Diese Arbeit wurde unterstützt von der Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 und 2015) Y.O., das gemeinsame Projekt Award (2013 und 2014), K. M., und gewährt in Beihilfen für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technology, Japan (16K 15625, Y. K. und 16K 15598, M.G.). Wir sind besonders dankbar für alle Mitglieder der Abt. für Coloproctological Chirurgie und Molekularpathologie für nützliche Diskussionen und technischen Support. Wir danken auch Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) und Dr. Hideki Kitajima (Internationale Hochschule für Gesundheit und Soziales) für großzügige fachliche Anleitung in den chirurgischen Verfahren zur orthotopen Implantation in Mäusen und Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) für technische Beratung bezüglich die Tumor organoide Kultur durchführen.

<ol>
	<li>Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+statistics,+2014.">Colorectal cancer statistics, 2014.</a> CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li><li>Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites.">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li><li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EBV-related+lymphoproliferative+lesions+arising+in+donor+lymphocytes+of+transplanted+human+tumor+tissues+in+the+NOG+mouse.">Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse.</a> Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben keine potenzielle Interessenkonflikte offenlegen.

Obwohl das CRC PDX-Modell weithin eingesetzt worden, hat um primäre Tumorwachstum zu studieren, ob dieses Modell auch für Tumor Metastasen zu untersuchen gilt hat nicht noch nicht vollständig aufgeklärt. Spontane Metastasen waren auch kaum nachweisbar in Leber und Lunge von verschiedenen gemeldeten Doppelpunkt PDX Modelle4,10. Um Fixierungsprotokoll mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen, haben wir ein Protokoll für transducing GFP Lentivirale Partikel in CRC...

Kolorektales Karzinom (CRC) ist die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit1. Die unzureichende Reaktion auf konventionelle Therapien von Patienten mit fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung zeigt die Unwirksamkeit der Versuche, CRCs radikal zu heilen. Um eine effektivere therapeutische Ansätze zu entwickeln, entstanden verschiedene präklinische Mausmodelle von Krebs, die die Eigenschaften des SFB zu imitieren. Verschiedene CRC-Zell-Linien wurden weithin zur Tumor Xenografts aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Manipulation zu generieren. Langfristige Kultur von Krebszelllinien, führt jedoch oft zu Auswahl an einzigartigen Zell-Populationen, die ziemlich proliferative unter einer bestimmten Kultur Bedingung, damit was zu unzuverlässigen Ergebnissen und entscheidende Einschränkungen in präklinischen Droge Entwicklung.
Ohne kultiviert in Vitro, wurden auch durch Implantation in Tiermodellen der CRC Gewebe chirurgisch seziert von Patienten2,3,4Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) generiert. PDXs sind weithin als Rekapitulation der histopathologischen Haupteigenschaften und genetische Veränderungen, die ursprünglich in Tumoren der Patienten, von denen sie abgeleitet wurden. Darüber hinaus bestehend Patienten abgeleitet Tumor Organellen aus Tumorzellen, die Cluster von Kultur unter 3D Bedingungen entstanden, die genau die biologischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumoren5,6nachgeahmt. Dieser Tumor Organellen wurden auch für Hochdurchsatz-Drogen-Screening, wodurch personalisierte Therapien gestaltete5übernommen. Jedoch deutlich heterogene CRC-Populationen sind davon ausgegangen, dass innerhalb eines Tumors sein Masse. Bestimmte CRC Populationen könnte gezielt vermehren und während der in Vivo und in Vitro Reihe von Passagen des PDX und Tumor Organellen, bzw. zu erweitern. Dies kann die gesamte gen expressionsprofile und Epi/genetischen Status der betroffenen CRCs zu verändern, auch damit was zu minimalen Ähnlichkeit mit der elterlichen CRC.
Patienten-abgeleitete CRC Organellen und diejenigen extrahiert aus noncancerous menschlichen Dickdarm zum Hafen, die Kombinationen von Onkogenen Mutationen auch beschäftigt sind, zu untersuchen, die Kennzeichen der menschlichen Tumorzellen von Tumorinvasion und Metastasierung beispielhaft entwickelt 6,7,8,9. Jedoch hat die sehr niedrige Inzidenz von spontanen Metastasen aus orthotopen Implantation des Patienten abgeleitet CRC in immungeschwächte Mäuse es schwierig gemacht, mehrstufigen Prozess der Invasion Metastasierung Kaskade zu studieren, die enthält lokale Invasion, Intravasation, Transport in der Blutbahn, Extravasation und Besiedlung von entfernten Organen4,10. Micrometastasis als Prozessbevollmächtigte Tumor Zelle Ablagerung von ≤2 mm, durch Patienten abgeleitet CRC Organellen gebildet, wurde histopathologischen Analyse der Abschnitte von betroffenen entfernte Organe in experimentellen Mausmodellen oft übersehen. Visualisierung von spontanen Fixierungsprotokoll wurde auch minimal in Vivo aufgrund der Schwierigkeiten der Tumorzellen organoide vor deren Injektion Empfänger Mäuse effizient fluoreszierenden Marker einzuführen. In dieser Studie entwickelt wir ein Protokoll, um effizient GFP Lentivirus in 3D Culture vor der Injektion in Empfänger Mäuse PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen transduzieren und hochempfindlichen Erkennung ermöglichen Einsatz Stereo-Fluoreszenz-Mikroskopie, der ihre Besiedlung der verschiedenen Organe zu Form Fixierungsprotokoll.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NOD/Shi-scid IL2R&#947; null (NOG) mice</td>
			<td>The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clips 
			2&#215;10mm</td>
			<td>Natsume manufacturing, Japan</td>
			<td>#C-21-S</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 
			needle size:22 gauge</td>
			<td>Tokyo Science, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>#92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>#92412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml conical tube</td>
			<td>Sumitono Bakelite</td>
			<td>MS-57150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tube</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-57500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>#0030120086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Erma</td>
			<td>#03-202-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#354234</td>
			<td>Store aliqupts at -20&#176;C. 
			Place on ice until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C1030</td>
			<td>150 mg/ml collagenase type1 in 1&#215;PBS. Store aliqupts at -20&#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovate Cell Technologies</td>
			<td>#5V2623A</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#10565018</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell banker 1plus</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>#628</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15140122</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#15140122</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Use within 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hEGF</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>#AF-100-15</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Add to medium on same day as use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632, a ROCK inhibitor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>#253-00591</td>
			<td>Store at -20&#176;C. Add to medium on 
			same day as use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482; supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 &#181;g/ml streptomycin. 
			Store at 4&#176;C. Use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRC organoid culture medium 
			with 1% or 5% FCS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM/F-12 with GlutaMAX&#8482; supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 &#181;g/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 &#181;M Y27632, a ROCK inhibitor. 
			Store at 4&#176;C. Use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the FuGENE 6 transfection regent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814 443001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.45 &#181;m filter</td>
			<td>Sartorius stedim</td>
			<td>17598-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRL-GFP vector</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-VSV-G</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-dR8.2 dvpr</td>
			<td>Gift from Dr. Robert A. Weinberg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the SW55Ti swinging bucket rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-sensitivity detection of micrometastases generated by gfp lentivirus-transduced organoids cultured from a patient-derived colon tumor

Trotz aktueller Fortschritte in der Behandlung der menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC) sind einige radikale Therapien effektiv für den späten Stadien der CRC. Zur Überwindung dieser klinische Herausforderung, Tumor-Xenograft-Maus-Modellen alteingesessenen mit menschlichen Karzinom-Zell-Linien und viele transgenen Mausmodellen mit Tumoren wurden als präklinischen Modellen entwickelt. Sie teilweise die Funktionen der menschlichen Karzinome zu imitieren, aber oft nicht auf die wesentlichen Aspekte der menschlichen Tumoren einschließlich Invasion und Metastasierung zu rekapitulieren. Alternative Modelle, die besser die maligne Progression in menschlichen CRC darstellen sind so lange erwartet worden.
Wir zeigen hier Generation von Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) durch subkutane Implantation von kleinen CRC-Fragmente von einem Patienten chirurgisch seziert. Der Doppelpunkt, den pdxs entwickeln und histopathologisch ähneln die CRC des Patienten. Allerdings sind einige spontane Fixierungsprotokoll nachweisbar in konventionellen Querschnitte der betroffenen entfernte Organe des PDX-Modells. Um die Erkennung von metastasierendem Verbreitung in entfernten Organen zu erleichtern, wir Doppelpunkt PDXs in Kultur organoide Tumorzellen entnommen und mit GFP Lentivirus vor der Injektion in stark immungeschwächte NOD/Shi-scid IL2Rγ infiziertNull (NOG) Mäuse. Orthotopically injiziert PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen konsequent Form Primärtumoren positiv für GFP im Empfänger Mäuse. Darüber hinaus entwickeln spontan Micrometastatic, die Kolonien mit dem Ausdruck GFP vor allem in den Lungen von diesen Mäusen durch Fluoreszenzmikroskopie erkannt werden. Darüber hinaus produziert intrasplenic Injektion von CRC Organellen häufig hepatische Kolonisation. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse GFP gekennzeichnet PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen visuell erkennbaren in einem mehrstufigen Prozess werden die Invasion Metastasierung Kaskade genannt. Die beschriebenen Protokolle gehört die Einrichtung der PDXs der menschlichen CRC und 3D Kultur der entsprechenden CRC organoide Zellen durch GFP Lentivirale Partikel ausgestrahlt.

Eine primäre kolorektalen Adenokarzinom diagnostiziert als mäßig differenziert hatte von einer 76 Jahre alten Frau mit TNM-Klassifikation, Stadium IIIa, gefolgt von postoperativen Chemotherapie chirurgisch reseziert worden. Die primäre CRC Zellen-Proteins gebeizt für carcinoembryonales Antigen, Ki-67, Pan-Cytokeratin und E-Cadherin positiv. Stücke des resezierten Tumors waren NOG Mäuse um den Doppelpunkt PDX Modell erzeugen auch subkutan implantiert. CRC organoide Zellen wurden dan...

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High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Um hochempfindliche Detektion der Verbreitung von menschlichen colorectal Krebses (CRC) Zellen Gewebe besiedeln können, zeigen wir hier ein Protokoll zur effizienten Transduktion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Lentivirale Partikel in PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen vor der Injektion in Empfänger Mäuse mit Stereo-Fluoreszenz-mikroskopische Beobachtung.

Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

This method can help answer key questions in the field of tumor biology about the micrometastases found in colon cancer patient. The main advantage of this technique is that it allows highly sensitive detection with micrometastases induced by GFP-labeled, patient-derived colon cancer organoids in the mice. Generally, individuals new to this method will struggle because it can be difficult to detect colon tumor organoid-derived micrometastases in distant organs in mice.Demonstrating the procedure with Yu Okazawa will be Kosuke Mizukoshi and Yu Koyama, both PhD students and surgeons from my group. To generate human colorectal cancer cell organoids, first add 150 microliters of artificial extracellular matrix per well to a 12-well plate on ice. When all of the wells have been coated, incubate the plate for 30 to 60 minutes in a 37 degree Celsius and 5%CO2 incubator to solidify the gels.Next, resuspend a patient-derived tumor xenograft cell pellet in fresh colorectal cancer organoid culture medium supplemented with 5%fetal calf serum, or FCS, to achieve a three times 10 to five cells per milliliter concentration, and seed one milliliter of cells onto each artificial extracellular matrix. Then, return the cells to the cell culture incubator. The next morning, carefully transfer the culture supernatants, including the floating cells, into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes for their centrifugation, and resuspend the pellets in 70 microliters of fresh artificial extracellular matrix on ice.To increase colorectal cancer cell viability, overlay the floating tumor cell containing artificial extracellular matrix back onto the artificial extracellular matrix-coated wells, and incubate the tumor cell cultures for 30 minutes in the cell culture incubator. When the new extracellular matrix gel has solidified, feed the cultures with one milliliter of fresh colorectal cancer organoid cell culture medium supplemented with 1%FCS, and return the cells to the cell culture incubator. After seven to 10 days of culture, detach the organoids mechanically with a sterile cell scraper, and transfer the organoids into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes for their centrifugation.Then, resuspend the pellets in 500 microliters of PBS with gentle tapping for another centrifugation. To dissociate the colorectal cancer organoids, add 500 microliters of proteolytic and collagenolytic enzyme solution to the tubes, and mix with gentle tapping. After 10 minutes at room temperature, add 500 microliters of medium supplemented with 1%FBS to the cells, and very gently pipette the cell suspension several times to break up the organoids.Gentle pipetting of human CRC organoids during processing is critical to maintaining an intact spheroid formation in culture. Centrifuge the cells again, and resuspend the pellets in 100 microliters of 5X GFP lentivirus stock and 400 microliters of fresh colorectal cancer organoid culture medium. It is essential to infect the human CRC organoids with a high titer of GFP lentivirus, particularly to achieve a nearly 100%infection of CRC.Adjust the volume in each tube to achieve a five times 10 to the five dissociated tumor cell per 500 microliters of medium concentration, and plate 500 microliters of cells into each well of an artificial extracellular matrix-coated 12-well plate as demonstrated. After 18 hours in the cell culture incubator, transfer the floating, cell-containing supernatants into individual 1.5-milliliter microcentrifuge tubes for centrifugation, followed by resuspension of the pellets in 70 microliters of artificial extracellular matrix per tube on ice. To enhance the colorectal cancer cell viability, overlay the tumor cell-containing artificial extracellular matrix onto the tumor organoids in the 12-well plate, and place the plate in the cell culture incubator for 30 minutes.When the artificial extracellular matrix coating has solidified, feed the cultures with one milliliter of fresh CRC organoid culture medium supplemented with 1%FCS, and return the cells to the cell culture incubator for three days. Then, observe the infected cells by fluorescence microscopy to confirm a nearly 100%GFP positivity, and return the cells to the incubator for another four to six days. To establish a spontaneous metastasis mouse model of CRC patient-derived tumor xenografts, dissociate the GFP-labeled organoids as demonstrated, and dilute the single tumor cell suspensions at a five times 10 to the five tumor cells per 50 microliters of PBS supplemented with 50%artificial extracellular matrix concentration.Load 50 microliters of cells per mouse into a syringe equipped with a 22-gauge needle, and place the tumor cells on ice. Next, confirm a lack of response to toe pinch, and place the first anesthetized NOG mouse in the supine position on the laboratory bench. Using sterile tweezers, gently pull the rectal mucosa out of the anus, and immediately inject the tumor cells into the rectal submucosa.To establish an experimental metastasis model of CRC patient-derived tumor xenografts, dilute the single tumor cell suspensions at a four times 10 to the four cells per 50 microliters concentration, and load 50 microliters of cells per mouse into a syringe equipped with a 22-gauge needle. Place the first anesthetized NOG mouse in a prone position on the bench, and make a small incision in the lower region of the left flank. Use sterile scissors and tweezers to carefully cut the peritoneum and expose the spleen, and use the tweezers to grasp the fat attached to the spleen.Then, slowly inject 50 microliters of the tumor cell suspension into the spleen, taking care that no leakage is observed. After all of the mice have been injected and sutured as necessary, return the animals to their home cages, and check for suture leakage and viability one day after the tumor cell delivery. Use calipers to measure the tumors weekly, harvesting the primary tumors and relevant tissues up to the appropriate experimental endpoints.Transfer the dissected tumors and organs into five milliliters of ice-cold PBS in a 10-centimeter Petri dish on ice, and observe the dissected tissues under a stereo-fluorescence microscope to assess their GFP expression. CRC organoid infection with GFP lentivirus, as demonstrated, results in nearly all organoids expressing very bright GFP. Orthotopic and intrasplenic injection of the GFP-labeled organoids into secondary recipient NOG mice reveals the formation of GFP-positive primary tumors at the orthotopic site, as well as in the lungs of the majority of mice examined at 2.5 months after injection.More, liver metastases are observed in recipient NOG animals at one month after intrasplenic injection. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect micrometastases of GFP-labeled human colorectal cancer cell organoids after their introduction into recipient mice. While attempting this procedure, it's important to remember that the tumor and metastasis homing efficiency of human colon cancer cell organoids in mice is largely dependent on the interpatient variability of the original tumor cells.

high-sensitivity-detection-micrometastases-generated-gfp-lentivirus

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