellen aus einer Probe mit hoher Lebensfähigkeit bei derBeginn (≥ 95%) als tote Zellen werden wahllos Flecken und kann sort Populationen verunreinigen. </li><li> Richten Sie sort Entscheidungen vier Populationen zu sammeln: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 niedrig; CD19 + / CD34 - / CD45 med und CD19 + / CD34 - / CD45 hoch. Fügen Sie die Lymphozyten und Wams Diskriminierung Tore in den sort Entscheidungen aller Bevölkerungsgruppen. </li><li> Um Verstopfungen in der Sortieranlage Spitze zu vermeiden, Filter + + + Probe durch eine 40 um Zellsieb unmittelbar vor Sortier-und re-Filter, wenn eine Aggregation auftritt Probe während sort. </li><li> Sortieren der Zellen in Sammelröhrchen (Schritt 1.4) mit 2% FBS in PBS in einem gekühlten oder Eis gepackten Rohrhalters beschichtet. </li><li> Unmittelbar nach Art abgeschlossen ist, extrahieren DNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+(TDMs)+with+differential+gene+expression.">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li><li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells.">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis.">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li><li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow.">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development.">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li><li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow.">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li><li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature?.">Are cord blood B cells functionally mature?.</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li><li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci.">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li><li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children.">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li><li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression.">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li><li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis.">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li><li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).</li><li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Faktor mit dem größten Einfluss auf den Erfolg des Protokolls ist die Anwesenheit von kontaminierenden Verunreinigungen. Wenn Blut von einem anfordernden Nabelschnurblutbank ist es wichtig, dass das Blut versendet sobald nach der Entnahme wie möglich. Darüber hinaus enthalten Proben, die als Lymphozytose klassifiziert sind höhere Anzahl von Lymphozyten, aber diese Proben nicht über ausreichende Zahl von Vorläufer-B-Zellen und sollten nicht verwendet werden. Um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens ausreichende Anzahl von Zellen für jeden der Vorläufer Teilmengen empfiehlt beginnend mit mindestens 85 ml Nabelschnurblut erhöhen. Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zu erwachsenen peripheren Blut Trennungen, wenn Fraktionieren Nabelschnurblut mononukleäre die Schicht oft mit roten Blutzellen 12 kontaminiert. Dieses Protokoll enthält eine zusätzliche Waschschritt zu verunreinigen Thrombozyten zu entfernen. Protokolle beschreiben mononukleären Trennungen aus Nabelschnurblut schlagen einschließlich einer Lyseschritt to Entfernen unerwünschter roten Blutkörperchen. Wir empfehlen nicht diesen Schritt, weil es verunreinigt Schutt produziert und hat einen negativen Einfluss auf den Erfolg der Zelle sort. Um die Anzahl der Zellen, die durch Flusszytometrie unterschieden werden müssen reduzieren, ist es notwendig, eine B-Zell-Anreicherung vor Zellsortierung durchzuführen. Das Protokoll, das von Miltenyi Biotec, die den B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) begleitet, vorgesehen ist für peripheren Blut optimiert und empfiehlt die Verwendung von 10 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 Millionen Zellen. Dieser Schritt verwendet Antikörper gegen CD2 (T-Zellen; NK-Zellen), CD4 (T-Zellen), CD11b (Granulozyten; Monozyten; Makrophagen), CD16 (NK-Zellen; Makrophagen; Mastzellen), CD36 (Thrombozyten), CD235a (erythroide Zellen) Nicht-B-Zellen aus dem Nabelschnurblut erschöpfen. Es ist wichtig, um den Bausatz beschrieben und nicht die B-Zell-Isolierungs-Kit II zu verwenden, weil der frühere Kit enthält einen Antikörper gegen CD43, die am vorliegenden Pro-B-Zellen ist. Während unserer opmierung des Protokolls, fanden wir, dass insgesamt 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail ausreicht, um eine positive Zelle Sortierungsergebnis erzeugen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mit so wenig wie 5 ul mehrere der B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail negativen Auswirkungen auf die Zellen sortiert. Daher empfehlen wir mit 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail für insgesamt mononukleären Zellen Zahlen zwischen 175 bis 250.000.000. Wenn ausgehend von niedrigeren oder höheren Anzahl von Zellen kann es erforderlich sein, um die Reagenzien entsprechend skalieren. Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die kollidierenden Marker, die verwendet werden, um zu unterscheiden Subpopulationen von B-Zellen kann. Die meisten der Diskrepanz kann durch die Tatsache, dass die Differenzierung ein kontinuierlicher Prozess ist und dass das Vorhandensein oder Fehlen von Zelloberflächenmarkern tritt in allmählicher Weise anstatt in einer alles oder nichts Weise erläutert. In diesem Protokoll CD34 - / CD19 + und die Intensitätsstufe der CD45 + (niedrig, mittel, hoch) wurde verwendet, um die Expression Pre-BI, BII pre-und unreife B-Zellen, die mit einer Erhöhung der Höhe der CD45-Expression, die dem Fortschreiten der Differenzierung 6 unterscheiden. Pro-B-Zellen wurden von einigen beschrieben worden CD19 sein + / CD34 + 13, während andere haben gezeigt, dass Pro-B-Zellen CD19 sind - / CD34 + und Pre-BI-Zellen sind CD19 + / CD34 + 9,10. Basierend auf dieser Diskrepanzen haben wir die CD19 + / CD34 +-Zellen so spät Pro-B-Zellen / frühen Pre-BI-Zellen bezeichnet. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Strategie entwickelt wurde, um Untergruppen von Vorläufer-B-Zellen, die zu den Zellen von der Krankheit betroffen akuter lymphatischer Leukämie entsprechen isolieren. Es gibt jedoch mehrere Sortieranlagen Strategien, die eingesetzt je nach Zellentyp Subtyp von Interesse sein kann. Antikörper-Fluorochrom Kombinationen sollte basierend auf den Fähigkeiten des Zellsorters ausgewählt werden. Als Gattungenl Regel der hellste Fluorochrom in Ihrem Panel sollte verwendet werden, um die am wenigsten bevölkerten Antigen und vice versa zu kennzeichnen. In Erkennen Doppel-gefärbten Populationen, insbesondere seltene Ereignisse wie diese, ist Dublett Diskriminierung (2B) ein ganz wichtiger Teil der Gating-Strategie. Dadurch wird sichergestellt, dass die Doppel-positiven Ereignisse sind wirklich einzelne Zellen mit beiden Antikörpern und nicht nur zwei Einzel-gefärbten Zellen eingehalten miteinander gefärbt. Hohe Geschwindigkeit, 4-Wege-cell sorting zwangsläufig schafft eine kontrollierte Aerosol Umwelt. Daher sollte lebenden menschlichen Zellsortierung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Veröffentlicht Sicherheit und Dekontamination Richtlinien sind verfügbar und sollten überprüft und vor der Sortierung 14 umgesetzt werden. Genehmigung von Institutional Biosafety Ausschüsse oder deren Äquivalente können vor der Sortierung erforderlich. Für eine ordnungsgemäße Dekontamination nach dem Sortieren sollte Bleichmittel zum Abfallbehälter zu einer Endkonzentration von 10% zugesetzt werden. Similarly, sollten alle Proben Schlauch sowie alle Flächen in der unmittelbaren Umgebung gründlich mit einem frisch zubereiteten 10% Bleichlösung dekontaminiert werden. Zusammengefasst stellt das Protokoll eine Strategie zum Erhalt seltener Populationen von Vorläufer B-Zellen und kann modifiziert werden, um jegliche seltenen Population in Nabelschnurblut einschließlich hämatopoetischen Stammzellen und unreifen T-Zellen zu isolieren. Kürzlich wurden unreife B-Zellen im peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittener HIV 15 identifiziert. Daher erstreckt sich die Nützlichkeit dieser Methode jenseits der Studie von Blutkrebs. Schließlich haben wir noch nicht RNA Isolationen auf die Fließeigenschaften sortierten Zellen durchgeführt, aber diese Methode sollte anpassungsfähig sein, mit dem Vorbehalt, dass während Zellsortierung die Zellen direkt sollte in Trizol oder einer gleichwertigen RNA kompatible Lösung wie RLT sortiert werden aus dem RNeasy Kit verfügbar über Qiagen.

Um Aberrationen, die in Krankheit zu identifizieren, ist es äußerst wichtig, dass wir gesunde Gewebe oder Zellen, die Gewebe oder Zelltyp von der Krankheit betroffen entsprechen verwenden. Ein Grund dafür ist, dass epigenetische Variation unter Gewebetypen verantwortlich ist für die Regulation der Genexpression und ist entscheidend für die Zelldifferenzierung während der normalen menschlichen Entwicklung 1,2. Ein zweiter Grund ist, dass aberrante gewebespezifischen Genregulation kann fatale Folgen auf normale Entwicklung haben und ist dafür bekannt, zu einer Vielzahl von Krankheitszuständen wie Krebs beitragen. Daher erfordert ein besseres Verständnis einer Krankheit, die hämatopoietische Zellen umfasst Kenntnisse gesunden hämatopoetischen Zellen. Die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark verläuft durch systematische Abfolge von Ereignissen durch Veränderungen in der Expression von Zelloberflächen dadurch Marker 3. Studien mit erwachsenen Teilnehmergezeigt, dass Knochenmark enthält gewöhnlich eine geringe Anzahl von Vorläufer-B-Zellen 4,5; Erwägung pädiatrischen Studien mit Teilnehmern haben gezeigt, dass der Anteil der Vorläufer-B-Zellen in relativ hoher Individuen weniger als 5 Jahren 6 ist. Nabelschnurblut wurde als Quelle von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung von Blut-verwandten Erkrankungen und malignen Erkrankungen verwendet werden, ist leicht erhältlich über Nabelschnurblutbanken und ist für unreifen B-Zellen und T 7, die die Zielzellen mehrerer Störungen, einschließlich Leukämie und sind angereichert Lymphome. Vorläufer-B-Zellen im Knochenmark wurden ausgiebig 8,9 phänotypisiert und kann durch die Anwesenheit von spezifischen Zelloberflächen-Marker, die verwendet werden, diese Zellen in verschiedene Teilmengen sortiert werden können definiert werden. Normale B-Zell-Differenzierung verläuft über eine Reihe von Stufen im Knochenmark beginnend mit den frühesten Pro-B-Zellen und ihren Höhepunkt in unreifen oder naive B-Zellen. Nachvan Zelm und Kollegen 10 sind Pro-B-Zellen durch die Anwesenheit von CD34 und im Übergangsbereich zu Stufe 2 (Pre-BI) CD19 erfasst ist. Stage 3 (Pre-BII) Zellen nicht mehr CD34 und beginnen zu zytoplasmatische IgM auszudrücken. Schließlich ist ein bestimmendes Merkmal der Stufe 4 (unreifen B-Zellen) die Expression von Oberflächen-IgM. Die Sortiervorrichtung Strategie in diesem Protokoll beschrieben wurde zuerst von Caldwell und Kollegen 6 beschrieben und umfasst die Verwendung von nur 3 Zelloberflächenmarker das reduziert die Komplexität und die Kosten des Durchführens Zellsortierung Experimenten. In ihrer Arbeit wurde eine Beziehung zwischen CD45 und die Stufen des B-Zell-Differenzierung etabliert. Sie beobachteten, dass B-Zellen im Knochenmark variablen Niveaus der Expression von CD45 zeigen. Insbesondere Zellen, die hohe Spiegel von CD45 exprimiert zu Zellen, die Oberflächen-IgM exprimiert (unreifen B-Zellen) entsprach, entsprachen denen, die ein mittleres Niveau der CD45 exprimiert, um Zellen zu cytopl exprimiertasmic IgM (pre-BII Zellen), und diejenigen, die geringe Mengen an CD45 exprimiert entsprach Zellen, die nicht exprimieren hat cytoplasmatischen IgM (Prä-BI-Zellen). Dieses Protokoll verwendet die Strategie von Caldwell und Kollegen entwickelt, um sechs Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut (Abbildung 1), die in nachgeschalteten Assays erfordern hochwertige Nukleinsäuren wie der methylierten CpG-Insel Rückgewinnung Assay verwendet werden kann (MIRA isolieren ) 11 und quantitative Echtzeit-PCR-Assays. Das Verfahren eine anfängliche Trennung unter Verwendung von Magnetkügelchen, alle nicht-B-Zellen aus Nabelschnurblut abzureichern und erfordert Färbung mit nur drei Antikörper (CD34, CD19 und CD45). Die Zellen, die gewonnen werden repräsentieren 4 Stufen von B-Zell-Differenzierung: 1) CD34 +; CD19 + (späten Pro-B und frühen Pre-BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 niedrig (späte pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), und 4) CD34 -; CD19 +; CD45 hoch (unreifen B-Zellen).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

Nabelschnurblut ist sehr für hämatopoetischen Vorläuferzellen in verschiedenen Linie Engagement Stufen bereichert. Wir haben ein Protokoll zur Isolierung Vorläufer-B-Zellen in vier verschiedenen Stadien der Differenzierung entwickelt. Da Gene exprimiert werden und epigenetische Modifikationen auftreten in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise ist es wichtig, zwischen Geweben und Zelltypen unterscheiden, um der Lage sein, Veränderungen im Genom und Epigenom, die zur Entwicklung der Krankheit führen, zu identifizieren. Dieses Verfahren kann auf jede Art von Zelle im vorliegenden Nabelschnurblut in jedem Stadium der Differenzierung angepasst werden. Dieses Verfahren umfasst 4 wichtigsten Schritte. Zuerst werden mononukleäre Zellen durch Dichtezentrifugation getrennt. Zweitens werden B-Zellen angereichert mit Biotin konjugierten Antikörper, erkennen und Entfernung von Nicht-B-Zellen aus den mononukleären Zellen. Drittens werden die B-Zellen werden mit fluoreszent Zelloberflächenprotein spezifische Antikörper markiert einzelnen Stufenvon B-Zell-Entwicklung. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Zellen sortiert und einzelne Populationen werden zurückgewonnen. Die gewonnenen Zellen werden in ausreichender Menge und Qualität in nachgelagerten Nukleinsäureassays genutzt werden.

Zwischen Probe Variation spielt eine Rolle für den Erfolg der Zelle sort (Tabelle 1). Die Proben mit gutem Erfolg Raten haben niedrige verunreinigenden Ablagerungen (3A) und die Proben mit schlechter Erfolgsraten haben hohe verunreinigenden Ablagerungen (Abbildung 3B). Zwischen Probe Variation kann etwas gesteuert werden, wenn das Kabel Blutprobe in 24 hr des Versandes (O / N ersten Priorität) gesammelt wurde. Die Fließeigenschaften sortierten Zellen aus jeder Vorläufer-B-Zell-Untergruppe sind in ausreichender Menge und Qualität zur Nukleinsäure-Isolation führen. Die isolierte DNA ist von hoher Qualität und kann in nachfolgenden Analysen verwendet werden. Wir nutzen diesen routinemäßig DNA in 11 bis MIRA für methylierte DNA (Abbildung 4) anzureichern. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cord Blood Facility Data </td><td> Schlechte Sortieren </td><td><strong&gt; Good Sortieren </td></tr><tr><td> Arbeiten Blood Volume mit Gerinnungshemmer (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> White Blood Cells [10 3 / ul] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Lymphozyten [10 3 / ul] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Lymphozyten (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Red Blood Cells [10 6 / ul] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house-Daten </td></tr><tr><td> Cell Number nach Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Cell Number nach MACS Separation </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Total Events Count (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Lebensfähigkeit (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Zellen in Lymphozyten Gate (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 niedriger </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 hohen </td></tr><tr><td> Gesamtzellzahl </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Der insgesamt Events </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Leistungsfähigkeit </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Repräsentativen Zelle sort Statistiken. Zeilen 1-5 sind Zählungen durch das Nabelschnurblut Anlage vorgesehen. Die restlichen Zeilen sind die Daten in unserem Labor gesammelt. Die arme Art enthaltenen hohen Schutt und einen geringen Prozentsatz an Zellen in der Lymphozyten-Gate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> FiguRE 1. Ablaufschema des Verfahrens. Nabelschnurblut verarbeitet und mononukleären Zellen isoliert mit Ficoll-paque plus. Ein zusätzlicher Waschschritt enthalten ist, um kontaminierende Thrombozyten zu entfernen. B-Zellen aus mononukleären Zellen mit dem MACS menschlichen B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) isoliert. Dieser Schritt verwendet Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörper (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE und CD235a), um alle nicht-B-Zellen zu entfernen. Die gewonnenen B-Zellen mit CD19-APC, CD34-PE und CD45-FITC Antikörper dann sortiert Verwendung des MoFlo XDP Durchflußzytometer zum Vorläufer-B-Zell-Untergruppen erholen gekennzeichnet: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 günstig , CD19 + / CD34 - / CD45 med und CD19 + / CD34 - / CD45 hoch. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Abbildung 2. Gating Strategie zur Identifizierung und Sortierung populations. Rote Pfeile zeigen das Tor, um nachfolgende Diagramm angewendet wird. R4, R5, R6 und R7 Toren geben sortierten Populationen. A) Vorwärts vs Seite Streudiagramm zeigt angereicherten Lymphozyten-Population. R1, Lymphozyten Tor. B) Höhe vs Breite von vorn Streudiagramm zur Identifizierung einzelner Zellen im Vergleich zu Dubletten. R2, einzelne Zelle Tor. C) CD19-APC-positiven Zellen fallen in CD34-PE negativen und positiven Populationen. R3, CD19 + / CD34 - Tor; R4, CD19 + / CD34 +-Gate zeigt gewünschte Sortierung Bevölkerung d) CD19 + / CD34 - Zellen fallen in drei etwas unterschiedliche CD45-FITC Populationen.. R5 und R6, CD19 + / CD34 - / CD45 und CD19 niedrig + / CD34 - / CD45 med. Populationen sind. R7, wegen hoher Zellzahlen im CD19 + / CD34 - / CD45 hohe Population umfasst diese Art nur Gateein Teil der Bevölkerung. Alle Zellen dieser Population müssen nicht für Downstream-Analysen gesammelt werden. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Abbildung 3. A) Niedrige Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung. R1, Lymphozyten Tor. B) Hohe Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Abbildung 4. Anreicherung von methylierter DNA von Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen. A) beschallt DNA aus Vorläufer-B-Zell-Untergruppen getrennt ist von hoher Qualität. Für DNA-Bibliothek-Konstruktion wird auf eine mittlere von 200-600 bp beschallt. Spur 1: Promega 100 bp Leiter (Katalog # G2101); Lane 2: Total DNA isoliert von CD19 + / CD34 +-Zellen, Spur 3: Gesamt-DNA aus CD19 isoliert + </sup&gt; / CD34 - / CD45 niedrige Zellen; Spur 4: 100 ng DNA aus CD19 + / CD34 isoliert - / CD45 med. Zellen; Spur 5: 100 ng DNA aus CD19 + / CD34 isoliert - / CD45 hohen Zellen. DNA wurde unter Verwendung des beschallt Diagenode Bioruptor on High für insgesamt 9 min (30 s EIN; 30 sec AUS). DNA wurde gereinigt und visualisiert auf einem 1% Agarosegel mit SYBR green Nukleinsäure Gelfärbemittels. B) Nach MIRA Verwendung des ActivMotif MethylCollector Ultra-Kit, PCR mit SLC25A37 (1-6) und APC1 (7-12) wird durchgeführt, um zu bestätigen Anreicherung von methylierter DNA. 1 &amp; 7: beschallt genomische DNA (keine MIRA), 2 &amp; 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 &amp; 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 geringen DNA; 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med. DNA; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 hohen DNA; 6 &amp; 12: Water Kontrolle. Höhere Verstärkung SLC25A37 bestätigt die Anreicherung von methylierter DNAin den Untermengen von Vorläufer B-Zellen.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood at JoVE.com

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Aufrufe.  University of Missouri-Columbia. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Serie: Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...