Nos gustaría dar las gracias al Dr. Evan Newell y el Dr. Sean Bendall para la retroalimentación. También nos gustaría dar las gracias Ciencias DVS y el Dr. Sean Bendall para una muestra de las perlas de poliestireno múltiples que contienen lantánidos. Estamos muy agradecidos por la financiación de los NIH subvención AI057229 U19 2.

Todas las muestras de células para la CyTOF debe ser fijada y permeabilizada. Esto permite una mayor entrada de la intercalador de ADN que contiene iridio, y también previene la lisis celular durante el lavado con agua MilliQ y resuspensión inmediatamente antes de la inyección en el citómetro de masa. 1. Puesta en marcha del citómetro de masas <ol><li> Abra el programa CyTOF. Seleccione Configuración del instrumento. En la ficha canastilla para tarjetas, vaya a la esquina inferior derecha y haga clic Calentador botón &quot;ON&quot;. Encender el calentador de al menos 15 min antes de tiempo deseado para permitir tiempo suficiente para que el manto cámara de pulverización para llegar a 200 ° C. </li><li> Sustituir el blanco Norm-Ject 3 ml jeringa en la bomba de jeringa con una jeringa llena de agua fresca MilliQ. </li><li> Limpieza del nebulizador. Dejen pasar el nebulizador mediante el uso de la jeringa y el tubo para tirar 5% Citranox 2-3 veces a través del puerto más pequeño de introducción de líquido y el orificio de introducción de gas más grande. Repita el lavado a contracorriente con agua MilliQ to eliminar Citranox residual. </li><li> Confirme que las luces en el panel frontal de la CyTOF se encienden como en la figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. CyTOF luces del panel antes de arrancar. <ol start="5"><li> Abra la válvula del tanque de gas argón. Esto debería hacer que el &quot;ARGON&quot; luz en la parte frontal para encenderla. </li><li> Conecte el nebulizador para el maquillaje de entrada de gas. Desenrosque el maquillaje conector de gas y retire la tubería de caucho negro o-ring y la pieza de plástico blanco cónico. Tenga en cuenta la más amplia &quot;nudillo&quot; en el vástago del orificio de introducción de gas del nebulizador. Coloque el conector en el orificio de introducción de gas. Coloque el negro o-anillo sobre el extremo de la conexión de gas, y la fuerza de la junta tórica más allá de la parte más ancha del vástago de puerto. Coloque la pieza cónica de plástico blanco en la parte superior con el extremo estrecho señalado, y el tornillo en el tubo de gas de maquillaje. </li><li&gt; Conecte el nebulizador para el tubo de introducción de líquido. Cuidadosamente inserte el tubo pequeño en la abertura en el extremo del nebulizador. Habrá dos paradas, similar en sentir a las paradas en una micropipeta. En primer lugar, presione hasta que encuentre resistencia a la luz, y el extremo del tubo pequeño debe estar al final de la recta de vidrio. En segundo lugar, presionar con más fuerza para obligar al final de la sección recta de vidrio adicional en la conexión y apriete el tornillo de ajuste para sellar. Insertar el extremo del nebulizador en la abertura blanco en el manto de calentamiento. </li><li> En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, pulse el botón &quot;Start Plasma&quot;. Desde el nebulizador ya está insertado, pulse el botón &quot;OK&quot;. El software se encenderá el enfriador, iniciar el flujo de gas, y encender un plasma. El detector de tensión se elevará. Habrá una ventana pop-up diciendo &quot;Plasma secuencia de arranque ha finalizado con éxito&quot; cuando haya terminado, pulse el botón &quot;OK&quot;. Nuevas luces debe estar activada en el panel frontal (Figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. CyTOF luces del panel de plasma después de encendido y puesta en marcha se completó correctamente. <ol start="9"><li> Encender la bomba de jeringa. En la esquina superior derecha, pulse el botón verde &quot;play&quot; para iniciar la bomba de jeringa y comience a fluir líquido a través del tubo y la pulverización del nebulizador. Los ajustes por defecto son para jeringas 3 ml de agua. Para que muestra que se circula a través del bucle de muestra, la bomba de jeringa debe ser cambiado periódicamente cuando se ejecuta fuera del agua. En la parte superior de la pantalla, hay un contador que indica la cantidad de líquido ha fluido fuera de la bomba de jeringa. La bomba de jeringa se detendrá cuando este contador llega a &quot;3,000&quot; o el émbolo llega al final de la jeringa. Al rellenar la jeringa, se debe pulsar &quot;stop&quot; en lugar de la nada &quot;pausa&quot; para reiniciar el contador. </li></ol>e &quot;2&gt;. Calibración diaria del citómetro de masas <ol><li> El citómetro de masas se requiere aproximadamente 20 minutos para conseguir un plasma caliente y estable antes de la calibración. El propósito de los pasos de sintonía es maximizar la señal deseada de Tm169 o Tb159 manteniendo &quot;Gd155&quot; (óxido; La139 + O16) de la señal por debajo del 3% del valor más alto. Haga clic en el botón Configuración para abrir Adquisición de adquisición de datos Configuración de la ventana. En la pestaña de analitos, haga clic en la tabla periódica para abrir el panel de selección de isótopos. Seleccione los isótopos en la solución de sintonización DVS Ciencias aparecen en el manual, a continuación, haga clic en &quot;Guardar&quot;. </li><li> Haga clic en los Isótopos por lectura para abrir la Masa (s) por la ventana de lectura. Seleccione &quot;impulsos de contaje&quot;, y reescalar el eje introduciendo un nuevo número y pulsar &quot;enter&quot;. </li><li> Llene un verde 1 ml Norma-Ject jeringa con la solución de sintonización. Gire el selector de puerto de la muestra a &quot;LOAD&quot;, inyectar 450 l de solución de sintonización, gire el selector a &quot;inyectar&quot;. En la ficha Calibración de masas de la Acquisit datos<html> ion ventana de Configuración, pulse el botón &quot;Ejecutar&quot; para controlar masas que fluyen por. El lado izquierdo de la ventana es menor masa, mientras que el lado derecho es mayor masa. Nota: ya habrá señales en la región TOF 9400-9800, debido a isótopos de xenón en el gas argón (Figura 3). Espere hasta que los isótopos de afinación solución comenzará a aparecer en forma de líneas en esta pantalla (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Calibración de masas pestaña de la ventana, que muestra los niveles de base para varios isótopos después de la solución de lavado y enjuague con agua. La región alrededor de TOF 9400-9800 corresponde a los isótopos de xenón en el gas argón, y siempre debe estar presente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Calibración de masas ventana de la ficha, que muestra rayas verticales para varios isótopos en la solución de sintonización DVS. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <ol start="4"><li> Volver a la Masa (s) por la lectura ventana y pulse el botón verde botón &quot;Play&quot; en la esquina superior izquierda. Cada isótopo seleccionado en el paso 2,1 se representa por una línea de color diferente. El valor por defecto del eje X es &quot;Time&quot;, en el s. Monitorear los niveles de los diferentes isótopos hasta que se firme. </li><li> Sintonización de la corriente. En la ficha Parámetros de la ventana Configuración de adquisición de datos, seleccione &quot;Actual&quot; en el menú desplegable. Vamos a empezar a = 0, final = 10, valor de paso = 0,5, tiempo de establecimiento = 200, y pulse &quot;Guardar&quot;. Haga clic de nuevo en la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora &quot;actual&quot;. Tenga en cuenta que las señales de los picos de los isótopos (Figura 5), y r<html> ECORD. En la pestaña Configuración de canales DAC de la ventana de configuración del instrumento, desplácese hacia abajo para &quot;actual&quot; e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón &quot;Ajustar valor real actual&quot;, y luego &quot;Guardar&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Perfil de ajuste actual. <ol start="6"><li> Sintonización del gas de maquillaje. Cambiar el menú desplegable de &quot;Maquillaje de gas&quot;. Vamos a empezar = 0,55, final = 0,95, valor del paso = 0,05, tiempo de establecimiento = 200. Pulse Guardar. Regresar a la Masa (s) por la ventana de lectura y pulsar el botón Reproducir. El eje x es ahora &quot;maquillaje gas&quot; velocidad de flujo. Grabar en donde las señales de los picos de los isótopos. Observar el rápido aumento de la &quot;Gd155&quot; señal cerca del extremo (Figura 6). Volver a la ficha Configuración de canales DAC, desplácese hacia abajo para &quot;Maquillaje gas&quot;, e introduzca el nuevo valor. Pulse el botón &quot;Ajustar valor real actual&quot;, y luego &quot;Guardar&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Maquillaje perfil de ajuste de gas. <ol start="7"><li> Relación de grabación de isótopo deseado óxido vs. Hacer una segunda inyección de 450 l de solución de sintonización. En la ficha Parámetros, seleccione &quot;Time&quot; en el menú desplegable, vamos start = 0, final = 10, valor de paso = 1, el tiempo de establecimiento = 200. Pulse el botón &quot;guardar&quot;. Haga clic en &quot;play&quot; en Masa (s) por la lectura ventana. Después de que las líneas se han estabilizado (Figura 7), utilice el cursor para leer el valor en los cuadros superiores de la izquierda para Tm169 o Tb159 (valor superior) y también el &quot;Gd155&quot; valor (&lt;3% del valor más alto). Estos valores también se pueden guardar en un archivo de sintonización para referencia futura. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Medición de la intensidad de la señal de ajuste de solución después de la optimización gas actual y Maquillaje. <ol start="8"><li> La limpieza de sample circuito. Inyectar 3 ml de agua MilliQ a través del bucle de muestra, seguido por 500 l de solución de lavado DVS. Monitorear el progreso de la limpieza con el botón &quot;Ejecutar&quot; en la ficha Calibración de masas. Lavar hasta que la intensidad de las bandas (figura 4) empieza a disminuir, a continuación, siga por 3 ml de agua MilliQ y el monitor hasta que se establecen a niveles de fondo (Figura 3). </li></ol> 3. Muestras de servicio <ol><li> Abra la ventana de adquisición. Ajustes por defecto: hacer análisis = On-The-Fly, señal para el análisis de calibración = Dual, Dual Count = Datos. Reducción de ruido está activada. Cualquiera de estos puede cambiar si se desea. Introduzca el nombre del archivo. Todos los archivos deben ser guardados en el E :/ / unidad. </li><li> Ajuste de retardos de adquisición. Habrá un ligero retraso en el registro de eventos de células de aproximadamente 30 segundos debido a la longitud de la tubería entre el bucle de muestra y del nebulizador. Por lo tanto, la suma total de &quot;retardo de Adquisición&quot; y &quot;Detector stretardo de capacidad &quot;debe ser al menos 30 seg. retardo detector de estabilidad debe ser de al menos 20 seg. </li><li> Ajuste de la hora de recogida de datos. &quot;Tiempo de adquisición&quot; es el número de segundos que desea ejecutar su muestra. Llenar todo el bucle de muestra 450 l requeriría 600 segundos en completarse. Se sugiere que los 50-100 seg se añade al final del tiempo de ejecución para reducir al mínimo el arrastre de muestra. </li><li> La resuspensión de muestra. Para minimizar la acumulación de sales en la máquina, se sugiere que al menos dos lavados en agua MilliQ se realiza al final de la tinción de las células, seguido de una resuspensión final en agua MilliQ. El volumen de agua MilliQ para resuspender el sedimento de células pueden variar en función del número de células de partida y la recuperación de las células después del procedimiento de tinción entero. Un buen punto de partida es 10 6 (encender) células / ml. Después de la resuspensión, filtrar a través de un filtro de células para eliminar los agregados. </li><li> A partir de la muestra correr. Introduzca un nuevo nombre de archivo para la muestra actual.<html> Cambie la válvula de bucle muestra a &quot;LOAD&quot;, inyectar la muestra, vuelva a &quot;inyectar&quot;, después haga clic en &quot;Ejecutar&quot; en la ventana de adquisición. </li><li> Registro de acontecimientos celulares. Las células se representan en la ventana de instantáneas como las colecciones de las marcas horizontales en cada vertical isótopo marcador / canal (Figura 8). Mientras que el citómetro de masa puede registrar 1.000 células / sec, una mejor resolución entre los eventos celulares se obtiene normalmente a 300-500 células / sec. Esto corresponde a un promedio de ~ 1 célula / actualización de la pantalla. Puede tardar hasta 30 segundos antes de que el contador de eventos célula comienza a subir. Esto es debido a &quot;On-the-fly&quot; procesamiento de datos; no la información de eventos de células se pierde. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Ventana de adquisición durante ejemplo en ejecución, mostrando filas horizontales de manchas correspondientes a los elementos asociados con tres eventos celulares separadas.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ampliar la figura. <ol start="7"><li> Calidad de los eventos celulares. Observe cualquier fondo rayas en cada canal de isótopos, así como la velocidad de células de evento. El citómetro de masa reconoce un &quot;evento célula&quot; como un cierto aumento de señal por encima del fondo, por lo que la señal de fondo a partir de metal libre o no unido anticuerpo puede alterar el &quot;evento célula&quot; recuento. Además, ejecutando las células en una concentración demasiado alta puede causar un aumento en el número de eventos de doblete. Antecedentes puede ser disminuida por lavados adicionales o mayor dilución celular. Dobletes se puede minimizar mediante la dilución de células mayor, a costa de tiempo de ejecución mayor. </li><li> Acabado muestra adquisición de datos. Cuando el tiempo de adquisición se ha alcanzado, la recopilación de datos terminará. Habrá un poco de retraso antes de que una ventana pop-up con un &quot;OK&quot; aparece, de nuevo, esto se debe a &quot;On-the-Fly&quot; procesamiento de datos. Adquisición de las muestras también se puede parar Prematurely pulsando el botón &quot;Stop&quot;. En este caso, todos los eventos celulares ya inscritos serán contados y se transforma en archivos de salida. </li><li> La inyección de al menos 500 l de agua MilliQ entre cada muestra también ayuda a minimizar la contaminación de las muestras. </li></ol> 4. Limpieza de la máquina tras uso <ol><li> La solución de lavado. Después de que la muestra final se ejecuta y muestra el lazo de lavarse con agua, inyectar 450 l de solución de lavado en el circuito de la muestra. Controlar la liberación de metal libre en la ficha Calibración de masas de la ventana Configuración de adquisición de datos como en el paso 2,8 (Figura 9). Cuando la señal de metal libre comienza a disminuir, lavar con 3 ml de agua MilliQ y controlar los niveles de fondo hasta que se alcanzan. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Calibración de masas pestaña de la ventana, durante la limpieza post-carrera con solución de lavado DVS. Las rayas verticales en la región TOF 9800-11000 son etiqueta anticuerpo-isótopos que se están limpiando fuera de la máquina. Las rayas verticales alrededor TOF 11500 corresponden a los dos isótopos intercaladores IR. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . 5. Cierre de la Máquina <ol><li> En la ficha Controlador RFG de la ventana de configuración del instrumento, seleccione &quot;Detener Plasma&quot;. Cuando el procedimiento se haya completado, habrá una ventana emergente que le solicitará que retire el nebulizador. Pulse el botón &quot;OK&quot;. En la ficha canastilla para tarjetas, apague el calentador. Cerrar la válvula en el suministro de argón. </li><li> La eliminación del nebulizador. Retire el nebulizador de la cámara de pulverización tirando cuidadosamente hacia atrás. Desenrosque el tubo de introducción de muestra de 1,6 pasos y coloque a un lado. Desenrosque el maquillaje conexión de introducción de gas para aflojar un poco y luego tirar el nebulizador. Dejando el racor atornillado se reducen las probabilidades de losing el negro junta tórica de goma y de plástico blanco pieza cónica. </li><li> Limpieza del nebulizador. Dejen ambos puertos del nebulizador con 5% Citranox usando la jeringa y el tubo como en el paso 1,3. Tienda, cubierta, en 5% Citranox hasta el próximo uso. </li></ol>

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Los autores del trabajo, tanto en el Centro de Monitoreo inmunológico humano, un centro de servicio en la Universidad de Stanford que cobra tarifas a los usuarios únicamente para recuperar el costo de los ensayos, incluyendo citometría de masas.

Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este t?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CyTOF TM masa citómetro </td><td> DVS Ciencias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de lavado </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorhídrico en agua </td></tr><tr><td> Ajuste solución </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, ácido nítrico rastro </td></tr><tr><td> Eu que contienen perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> 201073 </td><td> Contiene los isótopos naturales de abundancia de la UE; granos suministrados a aproximadamente 1 millón / mL </td></tr><tr><td> Múltiples que contienen lantánidos (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - perlas de poliestireno </td><td> DVS Ciencias </td><td> Todavía no disponible en el mercado </td><td> Contiene abundancia natural de isótopos de lantánidos cotizadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima rastro de metal puro ICP-MS grado </td></tr><tr><td> El poliestireno de fondo redondo de tubo con células colador cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utiliza para filtrar las muestras de células antes de la inyección </td></tr><tr><td> Norma-Ject tuberkulin jeringa 1 ml </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> Norma-Ject-3 ml jeringa </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sin silicona, libre de látex </td></tr><tr><td> MilliQ agua </td><td></td><td></td><td> 18 mW agua pura; no debe ser almacenado en botellas de vidrio o plástico que han sido lavadas con detergente comercial (debido a sus altos niveles de bario presente). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> ácido detergente </td></tr><tr><td> Gas argón </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra alta </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. 1 En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. 2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay &quot;superposición espectral&quot; de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. 6-7 Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células. Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.

Siguiendo el protocolo anterior debe lograr cuatro cosas. En primer lugar, lo que permite suficiente tiempo de calentamiento para el citómetro de masas producirá un plasma caliente, estable necesaria para la formación óptima de la señal y óxido mínima. Segundo lavado adecuado del citómetro de masa con agua MilliQ y la solución de lavado DVS (Figura 9) ayudará a reducir los niveles de adsorción de metal a los tubos y otras partes de la máquina, lo que ayuda a reducir el fondo durante la adqui...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K vistas.  Stanford University. Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Una simple gota colgante celular Cultura Protocolo para la generación de esferoides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Investigación

Bioingeniería

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extracción de los lípidos celulares orientadas por dilución de isótopos estables análisis de espectrometría de cromatografía de líquidos-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Wide-field microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fluorescente de imágenes en un teléfono móvil

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Obtención de imágenes de tejidos biológicos por desorción ionización electrospray espectrometría de masas

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Preparación de la muestra Estrategias para Espectrometría de Masas de imágenes de modelos de cultivo celular en 3D

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Aislamiento de células tumorales de colon humanos primarios de tejidos quirúrgicos y cultivándolas Directamente en Elastic sustratos blandos de tracción Citometría

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Un protocolo para la Bioinspirada Diseño: Planta Sampler Sobre la base de erizo de mar Tiburón

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Todo el cuerpo de Espectrometría de Masas de imágenes por infrarrojos asistida por matriz de desorción láser de ionización electrospray (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...