Andrew Langs Unterstützung bei der grafischen Darstellung der Daten geschätzt wird. Dank Mettler-Toledo für die Bereitstellung von Ausrüstung und Materialien für die Durchführung der experimentellen Arbeiten.

Einführung Die Ugi-Reaktion hat sich als eine bequeme Möglichkeit, um schnell diverse Bibliotheken von Verbindungen (1-3) sein. Es geht um die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd, einer Carbonsäure und ein Isonitril in der Regel in Methanol bei Raumtemperatur. Die Ugi-Reaktion ist oft als ein Werkzeug in der Synthese von pharmakologisch aktiven Molekülen verwendet worden und wir haben es genutzt, um schnell auf Verbindungen in die Suche nach neuen Anti-Malaria-Mittel (4). Es wurde beobachtet, dass Ugi-Produkte manchmal Niederschlags in reiner Form aus dem Reaktionsgemisch (1,5). Dies ist ein sehr glücklichen Ausgang, da die Reaktion dann kann einfach skaliert werden, ohne dass teure Reinigungsverfahren wie Chromatographie. Es wäre sehr vorteilhaft für die Ugi Produktausbeute als direkt von der Filterung der Reaktionsmischung ohne weitere Behandlung erhalten zu optimieren. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine 48-Slot Mettler-Toledo MiniBlock (6) mit Filtration Rohren ausgestattet. Eine Mettler-Toledo MiniMapper (7) automatisiertes Liquid Handler verwendet wurde, um die Reagenzien und Lösungsmittel zu liefern. Die Parameter des Interesses standen die Konzentration, der Zusammensetzung des Lösungsmittels und der Überschuss von einigen der Reagenzien. Experimentell Die MiniMapper automatisierten Liquid Handler wurde so programmiert, dass Flüssigkeiten in der folgenden Reihenfolge zu liefern leer Filterrohre in einem 48-Position MiniBlock: zusätzliche Lösungsmittel, Furfurylamin (2M in Methanol), Benzaldehyd (2M in Methanol), Boc-Glycin (2M in Methanol) und t-Butylisocyanid (2M in Methanol). Der Standardwert hinaus betrug 100 Mikroliter. Ist ein Reagenz als im Überschuss zugegeben vermerkt ist, wurden 120 Mikroliter geliefert. Die MiniBlock wurde dann auf einem Schüttler für 16 Stunden gelegt, bevor sie gefiltert mit Hausvakuum. Zwei Wäschen sind durch Zugabe von Methanol (1 mL) in jedes Röhrchen durch 15 min Schütteln vor dem Abfiltrieren gefolgt durchgeführt. Die Röhrchen wurden dann im Hochvakuum in einem Exsikkator für mindestens 30 min getrocknet. Die Ausbeute wurde aus der Gewichtszunahme der Filterrohre berechnet. Die Reinheit wurde durch H-NMR für eine Probe von jedem Lösungsmittel und Konzentration geprüft. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung (8-10) laufen und die durchschnittlichen Erträge sind in Tabelle 1 angegeben. Charakterisierung der Ugi-Produkt <a href="http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.21106059.html">tert-Butyl-(2 - {[2 - (tert-Butylamino)-2-oxo-1-phenylethyl] (Furan-2-ylmethyl) amino}-2-oxoethyl) Carbamat</a> : weißer Feststoff, Schmp. (11) 202-204 C; 1H-NMR (12, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/Exp203A11-HNMR.html">Spektrum</a> ) (500MHz, δppm, CDCl3) 1.33 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 4,21 (m, 2H), 4,49 (d, J = 18Hz, 1H), 4,50 ( d, J = 18Hz, 1H), 5.47 (s, 1H), 5,60 (s, 1H), 5.62 (s, 1H), 5,89 (s, 1H), 6,10 (s, 1H), 7.19 (s, 1H) , Phenyl 7,21-7,37 (m, 5H); 13C-NMR (13, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/Exp02060822080933CNMR.html">Spektrum</a> ) (500MHz, δppm, CDCl3) 28,3, 28,6, 42,3, 42,8, 51,7, 62,9, 79,5, 107,7, 110,4, 128,5, 128,7, 129,6, 134,7 , 141,9, 149,8, 155,7, 168,4 170,2; IR (14, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/ugiproductpaper03IR.html">Spektrum</a> ) (Ʋmax cm-1 ATR): 1645,1673,1699, 3331; FAB-HRMS (15, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Exp099Chighres.JPG">Spektrum</a> ) (berechnet für C24H33N3O5 m / z 444,2498 [M + H], erhalten 444,2517.) Data Analysis Der Niederschlag liefern Daten wurden mit Hilfe der Ein-Faktor-oder Zwei-Faktor-(mit Wiederholungen) Analyse der Varianz (ANOVA) Tools in Microsoft Excel. (16) Für diese Variablen finden sich als statistisch signifikant in der ANOVA-Analyse, Fisher Least Significant Difference (LSD)-Test wurde verwendet, um den spezifischen experimentellen Einstellungen, die signifikante Unterschiede in der Ausbeute der Ugi Niederschlag (17) zu bestimmen. Alle Signifikanztests wurden auf dem 95% Konfidenzniveau durchgeführt. Ergebnisse und Diskussion Abbildung 1 fasst die Wirkung der Lösungsmittel-Zusammensetzung auf die Ausbeute der Ugi Niederschlag. Ein einzelner Faktor ANOVA zeigt einen signifikanten Unterschied in der durchschnittlichen Rendite für die vier Lösungsmitteln bei einem Reagens-Konzentration von 0,2 M untersucht. Fisher-LSD-Test zeigt an, dass der Niederschlag liefert in Methanol und Ethanol sind nicht statistisch unterschiedlich auf dem 95%-Konfidenzintervall (angedeutet durch die Bar über die Namen von Lösungsmitteln in der Abbildung), die Ausbeute von Ugi Niederschlag ist wesentlich größer in Ethanol und Methanol als in Acetonitril, die wiederum deutlich größer als in THF. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_9_26_0/942_Figure-01.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Zusammenfassung der Wirkung von Lösungsmittel-Zusammensetzung auf die Ausbeute der Ugi Niederschlag in einer Reagent-Konzentration von 0,2. Die aufgeführten Lösungsmittel umfassen 40% Methanol bei dieser Konzentration. Betrachtet man die Wirkung von Reagenz-Konzentration, zeigen die Daten in Tabelle 1 einen steilen Abfall der Ausbeute gefunden wurde, wenn man von 0,2 M bis 0,07 M unter Verwendung von Methanol, Ethanol und Acetonitril als Lösungsmittel, wobei die Ausbeuten waren vergleichbar in Methanol an der 0,2 und 0,4 M-Konzentrationen. Beachten Sie, dass Ugi-Reaktionen in der Regel in der 0,5-2m-Bereich (2) laufen. Allerdings, wenn Sie ein automatisiertes Liquid Handler, kann es schwierig sein, mit entsprechenden Reagenzien, viel konzentrierter als 2M starten, damit Platzierung eine praktische Obergrenze auf die Endkonzentration bei etwa 0,5. Die Ergebnisse dieser Studie zur Optimierung raten zur Vorsicht bei der Interpretation der Erfolg oder Misserfolg der Ugi-Reaktionen unter 0,2, da nichtlineare Effekte sind offenbar eine Rolle spielen. Abbildung 2 zeigt die Wirkung des Lösungsmittels Zusammensetzung und Reagenz mehr auf den Ertrag der Ugi Niederschlag in einem Reagens-Konzentration von 0,2. Die Zwei-Faktor ANOVA Ergebnisse zeigen eine statistisch signifikante Lösungsmittel und Reagenz mehr Wirkung. Darüber hinaus gibt es eine statistisch signifikante Wechselwirkung zwischen den beiden Variablen. Details der Interaktion sind in Abbildung 2 freigelegt, die zeigt, dass die Ausbeute an Niederschlag durch das verwendete Lösungsmittel beeinflusst. Beachten Sie auch, dass die Balken über die Faktoren in der Figur zeigen die Renditen sind keine statistisch signifikanten Unterschiede bei der Sicherheit von 95%. Für beide Ethanol und Methanol die besten Erträge werden mit dem Imin oder Isonitril mehr erhalten, während für Acetonitril, deutlich bessere Ergebnisse mit dem Amin-, Aldehyd-oder Isonitril mehr erhalten. Wie oben in der Diskussion der Ergebnisse in Tabelle 1 angegeben, ist die Gesamtausbeute von Niederschlag für THF als Lösungsmittel niedrig, und nur ein Überschuss von Imin führt zu einer statistisch signifikanten Verbesserung der Niederschlag zu erhalten. Diese unterschiedlichen Muster der verbesserten Ausbeute für die vier Lösungsmittel ist, was führt zu statistisch signifikanten Interaktionseffekt, und kann einen Indikator für unterschiedliche Zusammenspiel der Ugi-Produkt mit den verschiedenen Lösungsmitteln verwendet werden. Obwohl die numerischen Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen die beste Ausbeute in 0,4 M Methanol wurde mit 1,2 Äquivalenten von überschüssigem Imin 0.2M Acetonitril / Methanol und 0,2 M Ethanol / Methanol-Mischungen auch zu signifikanten Ausbeuten. Beachten Sie besonders, dass alle THF / Methanol-Gemischen bei 0,2 sehr schlechte Ergebnisse gab. Die Ugi-Reaktion wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Lösungsmitteln, wie THF (2) durchgeführt. Beachten Sie, dass die geringen Ausbeuten hier bedeuten nicht, dass der Ugi-Reaktion fand nicht statt in THF Mischungen, nur dass ein Niederschlag nicht gebildet wurde. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_10_13_5/942_Figure-02.png" alt="Abbildung 2" width="335" height="325" /> Abbildung 2: Zusammenfassung der Wirkung von Lösungsmittel Zusammensetzung und Reagenz mehr auf den Ertrag der Ugi Niederschlag in einem Reagens-Konzentration von 0,2. Die aufgeführten Lösungsmittel umfassen 40% Methanol bei dieser Konzentration. Abbildung 3 fasst die Wirkung von Reagenzkonzentration und Reagenz mehr auf den Ertrag der Ugi Niederschlag mit Methanol als Lösungsmittel. Die Zwei-Faktor ANOVA Ergebnisse zeigen eine statistisch signifikante Konzentration und Reagenz mehr Wirkung. Wie oben beschrieben, die Ausbeute an Niederschlag im Reagenz-Konzentrationen von 0,2 M und 0,4 M sind wesentlich größer als bei 0,07 M (aber nicht voneinander unterscheiden). Darüber hinaus gibt es eine statistisch signifikante Wechselwirkung zwischen den beiden untersuchten Variablen. Beachten Sie, dass das Muster der Verbesserung der Niederschlag Ausbeute Identität des überschüssigen Reagens in der Regel ist das gleiche bei den höheren Reagenz-Konzentrationen. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_9_26_2/942_Figure-03.png" alt="Abbildung 3" width="384" height="255" /> Abbildung 3: Zusammenfassung der Wirkung von Konzentration und Reagenz mehr auf den Ertrag der Ugi Niederschlag in Methanol als Lösungsmittel. Insgesamt zeigen die Ergebnisse in den Abbildungen 2 und 3 beschrieben, dass es Wechselwirkungen zwischen der Wahl des Lösungsmittels, Reagenzkonzentration und die Identität des Reagenz im Überschuss, aber insgesamt waren subtiler als die geraden Lösungsmittel und Konzentration Effekte. Andere haben ähnliche Ergebnisse, wenn die Optimierung einer Ugi-Reaktion (18). Abschluss Die Optimierung Experiment fanden die höchste Ausbeute der 48 läuft auf 66% von 0,4 M Methanol mit 1,2 eq. Imin. Dies liegt deutlich über der 49% Ausbeute aus der ersten Reaktion unter äquimolaren Konzentration von 0,4 M in Methanol erhalten. Gute Reproduzierbarkeit der Niederschlag Erträge wurde in diesen wiederholten Experimenten erhalten, so dass für subtile Wechselwirkungen positiv identifiziert werden.

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	<li>Marcaccini, S., Torroba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Ugi+four-component+condensation.">The use of the Ugi four-component condensation.</a> Nature Protocols. 2, 632-63 (2007).</li><li>Domling, A., Ugi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+reactions+with+isocyanides+Angew.">Multicomponent reactions with isocyanides Angew.</a> Chem. Int. Eng. Ed. 39, 3168-31 (2000).</li><li>Domling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Developments+in+Isocyanide+Based+Multi-Component+Reactions+in.">Recent Developments in Isocyanide Based Multi-Component Reactions in.</a> Applied Chemistry, Chem. Rev.. 106, (2006).</li><li>Bradley, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> http://usefulchem.blogspot.com/2008/01/we-have-anti-malarial-activity.html. , .</li><li>Sanudo, M., Marcaccini, M., Basurto, S., Torroba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+3-Hydroxy-6-oxo[1,2,4]triazin-1-yl+Alaninamides,+a+New+Class+of+Cyclic+Dipeptidyl.">Synthesis of 3-Hydroxy-6-oxo[1,2,4]triazin-1-yl Alaninamides, a New Class of Cyclic Dipeptidyl.</a> Ureas J. Org. Chem.. 71, 4578-45 (2006).</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UsefulChem EXP201 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP201. , .</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EXP202 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP202. , .</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EXP203 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP203. , .</li><li>p, m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>Bradley, J. -. C., NMR, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> spectrum 203A11 from UsefulChem EXP203 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP203. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C NMR spectrum 206A from UsefulChem EXP206 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP206. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IR spectrum from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FAB-MS from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis details available at http://usefulchem.wikispaces.com/space/showimage/EXP201-203_KO-A.xls. , .</li><li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Analysis+of+Experiments.">Design and Analysis of Experiments.</a> Nature Protocols. , (2005).</li><li>Tye, H., Whittaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Design+of+Experiments+approach+for+the+optimisation+of+a+microwave+assisted+Ugi+reaction.">Use of a Design of Experiments approach for the optimisation of a microwave assisted Ugi reaction.</a> Org. Biomol. Chem.. 2, 813-813 (2004).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Furfurylamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F20009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>12010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boc-glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>B1185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>t-butylisocyanide</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>B1274</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optimization of the ugi reaction using parallel synthesis and automated liquid handling

Die Optimierung einer Ugi-Reaktion, die die Vermischung von Furfurylamin, Benzaldehyd, Boc-Glycin-und t-Butylisocyanid beschrieben. Triplicate läuft von 48 parallel Experimente berichtet, unterschiedlicher Konzentration, Lösungsmittel und der Überschuss an einige der Reagenzien. Die Isolierung des Produkts wurde durch eine einfache Filtration und waschen Verfahren erreicht. Die höchste Ausbeute betrug 66% von 0,4 M Methanol mit 1,2 eq. Imin. Dies liegt deutlich über der 49% Ausbeute aus der ersten Reaktion unter äquimolaren Konzentration von 0,4 M in Methanol erhalten. Methanol-Lösungen mit Reagenz-Konzentrationen von 0,4 M bzw. 0,2 M gab bessere Ausbeuten, während alle Lösungsmittel-Systeme bei 0,07 M durchgeführt schlecht. Bei 0,2 M, Methanol und Ethanol / Methanol (60/40) Mischungen wurden statistisch gleich gut, während THF / Methanol (60/40) war arm und Acetonitril / Methanol (60/40) wurde das Zwischenprodukt. Gute Reproduzierbarkeit der Niederschlag Erträge wurde in diesen wiederholten Experimenten erhalten, so dass für subtile Wechselwirkungen positiv identifiziert werden.

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

Die Ugi-Reaktion hat sich als eine bequeme Möglichkeit, um schnell diverse Bibliotheken von Verbindungen sein. Es geht um die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd, einer Carbonsäure und ein Isonitril in der Regel in Methanol bei Raumtemperatur. In diesem Video, verwenden wir ein 48-Slot Mettler-Toledo MiniBlock mit Filtration Rohren und einem Mettler-Toledo MiniMapper automatisierten Liquid Handler verwendet wurde, um die Reagenzien und Lösungsmittel liefern ausgestattet. Die Parameter des Interesses standen die Konzentration, der Zusammensetzung des Lösungsmittels und der Überschuss von einigen der Reagenzien.

Optimierung der Ugi-Reaktion mit Parallel Synthese und Automated Liquid Handling

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Aufrufe.  Drexel University. Die Ugi-Reaktion hat sich als eine bequeme Möglichkeit, um schnell diverse Bibliotheken von Verbindungen sein. Es geht um die Reaktion eines Amins mit einem Aldehyd, einer Carbonsäure und ein Isonitril in der Regel in Methanol bei Raumtemperatur. In diesem Video, verwenden wir ein 48-Slot Mettler-Toledo MiniBlock mit Filtration Rohren und einem Mettler-Toledo MiniMapper automatisierten Liquid Handler verwendet wurde, um die Reagenzien und Lösungsmittel liefern ausgesta...

Serie: Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Forschung

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

Spatial Mehrzieloptimierung of Agricultural Conservation Practices mit einem SWAT-Modell und einem evolutionären Algorithmus

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis algorithms which can be used effectively to count various biological particles. When counting large numbers of cell samples, the hemocytometer presents a bottleneck with regards to time. Likewise, counting membranes from migration/invasion assays with the ImageJ plugin Cell Counter, although accurate, is exceptionally labor intensive, subjective, and infamous for causing wrist pain. To address this need, we developed two plugins within ImageJ for the sole task of automated hemocytometer (or known volume) and migration/invasion cell counting. Both plugins rely on the ability to acquire high quality micrographs with minimal background. They are easy to use and optimized for quick counting and analysis of large sample sizes with built-in analysis tools to help calibration of counts. By combining the core principles of Cell Counter with an automated counting algorithm and post-counting analysis, this greatly increases the ease with which migration assays can be processed without any loss of accuracy.

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

Die Einnahme von Leuchtstofflampen, magnetische Nanopartikel für die Bestimmung der Fluid-Aufnahme Fähigkeiten bei Insekten

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.