Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence <em>in situ</em> Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Naval Research Laboratory

&Gamma;-&#x8C37;&#x6C28;&#x9170; (GGT) &#x662F;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5E95;&#x7269;&#x9176;&#x8C37;&#x80F1;&#x7518;&#x80BD;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4E2D;&#x53D1;&#x6325;&#x6838;&#x5FC3;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x662F;&#x836F;&#x7269;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;GGT &#x50AC;&#x5316; &gamma; &#x915E;&#x6350;&#x52A9;&#x886C;&#x5E95;&#x7684;&#x5288;&#x88C2;&#x548C; &gamma; &#x915E;&#x7ED3;&#x6784;&#x5411;&#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x886C;&#x5E95;&#x6216;&#x6C34;&#x80FA;&#x8F6C;&#x8BA9;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x7EC6;&#x83CC; GGT &#x7ED3;&#x6784;&#x6709;&#x63ED;&#x793A;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x914D;&#x4F53;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x5728;&#x6350;&#x52A9;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x4FE1;&#x606F;&#xFF0C;&#x76F8;&#x5BF9;&#x672A;&#x5B9A;&#x4E49;&#x627F;&#x5151;&#x57FA;&#x677F;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x6700;&#x8FD1;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x7269;&#x79CD;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x53D7;&#x4F53;&#x7F51;&#x7AD9;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#xFF0C;OU749&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x53EF;&#x80FD;&#x6BD4;&#x8C37;&#x6C28;&#x9170;&#x80FA;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7269;&#x7684;&#x6BD2;&#x6027;&#x8F83;&#x4F4E;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x70AD;&#x75BD;&#x82BD;&#x5B62; GGT (&#x8179;&#x819C;) &#x7684;&#x4F9B;&#x3001; &#x53D7;&#x4F53;&#x57FA;&#x677F;&#x504F;&#x597D;&#x548C;&#x5E94;&#x7528;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x6765;&#x63A2;&#x7D22;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x7684;&#x5E95;&#x7269;&#x548C;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7279;&#x70B9;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x57FA;&#x7840;&#x3001; &#x6BD4;&#x8F83;&#x5B83;&#x4EEC;&#x4E0E;&#x4EBA;&#x7C7B; GGT &#x7ED3;&#x5408;&#x7684;&#x8BA1;&#x7B97;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x5B9A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x7814;&#x7A76;&#x8868;&#x660E; R432A &#x548C; R520S &#x53D8;&#x79CD;&#x5206;&#x522B;&#x5C55;&#x51FA; 6 95 &#x500D;&#x8DCC;&#x5E45;&#x6C34;&#x89E3;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x548C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x4E0D;&#x523A;&#x6FC0;&#x7684; l-&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x627F;&#x5151;&#x57FA;&#x677F;&#xFF0C;&#x52A0;&#x6697;&#x793A;&#x989D;&#x5916;&#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;/&#x6216; transpeptidation &#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5927;&#x9F20; GGT (&#x548C;&#x5927;&#x6982;&#x662F; HuGGT) &#x6709;&#x4E25;&#x683C;&#x4E8C;&#x886C;&#x5E95; l &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x9178;&#x53D7;&#x4F53;&#xFF0C;&#x800C;&#x8179;&#x819C;&#x900F;&#x6790;&#x53EF;&#x4EE5;&#x540C;&#x7B49;&#x5229;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A; l &#x548C; d &#x627F;&#x5151;&#x886C;&#x5E95;&#x3002;&#x5EFA;&#x6A21;&#x4E0E;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E; R520 &#x548C; R432 &#x5141;&#x8BB8;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5907;&#x7528;&#x627F;&#x5151;&#x57FA;&#x677F;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4E3A; l &#x548C; d &#x53D7;&#x4F17;&#x3002;R432 &#x88AB;&#x5B88;&#x6052;&#x7684;&#x4E2D;&#x571F;&#x62C9;&#x5F17;&#x3001; &#x9F20;&#x75AB;&#x8036;&#x5C14;&#x68EE;&#x83CC;&#x3001; &#x7C7B;&#x9F3B;&#x75BD;&#x4F2F;&#x3001; &#x5E7D;&#x95E8;&#x87BA;&#x6746;&#x83CC;&#x548C;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x5728;&#x4EBA;&#x7C7B; GGT&#x3002;&#x575E;&#x7AD9;&#x548C; MD &#x6A21;&#x62DF;&#x6307;&#x5411;&#x4F5C;&#x51FA;&#x8D21;&#x732E;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x6B8B;&#x7559;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x548C;&#x53D7;&#x4F53;&#x57FA;&#x6750;&#x7684;&#x7C98;&#x5408;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x65B0;&#x9896;&#x548C;&#x6291;&#x5236;&#x5242; GGT &#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x6307;&#x5357;&#x3002;

&#x63A2;&#x6D4B;&#x7684;&#x6350;&#x52A9;&#x548C; &gamma;-&#x8C37;&#x6C28;&#x9170;&#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x5E95;&#x7269;&#x4E13;&#x4E00;&#x6027;&#x3002;

Î³-Glutamyl transpeptidase (GGT) is a two-substrate enzyme that plays a central role in glutathione metabolism and is a potential target for drug design. GGT catalyzes the cleavage of Î³-glutamyl donor substrates and the transfer of the Î³-glutamyl moiety to an amine of an acceptor substrate or water. Although structures of bacterial GGT have revealed details of the protein-ligand interactions at the donor site, the acceptor substrate site is relatively undefined. The recent identification of a species-specific acceptor site inhibitor, OU749, suggests that these inhibitors may be less toxic than glutamine analogues. Here we investigated the donor and acceptor substrate preferences of Bacillus anthracis GGT (CapD) and applied computational approaches in combination with kinetics to probe the structural basis of the enzyme's substrate and inhibitor binding specificities and compare them with human GGT. Site-directed mutagenesis studies showed that the R432A and R520S variants exhibited 6- and 95-fold decreases in hydrolase activity, respectively, and that their activity was not stimulated by the addition of the l-Cys acceptor substrate, suggesting an additional role in acceptor binding and/or catalysis of transpeptidation. Rat GGT (and presumably HuGGT) has strict stereospecificity for l-amino acid acceptor substrates, while CapD can utilize both l- and d-acceptor substrates comparably. Modeling and kinetic analysis suggest that R520 and R432 allow two alternate acceptor substrate binding modes for l- and d-acceptors. R432 is conserved in Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei, Helicobacter pylori and Escherichia coli, but not in human GGT. Docking and MD simulations point toward key residues that contribute to inhibitor and acceptor substrate binding, providing a guide to designing novel and specific GGT inhibitors.

Probing the Donor and Acceptor Substrate Specificity of the Î³-Glutamyl Transpeptidase.

&Gamma;-Glutamyl transpeptidase (GGT) est une enzyme de deux substrats qui joue un r&ocirc;le central dans le m&eacute;tabolisme du glutathion et est une cible potentielle pour la conception de m&eacute;dicaments. GGT catalyse le clivage de la &gamma;-glutamyl substrats de donneurs et le transfert de la portion de la &gamma;-glutamyl &agrave; une amine d&#39;un substrat accepteur ou d&#39;eau. Bien que les structures de la GGT bact&eacute;rienne ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; des d&eacute;tails des interactions prot&eacute;ine-ligand du site donneur, le site de substrat accepteur est relativement non d&eacute;fini. L&#39;identification r&eacute;cente d&#39;un inhibiteur du site accepteur propres &agrave; chaque esp&egrave;ce, OU749, sugg&egrave;re que ces inhibiteurs peuvent &ecirc;tre moins toxiques que les analogues de la glutamine. Ici, nous avons &eacute;tudi&eacute; les pr&eacute;f&eacute;rences de substrat donneur et accepteur de Bacillus anthracis GGT (CapD) et appliquer des approches computationnelles en combinaison avec une cin&eacute;tique pour sonder la structure de base du substrat et des sp&eacute;cificit&eacute;s inhibiteur de l&#39;enzyme et les comparer avec GGT humaine. &Eacute;tudes de mutagen&egrave;se dirig&eacute;e que les variantes R432A et R520S ont 6 et 95 fois diminue l&#39;activit&eacute; hydrolase, respectivement, et que leur activit&eacute; n&#39;est pas stimul&eacute;e par l&#39;addition du substrat accepteur l-Cys, sugg&eacute;rant un r&ocirc;le suppl&eacute;mentaire dans la liaison accepteur ou catalyse de transpeptidation. Rat GGT (et sans doute le HuGGT) a st&eacute;r&eacute;osp&eacute;cificit&eacute; stricte pour les substrats de l&#39;accepteur d&#39;acide l-amin&eacute;, tandis que la DPCA peut utiliser les deux substrats l - et d-accepteur comparable. Mod&eacute;lisation et cin&eacute;tique analyse sugg&egrave;rent que R520 et R432 permettent deux modes de liaison substrat accepteur alternatif pour l - et d-accepteurs. R432 est conserv&eacute;e &agrave; Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei, Helicobacter pylori et Escherichia coli, mais pas dans les GGT humaine. Docking et des simulations de MD point vers des r&eacute;sidus cl&eacute;s qui contribuent &agrave; l&#39;inhibiteur et de liaison du substrat accepteur, fournissant un guide pour la conception d&#39;inhibiteurs sp&eacute;cifiques de la GGT et de roman.

Sonder les donateurs et la sp&eacute;cificit&eacute; de substrat accepteur de la &gamma;-Glutamyl Transpeptidase.

&Gamma;-Glutamyl-Transpeptidase (GGT) ist ein zwei-Substrat-Enzym, das spielt eine zentrale Rolle im Glutathion-Stoffwechsel und ist ein potenzielles Ziel f&uuml;r Wirkstoffdesign. GGT katalysiert die Spaltung von &gamma;-Glutamyl-Spender-Substrate und die &Uuml;bertragung der &gamma;-Glutamyl-Gruppe auf ein Amin ein Akzeptor Substrat oder Wasser. Obwohl die Strukturen der bakteriellen GGT Details der Protein-Ligand-Interaktionen an der Entnahmestelle gezeigt haben, ist die Akzeptor-Substrat-Website relativ undefiniert. Die j&uuml;ngste Identifizierung eine artspezifische Akzeptor-Website-Inhibitor, OU749, deutet darauf hin, dass diese Inhibitoren m&ouml;glicherweise weniger toxisch als Glutamin-Analoga. Hier untersuchten wir die Spender und Akzeptor-Substrat-Pr&auml;ferenzen der Bacillus Anthracis GGT (CapD) und computational Ans&auml;tze in Kombination mit Kinetik sucht die strukturelle Grundlage f&uuml;r des Enzyms-Substrat und Inhibitor Bindung Besonderheiten und vergleichen sie mit menschlichen GGT angewendet. Site-verwiesene Mutagenese Studien zeigten, dass die R432A und R520S Varianten 6 und 95 8-fach R&uuml;ckgang Hydrolase-Aktivit&auml;t, bzw. ausgestellt, und dass ihre T&auml;tigkeit nicht durch Zugabe von l-Cys Akzeptor Substrats, angeheizt wurde vorgeschlagen eine zus&auml;tzliche Rolle in Akzeptor-Bindung und/oder Katalyse des Transpeptidation. Ratte GGT (und vermutlich HuGGT) hat strenge Stereospecificity f&uuml;r l-Aminos&auml;ure saure Akzeptor Substrate, w&auml;hrend CapD vergleichsweise beide l und d-Akzeptor-Substrate nutzen kann. Modellierung und kinetische Analyse zufolge R520 und R432 zwei Alternativen Akzeptor-Substrat-Bindungsmodi f&uuml;r l und d-Acceptors erm&ouml;glichen. R432 ist in Francisella Tularensis, Yersinia Pestis, Burkholderia Mallei, Helicobacter Pylori und Escherichia coli, aber nicht in menschlichen GGT konserviert. Docken und MD Simulationen zeigen in Richtung wichtige R&uuml;ckst&auml;nde, die beitragen Inhibitor und Akzeptor Substrat Bindung, die eine Anleitung zum Entwerfen von Roman und bestimmten GGT-Inhibitoren.

Sondierung der Donor und Akzeptor Substratspezifit&auml;t der &gamma;-Glutamyl-Transpeptidase.

&Gamma;-glutamil transpeptidasi (GGT) sono un due-substrato enzima che svolge un ruolo centrale nel metabolismo del glutatione ed &egrave; un potenziale bersaglio per disegno della droga. GGT catalizza il clivaggio della &gamma;-glutamil substrati donatori e trasferire la frazione &gamma;-glutamil di un&#39;ammina di un substrato accettore o acqua. Anche se le strutture di GGT batteriche hanno rivelato i dettagli delle interazioni proteina-ligando presso il sito donatore, il sito di substrato accettore &egrave; relativamente indefinito. La recente identificazione di un inibitore del sito accettore apetti, OU749, suggerisce che questi inibitori possono essere meno tossici rispetto ad analoghi di glutammina. Qui abbiamo studiato le preferenze di substrato donatore e accettore di Bacillus anthracis GGT (CapD) e applicare approcci computazionali in combinazione con cinetica per sondare la base strutturale del substrato dell&#39;enzima e specificit&agrave; di legame inibitore e li confronta con GGT umana. Studi di mutagenesi luogo-diretta ha dimostrati che le varianti R432A e R520S esposto 6 - 95 volte diminuzioni nell&#39;attivit&agrave; di idrolasi, rispettivamente, e che loro attivit&agrave; non &egrave; stata stimolata tramite l&#39;aggiunta del substrato accettore l-Cys, suggerendo un ruolo supplementare in associazione accettore e/o catalisi di transpeptidation. Ratto GGT (e presumibilmente HuGGT) ha stereospecificit&agrave; rigorosa per substrati l-amino acido accettore, mentre CapD pu&ograve; utilizzare entrambi substrati l - e d-accettore in modo paragonabile. Analisi cinetica e modellazione suggeriscono che R520 e R432 consentono modalit&agrave; di associazione di due alternative accettore substrato per l - e d-accettori. R432 &egrave; conservato in Francisella tularensis, Yersinia pestis, Burkholderia mallei, Helicobacter pylori ed Escherichia coli, ma non in GGT umana. Docking e simulazioni MD punto verso residui chiave che contribuiscono a inibitore e l&#39;associazione di substrato accettore, fornendo una guida per la progettazione di specifici inibitori GGT e romanzo.

Sondaggio del donatore e la specificit&agrave; di substrato accettore di &gamma;-glutamil transpeptidasi.

&Gamma; - &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC; &#xFF08;GGT&#xFF09; &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x306E;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x7684;&#x306A;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x85AC;&#x5264;&#x8A2D;&#x8A08;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x3042;&#x308B; 2 &#x57FA;&#x677F;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3059;&#x3002;GGT &gamma;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB; &#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x958B;&#x88C2;&#x3068; &gamma;-&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x57FA;&#x306E;&#x8EE2;&#x9001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x57FA;&#x677F;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6C34;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E; GGT &#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x57FA;&#x677F;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306F;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3002;OU749, &#x7A2E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x540C;&#x5B9A;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x304C;&#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30F3;&#x985E;&#x7E01;&#x4F53;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x6709;&#x6BD2;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x57FA;&#x677F;&#x597D;&#x307F;&#x306E;&#x70AD;&#x75BD; GGT (CapD) &#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x305F;&#x3068;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x3068;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x7D50;&#x5408;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x57FA;&#x76E4;&#x3092;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3057;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; GGT &#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x8AD6;&#x3068;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3066;&#x8A08;&#x7B97;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x6307;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5C55;&#x793A; 6 &#x301C; 95 &#x500D;&#x6E1B;&#x5C11;&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x9175;&#x7D20;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C; R432A &#x3068; R520S &#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3057;&#x3001;l &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3; &#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x4ED8;&#x52A0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F7C;&#x3089;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x3092;&#x523A;&#x6FC0;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306F;&#x8FFD;&#x52A0;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB; &#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF; &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;/&#x307E;&#x305F;&#x306F; transpeptidation &#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;CapD &#x5BFE;&#x7B49;&#x4E21;&#x65B9; l &#x3068; d &#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x57FA;&#x677F;&#x3092;&#x4F7F;&#x3044;&#x3053;&#x306A;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8; GGT (&#x304A;&#x305D;&#x3089;&#x304F; HuGGT) l &#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x57FA;&#x677F;&#x4E0A;&#x306E;&#x53B3;&#x683C;&#x306A;&#x7570;&#x6027;&#x3057;&#x305F;.&#x30E2;&#x30C7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30FB;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x7684;&#x89E3;&#x6790; R520 &#x3068; R432 2 &#x3064;&#x4EE3;&#x66FF;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0; &#x30E2;&#x30FC;&#x30C9;&#x306E; l &#x3068; d &#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x304A;&#x52E7;&#x3081;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;R432 &#x306F;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E; GGT &#x3067;&#x306F;&#x91CE;&#x514E;&#x30DA;&#x30B9;&#x30C8;&#x83CC;&#x3001;&#x30A4;&#x30CD;&#x306E;&#x9F3B;&#x3001;&#x30D4;&#x30ED;&#x30EA;&#x83CC;&#x3001;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x3001;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C9;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x8CA2;&#x732E;&#x306B;&#x5411;&#x3051;&#x3066;&#x30AD;&#x30FC;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306F;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x57FA;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x3001;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x3068;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E; GGT &#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x8A2D;&#x8A08;&#x306B;&#x30AC;&#x30A4;&#x30C9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3092;&#x30DD;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC; &gamma; - &#x30B0;&#x30EB;&#x30BF;&#x30DF;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C0;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3092;&#x63A2;&#x308B;&#x3002;

&Gamma; Glutamyl transpeptidase (GGT) glutathione &#xB300;&#xC0AC;&#xC5D0; &#xD575;&#xC2EC;&#xC801;&#xC778; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558; &#xACE0; &#xB9C8;&#xC57D; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xB300;&#xC0C1; 2 &#xAE30;&#xD310; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC774;&#xB2E4;. GGT catalyzes &gamma; glutamyl &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xC808;&#xB2E8;, &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xB610;&#xB294; &#xBB3C; &#xC544;&#xBBFC;&#xC73C;&#xB85C; &gamma; glutamyl moiety &#xC804;&#xC1A1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC138;&#xADE0;&#xC131; GGT&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;-ligand &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC138;&#xBD80; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C;&#xB294;, &#xBE44;&#xB85D; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC815;&#xC758; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC885;&#xC758; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;, OU749, &#xCD5C;&#xADFC; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xAE00;&#xB8E8;&#xD0C0;&#xBBFC; analogues &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB35C; &#xB3C5;&#xC131; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB098;&#xC654;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xADE0; &#xB4E4;&#xC740; GGT (CapD)&#xC758; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC640; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xC120;&#xD638; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558; &#xACE0; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xAE30;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558; &#xACE0; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; GGT&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558;&#xB294; &#xC18D;&#xB3C4; &#xD568;&#xAED8; &#xACC4;&#xC0B0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC801;&#xC6A9;. &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC2DC; &#xB41C; mutagenesis &#xC5F0;&#xAD6C; R432A &#xBC0F; R520S &#xBCC0;&#xD615; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xD6A8;&#xC18C; &#xD65C;&#xB3D9;, 6&#xACFC; 95 &#xBC30; &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xAC01;&#xAC01; &#xC804;&#xC2DC; &#xD588;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9; l Cys &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310;&#xC758; &#xCD94;&#xAC00; &#xC758;&#xD574; &#xC790;&#xADF9; &#xD558;&#xC9C0;&#xB294; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC0F; transpeptidation &#xCD09;&#xB9E4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD94;&#xAC00; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC81C;&#xC548;. &#xC950; GGT (&#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC544;&#xB9C8;&#xB3C4; HuGGT)&#xC740; l-&#xC544;&#xBBF8;&#xB178; &#xC0B0; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5C4;&#xACA9;&#xD55C; stereospecificity CapD comparably l&#xACFC; d &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xBAA8;&#xB450;&#xB97C; &#xC774;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB378;&#xB9C1; &#xBC0F; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xBD84;&#xC11D; r520&#xC640; R432 &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xB300;&#xCCB4; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBAA8;&#xB4DC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; l&#xACFC; d &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xC218; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. R432 Burkholderia mallei Francisella tularensis, Yersinia pestis, &#xD5EC;&#xB9AC;&#xCF54;&#xBC15;&#xD130; &#xD30C;&#xC77C;&#xB85C;&#xB9AC;, &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0;, &#xC778;&#xAC04;&#xC758; GGT&#xC5D0;&#xB9CC; &#xBCF4;&#xC874; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3C4;&#xD0B9; &#xBC0F; MD &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xC640; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xD310; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;, &#xC18C;&#xC124; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC815; GGT &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xC124;&#xACC4; &#xAC00;&#xC774;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xAE30;&#xC5EC; &#xD558;&#xB294; &#xC8FC;&#xC694; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xAC00;&#xB9AC;&#xD0A4;&#xACE0; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC640; &gamma; Glutamyl Transpeptidase&#xC758; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; &#xAE30;&#xC9C8; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xD504;&#xB85C; &#xBE59;.

&Gamma;-glutamil transpeptidasa (GGT) es una enzima substrato-dos que desempe&ntilde;a un papel central en el metabolismo del glutati&oacute;n y es un blanco potencial para el dise&ntilde;o de f&aacute;rmacos. GGT cataliza la ruptura de &gamma;-glutamil sustratos de donantes y la transferencia de la mol&eacute;cula de &gamma;-glutamil a una amina de un sustrato aceptor o agua. Aunque las estructuras de GGT bacteriana han revelado detalles de las interacciones prote&iacute;na-ligando en el sitio donante, el sitio del aceptador sustrato es relativamente indefinido. La reciente identificaci&oacute;n de un inhibidor del sitio aceptor propios de cada especie, OU749, sugiere que estos inhibidores pueden ser menos t&oacute;xicos que los an&aacute;logos de la glutamina. Aqu&iacute; investigamos las preferencias de sustrato donador y aceptor de Bacillus anthracis GGT (CapD) y aplicar enfoques computacionales en combinaci&oacute;n con cin&eacute;tica para sondear las bases estructurales de sustrato y especificidades de atascamiento de inhibidor de la enzima y compararlos con GGT humana. Estudios de mutag&eacute;nesis sitio-dirigida demostrados que las variantes R432A y R520S exhibieron 6 y 95 veces disminuciones en la actividad hidrolasa, respectivamente, y que su actividad no fue estimulada por la adici&oacute;n del sustrato aceptor de l-Cys, sugiriendo un papel adicional en enlace aceptador o cat&aacute;lisis de transpeptidation. GGT de rata (y probablemente HuGGT) tienen estricto stereospecificity sustratos aceptador de &aacute;cido l-amino, mientras que la CapD puede utilizar ambos sustratos de l - y d-aceptador comparable. An&aacute;lisis cin&eacute;tico y modelado sugieren que R520 y R432 permiten dos modos de enlace de sustrato aceptor alterno para l - y d-aceptadores. R432 se conserva en la Francisella tularensis, Escherichia coli, Yersinia pestis, Burkholderia mallei y Helicobacter pylori, pero no en humano GGT. Docking y simulaciones apuntan hacia residuos claves que contribuyen a inhibidor y atascamiento de sustrato aceptor, proporcionando a una gu&iacute;a para dise&ntilde;ar novela e inhibidores espec&iacute;ficos de la GGT.

Sondeo el donante y la especificidad de sustrato aceptor de la &gamma;-glutamil transpeptidasa.

Etichettatura fluorescente di RNA biologico &egrave; complicata dalla ristretta gamma di trifosfati del nucleoside che pu&ograve; essere utilizzato per la sintesi biologica (cio&egrave;, trascrizione) cos&igrave; come l&#39;incapacit&agrave; di site-specifically incorporarli in trascrizioni di RNA lunghe. Strategie non covalenti per l&#39;etichettatura di RNA si basano su associare tinture fluorescenti di sonde di ibridazione che consegnano il colorante per una regione specifica del RNA attraverso base pairing di Watson-Crick. Questa relazione illustra l&#39;uso di sonde di acidi nucleici (PNA) ad alta affinit&agrave; del peptide in etichettatura trascritti di mRNA con donatore thiazole orange e Alexa-594 accettore fluorofori. Le sonde PNA sono state mirate alle sequenze fiancheggianti siti di splicing in un pre-mRNA che prima lo splicing del PNAs erano separati da &amp;gt; 300 nucleotidi (nts) mentre dopo splicing della separazione sono diminuiti a &lt; o = 12 nts. La separazione &egrave; diminuita ha portato alla maggiore F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) per il RNA impiombato. Massa soluzione e singola molecola fluorescenza esperimenti hanno dato risultati coerenti.

PNA fluorescente sonde come etichette di ibridazione per RNA biologica.

&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNA &#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210; &#xFF08;&#x3059;&#x306A;&#x308F;&#x3061;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#xFF09; &#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30B7;&#x30C9;&#x4E09;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x306E;&#x72ED;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3067;&#x7C73;&#x6751;&#x9577;&#x3044; RNA &#x306E;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x306B;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x306A;&#x3044;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x8907;&#x96D1;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;RNA &#x306E;&#x5206;&#x985E;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5171;&#x6709;&#x7684;&#x6226;&#x7565;&#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x67D3;&#x6599;&#x30EF;&#x30C8;&#x30BD;&#x30F3;-&#x30AF;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x57FA;&#x672C;&#x30DA;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x901A;&#x3058;&#x3066; RNA &#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4EA4;&#x914D;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306B;&#x30A2;&#x30BF;&#x30C3;&#x30C1;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x306B;&#x306F; mrna &#x30C1;&#x30A2;&#x30BE;&#x30FC;&#x30EB; &#x30AA;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B8; &#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068; Alexa 594 &#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF; fluorophores &#x3068;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x9AD8;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x6838;&#x9178; (PNA) &#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;PNA &#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x306F; mRNA &#x306E;&#x30B9;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306F; PNAs &#x306E;&#x30B9;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x524D;&#x306B;&#x3001;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x4E26;&#x3076;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x76EE;&#x6A19;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x76EE; 300 &#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9; (nts) &#x30B9;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x5F8C;&#x5206;&#x96E2;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057; &lt; &#x307E;&#x305F;&#x306F; = 12 &#x56FD;&#x7A0E;&#x5E81;&#x3002;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x306F;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5; (FRET) &#x30B9;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E; rna &#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x62EC;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3068;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x86CD;&#x5149;&#x5B9F;&#x9A13;&#x4E00;&#x8CAB;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308B;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;

&#x86CD;&#x5149; PNA &#x4EA4;&#x914D;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x751F;&#x7269;&#x306E; RNA &#x3092;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x751F;&#x7269; RNA &#x88AB;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x8303;&#x56F4;&#x7A84;&#x7684;&#x6838;&#x82F7;&#x7C7B; triphosphates&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210; (&#x5373;&#x8F6C;&#x5F55;&#xFF09; &#x4EE5;&#x53CA;&#x65E0;&#x6CD5;&#x5B9A;&#x70B9;&#x5C06;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7EB3;&#x5165;&#x957F; RNA &#x6210;&#x7EE9;&#x5355;&#x3002;&#x7528;&#x4E8E;&#x6807;&#x8BB0; RNA &#x7684;&#x975E;&#x5171;&#x4EF7;&#x6218;&#x7565;&#x4F9D;&#x9760;&#x9644;&#x52A0;&#x5230;&#x6742;&#x4EA4;&#x63A2;&#x9488;&#x5411;&#x6C83;&#x68EE;-&#x514B;&#x91CC;&#x514B;&#x57FA;&#x914D;&#x5BF9;&#x901A;&#x8FC7; RNA &#x7684;&#x7279;&#x5B9A;&#x533A;&#x57DF;&#x63D0;&#x4F9B;&#x8FD9;&#x79CD;&#x67D3;&#x6599;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x3002;&#x8FD9;&#x4EFD;&#x62A5;&#x544A;&#x6F14;&#x793A;&#x5982;&#x4F55;&#x4F7F;&#x7528;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#x80BD;&#x6838;&#x9178; (PNA) &#x63A2;&#x9488;&#x5728;&#x4E0E;&#x567B;&#x5511;&#x6A59;&#x6350;&#x52A9;&#x56FD;&#x548C; Alexa 594 &#x627F;&#x5151;&#x4EBA;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0; mRNA &#x8A8A;&#x672C;&#x3002;PNA &#x63A2;&#x9488;&#x5C06;&#x76EE;&#x6807;&#x5BF9;&#x51C6;&#x4FA7;&#x7FFC; pre mRNA &#x5728;&#x63A5;&#x5934;&#x5730;&#x70B9;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x6837;&#x62FC;&#x63A5; PNAs &#x4E4B;&#x524D;&#x88AB;&#x9694;&#x5F00;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217; &gt; 300 &#x6838;&#x82F7;&#x9178; (&#x5357;) &#x800C;&#x62FC;&#x63A5;&#x540E;&#x5206;&#x79BB;&#x4E0B;&#x964D;&#x81F3; &lt; &#x6216; = 12 &#x5357;&#x3002;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x5206;&#x79BB;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x589E;&#x5F3A; F&ouml;rster &#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB; &#xFF08;&#x97F3;&#x54C1;&#xFF09; &#x4E3A;&#x62FC;&#x63A5;&#x7684; RNA&#x3002;&#x5927;&#x5BB9;&#x91CF;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x548C;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x8367;&#x5149;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x81F4;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;

&#x80BD;&#x6838;&#x9178;&#x8367;&#x5149;&#x63A2;&#x9488;&#x6742;&#x4EA4;&#x6807;&#x7B7E;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x751F;&#x7269; RNA&#x3002;

Fluorescent labeling of biological RNA is complicated by the narrow range of nucleoside triphosphates that can be used for biological synthesis (i.e., transcription) as well as the inability to site-specifically incorporate them into long RNA transcripts. Noncovalent strategies for labeling RNA rely on attaching fluorescent dyes to hybridization probes which deliver the dye to a specific region of the RNA through Watson-Crick base pairing. This report demonstrates the use of high-affinity peptide nucleic acid (PNA) probes in labeling mRNA transcripts with thiazole orange donor and Alexa-594 acceptor fluorophores. The PNA probes were targeted to sequences flanking splice sites in a pre-mRNA such that before splicing the PNAs were separated by >300 nucleotides (nts) whereas after splicing the separation decreased to <or=12 nts. The decreased separation led to enhanced FÃ¶rster resonance energy transfer (FRET) for the spliced RNA. Bulk solution and single-molecule fluorescence experiments gave consistent results.

Fluorescent PNA probes as hybridization labels for biological RNA.

Marquage fluorescent d&#39;ARN biologique est compliqu&eacute;e par l&#39;&eacute;ventail &eacute;troit des nucl&eacute;osides triphosphates qui peut &ecirc;tre utilis&eacute; pour la synth&egrave;se biologique (p. ex., transcription) ainsi que l&#39;incapacit&eacute; de les incorporer relativement longs ARN transcrits. Strat&eacute;gies non covalentes pour l&#39;&eacute;tiquetage RNA s&#39;appuient sur la fixation des colorants fluorescents &agrave; des sondes d&#39;hybridation qui fournissent la teinture &agrave; une r&eacute;gion sp&eacute;cifique de l&#39;ARN par le biais de l&#39;appariement Watson-Crick base. Ce rapport illustre l&#39;utilisation de sondes d&#39;acide nucl&eacute;ique (PNA) peptide de haute affinit&eacute; dans l&#39;&eacute;tiquetage des ARNm avec donneur thiazole orange et fluorophores accepteurs Alexa-594. Les sondes de l&#39;ANP ont &eacute;t&eacute; cibl&eacute;s aux s&eacute;quences flanquant les sites d&#39;&eacute;pissage dans un pr&eacute;-ARNm tels qu&#39;avant les PNAs d&#39;&eacute;pissage &eacute;taient s&eacute;par&eacute;s par &gt; 300 nucl&eacute;otides (nts) tandis qu&#39;apr&egrave;s &eacute;pissage la s&eacute;paration diminue &agrave; &lt; ou = 12 nts. La s&eacute;paration r&eacute;duite conduit &agrave; am&eacute;lior&eacute; transfert d&#39;&eacute;nergie par r&eacute;sonance F&ouml;rster (FRET) pour l&#39;ARN &eacute;piss&eacute;. Vrac solution et mol&eacute;cules simples exp&eacute;riences de fluorescence a donn&eacute; des r&eacute;sultats coh&eacute;rents.

PNA fluorescent sondes sous forme d&#39;&eacute;tiquettes d&#39;hybridation biologiques ARN.

Fluoreszierende Kennzeichnung von biologischen RNA wird erschwert durch den schmalen Bereich der Nukleosid-Triphosphate, die f&uuml;r biologische Synthese (z. B. Transkription) verwendet werden k&ouml;nnen sowie die Unf&auml;higkeit, ortspezifisch sie in langen RNA-Transkripte zu integrieren. Strategien zum Beschriften von RNA beruhen auf Anf&uuml;gen Leuchtstofff&auml;rbungen an Hybridisierungssonden, die einer bestimmten Region der RNA Watson-Crick base Pairing den Farbstoff liefern. Dieser Bericht veranschaulicht die Verwendung von hoher Affinit&auml;t Peptid-Nukleins&auml;ure (PNA) Sonden in der Kennzeichnung von mRNA Transkripte mit thiazol orange Spender und Alexa-594 Akzeptor Fluorophore. Die PNA-Sonden wurden gezielt an Sequenzen flankierenden Splei&szlig;-Websites in einem Pre-mRNA, so dass vor dem Splei&szlig;en der PNAs durch getrennt waren &gt; 300 Nukleotiden (Nts) w&auml;hrend nach Splei&szlig;en die Trennung auf verringert &lt; oder = 12 Nts. Die verminderte Trennung f&uuml;hrte zu verbesserte F&ouml;rster Resonanz Energietransfer (FRET) f&uuml;r die gesplei&szlig;te RNA. Massen-L&ouml;sung und Einzelmolek&uuml;l-Fluoreszenz-Experimente gab konsistente Ergebnisse.

Fluoreszierende PNA Sonden als Hybridisierung Bezeichnungen f&uuml;r biologische RNA.

&#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; RNA&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xB77C;&#xBCA8; site-specifically &#xAE34; RNA &#xC131;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC744; &#xD1B5;&#xD569; &#xD558;&#xB294; &#xBB34; &#xB2A5;&#xB825; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xD569;&#xC131; (&#xC989;, &#xD544; &#xC0AC;)&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB274; &#xD074;&#xB808; &#xC624; &#xC2DC;&#xB4DC; triphosphates&#xC758; &#xC881;&#xC740; &#xBC94;&#xC704; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. RNA&#xB97C; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; noncovalent &#xC804;&#xB7B5; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC; &#xC5FC;&#xC0C9; &#xC653;&#xC2A8; &#xD06C;&#xB9AD; &#xAE30;&#xBCF8; &#xD398;&#xC5B4;&#xB9C1; &#xD1B5;&#xD574; RNA&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xB294; &#xAD50; &#xC7A1; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xB294; &#xC624;&#xB80C;&#xC9C0; thiazole &#xAE30;&#xC99D;&#xC790;&#xC640; &#xC54C; &#xB809; &#xC0AC;-594 &#xC218;&#xB77D;&#xC790; fluorophores mRNA &#xC131;&#xC801;&#xD45C;&#xB97C; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC5D0; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC; &#xD575; &#xC0B0; (PNA) &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. PNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC0AC;&#xC804; Mrna&#xC5D0; &#xBD99;&#xC5EC; &#xC11C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB294; PNAs &#xC811;&#xD569; &#xD558;&#xAE30; &#xC804;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBD84;&#xB9AC; &#xB410;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB7F0; &#xCE21;&#xBA74;&#xC744; &#xD45C;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4; &amp;gt; 300 &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; (nts) &#xC811;&#xD569; &#xD6C4; &#xBD84;&#xB9AC;&#xB97C; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; &lt; &#xB610;&#xB294; = 12 &#xAD6D;&#xC138;&#xCCAD;. &#xAC10;&#xC18C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; F&ouml;rster &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; (FRET) &#xC811;&#xD569;&#xB41C; RNA &#xC774;&#xB04C;&#xC5B4; &#xB0C8;&#xB2E4;. &#xB300;&#xB7C9; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790; &#xD615;&#xAD11; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC77C;&#xAD00; &#xB41C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;.

&#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; RNA&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC758; &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xB85C; &#xD615;&#xAD11; PNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;.

Etiquetado fluorescente de ARN biol&oacute;gica es complicado por la poca variedad de trifosfatos de nucle&oacute;sidos que puede ser utilizado para la s&iacute;ntesis biol&oacute;gica (es decir, transcripci&oacute;n) as&iacute; como la incapacidad para incorporarlos site-specifically largos transcritos de RNA. Estrategias no covalente para el etiquetado de RNA se basan en fijar tintes fluorescentes para sondas de hibridaci&oacute;n que entregan el tinte a una regi&oacute;n espec&iacute;fica del ARN a trav&eacute;s de Watson-Crick base que se aparea. Este informe demuestra el uso de sondas de &aacute;cidos nucleicos (PNA) de p&eacute;ptido de alta afinidad en las transcripciones mRNA con donantes de tiazol naranja y Alexa-594 aceptador fluor&oacute;foros. Las sondas PNA fueron dirigidas a secuencias que flanquean sitios de empalme en un pre-mRNA que antes de empalmar las PNAs se separaron por &gt; 300 nucle&oacute;tidos (nts) mientras que despu&eacute;s de empalmar la separaci&oacute;n disminuy&oacute; a &lt; o = 12 nts. La separaci&oacute;n disminuida condujo a mejorado F&ouml;rster Resonancia energ&iacute;a transferencia (FRET) para el RNA empalmado. Experimentos de fluorescencia de soluci&oacute;n y de una sola mol&eacute;cula a granel dieron resultados consistentes.

PNA fluorescente sondas como etiquetas de hibridaci&oacute;n para el ARN biol&oacute;gica.

Un nuevo tinte de Cianina fluorogenic fue sintetizado y encontr&oacute; que cu&aacute;ntica de fluorescencia bajo rendimiento en la soluci&oacute;n de l&iacute;quido y en presencia de ADN de doble hebra pero hab&iacute;a mejorado 80-fold fluorescencia en soluci&oacute;n de glicerol viscoso. Un apt&aacute;meros RNA seleccionado para atar al nuevo tinte exhibe K(d) = 87 nM y realce de 60-fold de la fluorescencia. El par de tinte-apt&aacute;meros es un fluoromodule que puede ser incorporado en las etiquetas y sensores fluorescentes.

S&iacute;ntesis de nuevos tintes de Cianina fluorogenic e incorporaci&oacute;n de RNA fluoromodules.

&#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; fluorogenic cyanine &#xC5FC;&#xB8CC; &#xD569;&#xC131;&#xC740; &#xB0AE;&#xC740; &#xD615;&#xAD11; &#xC591;&#xC790; &#xC720;&#xCCB4; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xBC0F; &#xC774;&#xC911; &#xAC00;&#xB2E5; DNA&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xB97C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; 80-fold &#xC810;&#xC131; &#xAE00;&#xB9AC;&#xC138;&#xB864; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC758; &#xD615;&#xAD11;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1;. K(d)&#xB97C; &#xC804;&#xC2DC; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC120;&#xD0DD; &#xD558;&#xB294; RNA aptamer = 87 nM &#xBC0F; 60-fold &#xD615;&#xAD11; &#xC99D;&#xC9C4;. &#xC5FC;&#xB8CC; aptamer &#xC30D; &#xD615;&#xAD11; &#xC13C;&#xC11C; &#xBC0F; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC73C;&#xB85C; &#xD1B5;&#xD569; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB294; fluoromodule&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; fluorogenic cyanine &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC640; RNA fluoromodules&#xB85C; &#xBC95;&#xC778;&#xC758; &#xD569;&#xC131;.

&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#x5408;&#x6210;&#x548C;&#x53D1;&#x73B0;&#x6709;&#x4F4E;&#x8367;&#x5149;&#x91CF;&#x5B50;&#x4EA7;&#x91CF;&#x6D41;&#x4F53;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x4E0E;&#x53CC;&#x94FE; DNA &#x5B58;&#x5728;&#xFF0C;&#x4F46; 80-fold &#x589E;&#x5F3A;&#x7C98;&#x6027;&#x7518;&#x6CB9;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x3002;&#x9009;&#x5B9A;&#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x65B0;&#x7684;&#x67D3;&#x6599;&#x5C55;&#x54C1; K(d) RNA &#x9002;&#x914D; = 87 nM &#x548C; 60-fold &#x8367;&#x5149;&#x589E;&#x5F3A;&#x3002;&#x67D3;&#x6599;&#x9002;&#x914D;&#x53CC;&#x662F; fluoromodule&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7EB3;&#x5165;&#x8367;&#x5149;&#x4F20;&#x611F;&#x5668;&#x548C;&#x6807;&#x7B7E;&#x3002;

&#x65B0;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#x548C; RNA fluoromodules &#x7EB3;&#x5165;&#x7684;&#x5408;&#x6210;&#x3002;

A new fluorogenic cyanine dye was synthesized and found to have low fluorescence quantum yield in fluid solution and in the presence of double-stranded DNA but 80-fold enhanced fluorescence in viscous glycerol solution. An RNA aptamer selected for binding to the new dye exhibits K(d) = 87 nM and 60-fold fluorescence enhancement. The dye-aptamer pair is a fluoromodule that can be incorporated into fluorescent sensors and labels.

Synthesis of new fluorogenic cyanine dyes and incorporation into RNA fluoromodules.

Un nouveau colorant de cyanine fluorog&egrave;ne a &eacute;t&eacute; synth&eacute;tis&eacute; et constat&eacute; que quantique de fluorescence faible rendement en solution fluide et en pr&eacute;sence de l&#39;ADN &agrave; double brin mais 80 fois une fluorescence en solution de glyc&eacute;rol visqueux. Un aptam&egrave;re RNA s&eacute;lectionn&eacute; pour les pi&egrave;ces de liaison &agrave; la nouvelle teinture K(d) = 87 nM et augmentation de la thermoth&eacute;rapie de fluorescence. La paire de colorant-aptam&egrave;re est un fluoromodule qui peut &ecirc;tre incorpor&eacute; dans les &eacute;tiquettes et les sondes fluorescentes.

Synth&egrave;se de nouveaux colorants de cyanine fluorog&eacute;niques et incorporation de RNA fluoromodules.

Eine neue Fluorogenic Cyanine Dye wurde synthetisiert und gefunden, um geringe Fluoreszenz-Quanten in fl&uuml;ssiger L&ouml;sung und in Anwesenheit von doppelstr&auml;ngige DNA ergeben haben aber 80-fold Fluoreszenz im z&auml;hfl&uuml;ssigen Glycerinl&ouml;sung erweitert. Ein RNA-Aptamer ausgew&auml;hlt, f&uuml;r die Bindung an den neuen Farbstoff K(d) Exponate = 87 nM und 60-fold Fluoreszenz-Verbesserung. Der Farbstoff-Aptamer-Paar ist eine Fluoromodule, die in Fluoreszenz-Sensoren und Etiketten integriert werden kann.

Synthese von neuen Fluorogenic Cyanine F&auml;rbungen und Einbindung in RNA-Fluoromodules.

Una nuova tintura di cianina fluorogenic &egrave; stata sintetizzata e trovato per avere quantum fluorescenza bassa resa in soluzione fluida e in presenza di DNA double-stranded ma 80-fold enhanced fluorescenza nella soluzione di glicerolo viscoso. Un RNA aptamer selezionati per il legame con il nuovo colorante esibisce K(d) = 87 nM e la Cambiautensili fluorescenza valorizzazione. La coppia di tintura-aptamer &egrave; un fluoromodule che pu&ograve; essere incorporato in etichette e sensori fluorescenti.

Sintesi di nuovi fluorogenic cianina coloranti e l&#39;incorporazione nel RNA fluoromodules.

&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x86CD;&#x5149;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20;&#x5408;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4F4E;&#x86CD;&#x5149;&#x91CF;&#x5B50;&#x6D41;&#x4F53;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3068;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396; DNA &#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x53CE;&#x91CF;&#x304C;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;80-fold &#x86CD;&#x5149;&#x7C98;&#x6027;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30EA;&#x30F3;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x3067;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;K(d) &#x65B0;&#x898F;&#x8272;&#x7D20;&#x3078;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x306E;&#x5C55;&#x793A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x305F; RNA &#x30A2;&#x30D7;&#x30BF;&#x30DE;&#x30FC; = 87 nM &#x3068; 60-fold &#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x5897;&#x5F37;&#x3002;&#x8272;&#x7D20;&#x30A2;&#x30D7;&#x30BF;&#x30DE;&#x30FC; &#x30DA;&#x30A2;&#x86CD;&#x5149;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x3068;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x3080;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B; fluoromodule &#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x86CD;&#x5149;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20;&#x304A;&#x3088;&#x3073; RNA fluoromodules &#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x3002;

&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;-&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F; &#xFF08;&#x6D41;&#x9C7C;&#xFF09; &#x6765;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7279;&#x5B9A;&#x4FE1;&#x4F7F;&#x6838;&#x7CD6;&#x6838;&#x9178; (mRNA) &#x60AC;&#x6D6E;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4F7F;&#x7528;&#x9501;&#x5B9A;&#x6838;&#x9178; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;)-&#x4FEE;&#x6539;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x3002;&beta;-&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D; mRNA &#x662F;&#x6574;&#x4E2A; A549 &#x4E0A;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7D20;&#xFF0C;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x4FEE;&#x6539;&#x63A2;&#x9488;&#x6742;&#x4EA4;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x3002;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230; &beta;-&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D;&#x662F;&#x7136;&#x540E;&#x6CBE;&#x4F7F;&#x7528;&#x85FB;&#x7EA2;&#x86CB;&#x767D;&#x5171;&#x8F6D;&#x4EB2;&#x548C;&#x7684;&#x6D41;&#x5F0F;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x3002;&#x8F6E;&#x73ED;&#x4E2D;&#x8367;&#x5149;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x4E4B;&#x95F4; &beta;-&#x808C;&#x52A8;&#x86CB;&#x767D;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x63A2;&#x5934;&#x548C;&#x7D20;&#x975E;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x63A7;&#x5236;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x786E;&#x5B9A;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7C7B;&#x578B;&#x7684;&#x6D41;&#x9C7C;&#x7684;&#x6700;&#x4F73;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x901A;&#x900F;&#x6027;&#x589E;&#x9AD8;&#x548C;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x6761;&#x4EF6;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x6D4B;&#x8BD5;&#xFF0C;&#x548C;&#x5B83;&#x88AB;&#x53D1;&#x73B0;&#x542B; 50%&#x7532;&#x9170;&#x80FA;&#x7684;&#x7F13;&#x51B2;&#x533A;&#x5728; 60 &#x6444;&#x6C0F;&#x5EA6;&#x7684;&#x901A;&#x900F;&#x6027;&#x589E;&#x9AD8;&#x548C; 90 &#x5206;&#x949F;&#x6742;&#x4EA4;&#x4F7F;&#x7528; 3 microg/ml &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x9176; K &#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x5141;&#x8BB8;&#x5305;&#x542B;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x7ED1;&#x5B9A; mRNA &#x8FDB;&#x884C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5E76;&#x533A;&#x522B;&#x4E8E;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x63A7;&#x5236;&#x9AD8;&#x4FE1;&#x4EFB;&#x5EA6; &#xFF08;&lt; 14%&#x91CD;&#x53E0;&#x66F2;&#x7EBF;&#x4E4B;&#x95F4;&#xFF09; &#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7EC4;&#x5408;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;-&#x9C7C;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x7684;&#x7AEF;&#x7C92;&#x9176;&#x6D4B;&#x91CF;&#x548C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5176;&#x4ED6; RNA &#x7269;&#x79CD;&#x3002;

&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#xFF1A; &#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4;&#x65B9;&#x6CD5;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4FE1;&#x4F7F; RNA &#x4F7F;&#x7528;&#x9501;&#x5B9A;&#x6838;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x4E2D;&#x3002;

We present a novel method using flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (flow-FISH) to detect specific messenger RNA (mRNA) in suspended cells using locked nucleic acid (LNA)-modified oligonucleotide probes. beta-Actin mRNA was targeted in whole A549 epithelial cells by hybridization with a biotinylated, LNA-modified probe. The LNA bound to beta-actin was then stained using phycoerythrin-conjugated streptavidin and detected by flow cytometry. Shifts in fluorescence signal intensity between the beta-actin LNA probe and a biotinylated, nonspecific control LNA were used to determine optimal conditions for this type of flow-FISH. Multiple conditions for permeabilization and hybridization were tested, and it was found that conditions using 3 microg/ml of proteinase K for permeabilization and 90 min hybridization at 60 degrees C with buffer containing 50% formamide allow cells containing the LNA-bound mRNA to be detected and differentiated from the control LNA with high confidence (< 14% overlap between curves). This combined method, called LNA flow-FISH, can be used for detection and quantification of other RNA species as well as for telomerase measurement and detection.

LNA flow-FISH: a flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.

Nous pr&eacute;sentons une nouvelle m&eacute;thode utilisant l&#39;&eacute;coulement cytometry-hybridation in situ fluorescence (d&eacute;bit-poisson) pour d&eacute;tecter des ARN messager (ARNm) dans les cellules suspendues verrouill&eacute; d&#39;acide nucl&eacute;ique (LNA)-modification des sondes oligonucl&eacute;otidiques. Beta-actine ARNm a &eacute;t&eacute; cibl&eacute; dans des cellules &eacute;pith&eacute;liales A549 enti&egrave;res par hybridation avec une biotinyl&eacute;, sonde LNA modifi&eacute;s. La limite de la LNA &agrave; beta-actine &eacute;tait alors teint&eacute; &agrave; l&#39;aide de phyco&eacute;rythrine conjugu&eacute; streptavidine et d&eacute;tect&eacute;s par cytom&eacute;trie en flux. D&eacute;placements en fluorescence signal d&#39;intensit&eacute; entre la sonde LNA beta-actine et un biotinyl&eacute;, contr&ocirc;le non-sp&eacute;cifiques LNA ont &eacute;t&eacute; utilis&eacute;s pour d&eacute;terminer les conditions optimales pour ce type de flux-poisson. Plusieurs conditions pour la perm&eacute;abilisation et d&#39;hybridation ont &eacute;t&eacute; test&eacute;es, et il a &eacute;t&eacute; constat&eacute; que les conditions en utilisant 3 microg/ml de prot&eacute;inase K pour l&#39;hybridation perm&eacute;abilisation et 90 min &agrave; 60 degr&eacute;s C avec un tampon contenant 50 % formamide permettent des cellules contenant de l&#39;ARNm de la LNA li&eacute; pour &ecirc;tre d&eacute;tect&eacute;s et distingue le contr&ocirc;le LNA avec un degr&eacute; &eacute;lev&eacute; de confiance (&lt; 14 % de chevauchement entre les courbes). Cette m&eacute;thode combin&eacute;e, appel&eacute;e flux LNA-poisson, peut &ecirc;tre utilis&eacute;e pour la d&eacute;tection et la quantification des autres esp&egrave;ces d&#39;ARN ainsi que pour la d&eacute;tection et de mesure de la t&eacute;lom&eacute;rase.

LNA flux-poissons : un &eacute;coulement cytometry-fluorescence in situ m&eacute;thode d&#39;hybridation pour d&eacute;tecter &agrave; l&#39;aide de l&#39;ARN messager verrouill&eacute; sondes d&#39;acide nucl&eacute;ique.

Wir pr&auml;sentieren eine neue Methode mit flie&szlig;en Cytometry-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (Fluss-Fisch) erkennen spezifischer Boten-RNA (mRNA) in gesperrten Zellen unter Verwendung gesperrt Nukleins&auml;ure (LNA)-Oligonukleotid Sonden ge&auml;ndert. Beta-Actin mRNA zielte nun ganze A549 Epithelzellen durch Hybridisierung mit einem biotinylierten, LNA-modifizierten Sonde. Die LNA-Grenze gegen Beta-Actin war dann gef&auml;rbt mit Streptavidin Phycoerythrin-konjugierte und erkannt durch Durchflusszytometrie. Verschiebungen in der Fluoreszenz-signal-Intensit&auml;t zwischen der Beta-Actin-LNA-Sonde und einem biotinylierten unspezifische Steuerelement LNA wurden verwendet, um optimale Bedingungen f&uuml;r diese Art von Fluss-Fische zu ermitteln. Mehrere Bedingungen f&uuml;r Permeabilization und Hybridisierung wurden getestet, und es wurde festgestellt, dass die Bedingungen, die mit 3 &micro;g/ml Proteinase K f&uuml;r Permeabilization und 90 min Hybridisierung bei 60 Grad C mit Puffer mit 50 % Formamid k&ouml;nnen Zellen mit LNA gebundene mRNA erkannt und aus dem Steuerelement LNA mit hoher Zuversicht (&lt; 14 % &Uuml;berlappung zwischen Kurven) differenziert werden. Diese kombinierte Methode namens LNA Fluss-Fisch, kann zur Detektion und Quantifizierung andere RNA-Spezies sowie wie f&uuml;r Telomerase Mess- und Erkennung verwendet werden.

LNA Fluss-FISH: ein flie&szlig;en Cytometry-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Methode zur Erkennung, Boten-RNA mit Nukleins&auml;ure-Sonden gesperrt.

Vi presentiamo un nuovo metodo mediante citometria a flusso-fluorescenza l&#39;ibridazione in situ (flusso-pesce) per rilevare specifico RNA messaggero (mRNA) nelle cellule sospese utilizzando locked nucleic acid (LNA)-modificato oligonucleotide sonde. beta-actina mRNA &egrave; stato mirato tutta A549 nelle cellule epiteliali tramite l&#39;ibridazione con un anticorpo, sonda LNA-modificato. Il limite LNA beta-actina &egrave; stato poi macchiati utilizzando streptavidina coniugata con ficoeritrina e rilevato tramite flusso cytometry. Turni in fluorescenza segnalano di intensit&agrave; tra la sonda LNA beta-actina e un biotinilato, controllo aspecifico LNA sono stati utilizzati per determinare le condizioni ottimali per questo tipo di flusso-pesce. Condizioni multiple per permeabilization e l&#39;ibridazione sono state testate, e si &egrave; constatato che le condizioni utilizzando 3 microg/ml di proteinasi K per l&#39;ibridazione permeabilization e 90 min a 60 gradi C con tampone contenente 50% formammide consentono le celle contenenti il mRNA associato a LNA per essere rilevato e differenziato dal controllo LNA con fiducia alta (&lt; 14% sovrapposizione tra le curve). Questo metodo combinato, chiamato flusso LNA-pesce, pu&ograve; essere utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di altre specie di RNA come pure per quanto riguarda telomerasi misura e rilevamento.

LNA flusso-pesce: una flusso cytometry-fluorescenza in situ Metodo ibridazione per rilevare utilizzando RNA messaggero bloccato sonde di acido nucleico.

&#x6211;&#x3005; &#x6D41;&#x308C; cytometry &#x86CD;&#x5149; in situ &#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#xFF08;&#x7279;&#x5B9A;&#x30E1;&#x30C3;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC; RNA &#xFF08;mRNA&#xFF09; &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x6D6E;&#x904A;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6838;&#x9178; (LNA) &#x306E;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;-&#x9B5A;&#xFF09; &#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x63D0;&#x6848;-&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9; &#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; mRNA &#x5168;&#x4F53; A549 &#x4E0A;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x30D3;&#x30AA;&#x30C1;&#x30F3;&#x6A19;&#x8B58;&#x3001;LNA &#x5909;&#x66F4;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3068;&#x306E;&#x4EA4;&#x914D;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x76EE;&#x6A19;&#x306B;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; LNA &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x3001;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30D7;&#x30C8;&#x30A2;&#x30D3;&#x30B8;&#x30F3; &#x30D5;&#x30A3;&#x30B3;&#x30A8;&#x30EA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30F3;&#x5171;&#x5F79;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x67D3;&#x8272;&#x3057;&#x3001;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5F37;&#x5EA6;&#x30D9;&#x30FC;&#x30BF; &#x30A2;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3; LNA &#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3068;&#x3001;&#x30D3;&#x30AA;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;&#x3068;&#x975E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB; LNA &#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x9B5A;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x30BF;&#x30A4;&#x30D7;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x6761;&#x4EF6;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x900F;&#x904E;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x4EA4;&#x914D;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3057;&#x305F;&#x3068; 3 microg/ml &#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A3;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; K &#x306E; 60 &#x2103; &#x3067;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x3068; 90 &#x5206;&#x306E;&#x4EA4;&#x914D;&#x306E;&#x305F;&#x3081; 50% &#x30D5;&#x30A9;&#x30EB;&#x30E0;&#x30A2;&#x30DF;&#x30C9;&#x3092;&#x542B;&#x3093;&#x3067;&#x3044;&#x308B;&#x30D0;&#x30C3;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x6761;&#x4EF6; LNA &#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9; mRNA &#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3001;LNA &#x304B;&#x3089;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C8;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#x9AD8;&#x4FE1;&#x983C; (&lt; 14% &#x304C;&#x91CD;&#x306A;&#x308B;&#x66F2;&#x7DDA;&#x306E;&#x9593;) &#x3067;&#x533A;&#x5225;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x30BB;&#x30EB;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;LNA &#x306E;&#x6D41;&#x308C;&#x9B5A;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x4F75;&#x7528;&#x30C6;&#x30ED;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3068;&#x691C;&#x51FA;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x3048;&#x3070;&#x4ED6; RNA &#x7A2E;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

LNA &#x306E;&#x6D41;&#x308C;-&#x9B5A;: &#x6D41;&#x308C;&#x306E; cytometry &#x86CD;&#x5149; in situ &#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6CD5;&#x30E1;&#x30C3;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E3;&#x30FC; RNA &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x306E;&#x6838;&#x9178;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x3002;

&#xC120;&#xBB3C;&#xC774; &#xD750;&#xB984; cytometry-&#xD615;&#xAD11; &#xC81C;&#xC790;&#xB9AC; &#xAD50; &#xC7A1; (&#xD750;&#xB984;-&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;) &#xD2B9;&#xC815; &#xBA54;&#xC2E0;&#xC800; RNA (mRNA)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC77C;&#xC2DC; &#xC911;&#xB2E8; &#xB41C; &#xC140;&#xC5D0; &#xC7A0;&#xACA8; &#xD575; &#xC0B0; (LNA) &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;-oligonucleotide &#xC870;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC218;&#xC815; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCA0;&#xD0C0; &#xB9D0;&#xB77C; mRNA &#xC804;&#xCCB4; A549 &#xC0C1;&#xD53C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; biotinylated LNA &#xC218;&#xC815; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC640; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD45C;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBCA0;&#xD0C0; &#xB9D0;&#xB77C;&#xB97C; LNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529; streptavidin phycoerythrin &#xD3EC;&#xB974;&#xD22C;&#xAC08;&#xC5B4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xB4DC; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; cytometry&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD615;&#xAD11; &#xBCC0;&#xD654; &#xC2E0;&#xD638; &#xAC15;&#xB3C4; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xB9D0;&#xB77C; LNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xC640; biotinylated, &#xC77C;&#xBC18; &#xC81C;&#xC5B4; LNA &#xD750;&#xB984; &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;&#xC758;&#xC774; &#xC720;&#xD615;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCD5C;&#xC801;&#xC758; &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xD655;&#xC778;&#xD560; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. Permeabilization &#xBC0F; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558; &#xACE0; 50% &#xD504;&#xB86C;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xBC84;&#xD37C;&#xC640; 60&#xB3C4; C&#xC5D0;&#xC11C; permeabilization &#xBC0F; 90 &#xBD84; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; K&#xC758; 3 microg/ml&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC870;&#xAC74;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; &#xB192;&#xC740; &#xC790;&#xC2E0;&#xAC10; (&#xACE1;&#xC120; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &lt; 14% &#xC911;&#xBCF5;) &#xC81C;&#xC5B4; LNA&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; &#xB41C; LNA &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; Mrna&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xC140;&#xC744; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xBC1D;&#xD600;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; telomerase &#xCE21;&#xC815; &#xBC0F; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB2E4;&#xB978; RNA &#xC885; LNA &#xD750;&#xB984; &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xB77C;&#xB294;&#xC774; &#xACB0;&#xD569; &#xB41C; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

LNA &#xD750;&#xB984;-&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;: &#xD575; &#xC0B0; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; &#xC7A0;&#xACA8; &#xBA54;&#xC2E0;&#xC800; RNA&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xB77C; &#xAD50; &#xC7A1; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD750;&#xB984; cytometry &#xD615;&#xAD11;.

Presentamos un novedoso m&eacute;todo usando el flujo cytometry-hibridaci&oacute;n fluorescente in situ (flujo-FISH) para la detecci&oacute;n espec&iacute;fico ARN mensajero (ARNm) en las c&eacute;lulas suspendidas usando bloqueado &aacute;cido nucleico (LNA)-modificado sondas de oligonucle&oacute;tidos. mRNA de beta-actina fue atacado en las c&eacute;lulas epiteliales A549 toda por hibridaci&oacute;n con un biotinilado, sonda de LNA-modificado. El l&iacute;mite LNA a beta-actina fue detectado mediante citometr&iacute;a de flujo y ti&ntilde;en seg&uacute;n ficoeritrina conjugado estreptavidina. Cambios en la fluorescencia se&ntilde;al de intensidad entre la punta de prueba de beta-actina LNA y un biotinilado, control inespec&iacute;fico LNA fueron utilizados para determinar las condiciones &oacute;ptimas para este tipo de flujo-FISH. Se analizaron varias condiciones para la permeabilizaci&oacute;n e hibridaci&oacute;n, y se constat&oacute; que las condiciones utilizando 3 microg/ml de proteinasa K para hibridaci&oacute;n permeabilizaci&oacute;n y 90 min a 60 grados C con tamp&oacute;n que contiene 50% formamida permiten las c&eacute;lulas que contienen el mRNA de LNA-limite para detectar y distinguir desde el control LNA con alta confianza (&lt; 14% solapamiento entre las curvas). Este m&eacute;todo combinado, llamado flujo LNA-pescado, puede utilizarse para la detecci&oacute;n y cuantificaci&oacute;n de otras especies de RNA, as&iacute; como para la detecci&oacute;n y medici&oacute;n de la telomerasa.

Flujo LNA-pescado: un flujo cytometry-fluorescencia en situ m&eacute;todo de hibridaci&oacute;n para detectar ARN mensajero usando bloqueado sondas de &aacute;cido nucleico.

&#x53D1;&#x73B0;&#x7684;&#x975E;&#x7F16;&#x7801; RNA (&#x8FDB;&#x5C55;) &#x4E3B;&#x8981;&#x5C40;&#x9650;&#x4E8E;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x6A21;&#x578B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x81F4;&#x75C5;&#x7EC6;&#x83CC;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F00;&#x59CB;&#x63A2;&#x8BA8;&#x8FDB;&#x5C55;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#x7684;&#x56DB;&#x4E2A;&#x6700;&#x8FD1;&#x5DF2;&#x7F16;&#x5E8F;&#x5F27;&#x83CC;&#x7269;&#x79CD; &#xFF08;&#x5F27;&#x83CC; 40B&#x3001; &#x5F27;&#x83CC;&#x674F; 1DA3&#x3001; &#x62DF;&#x6001;&#x5F27;&#x83CC; VM573 &#x548C; campbellii &#x5F27;&#x83CC; BAA-1116&#x5E74;) &#x901A;&#x8FC7;&#x6267;&#x884C;&#x4E2D;&#x7845;&#x641C;&#x7D22;&#x4F7F;&#x7528;&#x8BF4;&#x8BDD;&#x548C; Rfam &#x7684;&#x5047;&#x5B9A;&#x8FDB;&#x5C55;&#x7F16;&#x7801;&#x57FA;&#x56E0;&#x9274;&#x5B9A;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x641C;&#x7D22;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5BFC;&#x81F4; 31 38 &#x5047;&#x5B9A;&#x8FDB;&#x5C55;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x7269;&#x79CD;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x9274;&#x5B9A;&#x548C;&#x603B;&#x8FDB;&#x5C55;&#x76EE;&#x5F55;&#x8DE8;&#x8D8A;&#x5404;&#x79CD;&#x5404;&#x6837;&#x7684;&#x89C4;&#x7BA1;&#x673A;&#x5236; &#xFF08;riboswitches&#xFF0C;&#x72EC;&#x8054;&#x4F53;&#x7F16;&#x7801; ncRNAs&#xFF0C;&#x8DE8;&#x7F16;&#x7801; ncRNAs&#xFF0C;&#x8C03;&#x5236;&#x5668;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6D3B;&#x6027;&#x3001; ribonucleoproteins&#x3001; &#x8F6C;&#x5F55;&#x7EC8;&#x6B62; ncRNAs &#x548C;&#x672A;&#x77E5;&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x9009;&#x62E9;&#x4E86;&#x901A;&#x8FC7;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x6807;&#x8BC6;&#x8BC9; campbellii BAA-1116 &#x4F7F;&#x7528;&#x5206;&#x6790;&#x6218;&#x7565;&#x57FA;&#x4E8E;&#x82AF;&#x7247;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x3002;&#x9488;&#x5BF9;&#x5E73;&#x94FA;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x6CE8;&#x660E;&#x4E94; BAA-1116 campbellii &#x57FA;&#x56E0;&#x533A;&#x57DF;&#x3001; &#x8A8A;&#x672C;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F;&#x63ED;&#x793A; 21 38 &#x9884;&#x6D4B;&#x7684;&#x8FDB;&#x5C55;&#x57FA;&#x56E0;&#x6709;&#x4EBA;&#x5728;&#x6307;&#x6570;&#x9636;&#x6BB5;&#x4E2D;&#x671F;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#x589E;&#x52A0;&#x5BCC;&#x542B;&#x517B;&#x5206;&#x7684;&#x4ECB;&#x8D28;&#x4E2D;&#x3002;&#x57FA;&#x56E0;&#x82AF;&#x7247;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x4E86;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x4E09;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x8868;&#x793A; (6S&#xFF0C;tmRNA &#x548C; TPP-2&#xFF09; &#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5B50;&#x96C6;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x4E09;&#x4E2A;&#x9002;&#x5EA6;&#x8868;&#x8FBE; &#xFF08;CsrB&#x3001; GcvB &#x548C;&#x560C;&#x5464;&#xFF09; ncRNAs &#x53CD;&#x8F6C;&#x5F55; pcr&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x540C;&#x65F6;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x66F4;&#x51C6;&#x786E;&#x7684;&#x6CE8;&#x91CA;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x533A;&#x57DF;&#x73AF;&#x5883;&#x5F27;&#x83CC;&#x4E2D;&#x8FDB;&#x5C55;&#x7684;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x65B0;&#x8D44;&#x6599;&#x3002;

&#x975E;&#x7F16;&#x7801; Rna &#x5728;&#x73AF;&#x5883;&#x5F27;&#x83CC;&#x7684;&#x6807;&#x8BC6;&#x3002;

The discovery of non-coding RNA (ncRNA) has been mainly limited to laboratory model systems and human pathogenic bacteria. In this study, we begin to explore the ncRNA diversity in four recently sequenced environmental Vibrio species (Vibrio alginolyticus 40B, Vibrio communis 1DA3, Vibrio mimicus VM573 and Vibrio campbellii BAA-1116) by performing in silico searches using Infernal and Rfam for the identification of putative ncRNA-encoding genes. This search method resulted in the identification of 31-38 putative ncRNA genes per species and the total ncRNA catalogue spanned an assortment of regulatory mechanisms (riboswitches, cis-encoded ncRNAs, trans-encoded ncRNAs, modulators of protein activity, ribonucleoproteins, transcription termination ncRNAs and unknown). We chose to experimentally validate the identifications for V. campbellii BAA-1116 using a microarray-based expression profiling strategy. Transcript hybridization to tiled probes targeting annotated V. campbellii BAA-1116 intergenic regions revealed that 21 of the 38 predicted ncRNA genes were expressed in mid-exponential-phase cultures grown in nutrient-rich medium. The microarray findings were confirmed by testing a subset of three highly expressed (6S, tmRNA and TPP-2) and three moderately expressed (CsrB, GcvB and purine) ncRNAs via reverse transcription PCR. Our findings provide new information on the diversity of ncRNA in environmental vibrios while simultaneously promoting a more accurate annotation of genomic intergenic regions.

Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.

La d&#xE9;couverte de l&#x26;#39;ARN non-codant (ARNnc) a &#xE9;t&#xE9; principalement limit&#xE9;e &#xE0; des syst&#xE8;mes mod&#xE8;les de laboratoire et les bact&#xE9;ries pathog&#xE8;nes pour l&#x26;#39;homme. Dans cette &#xE9;tude, nous commen&#xE7;ons &#xE0; explorer la diversit&#xE9; ARNnc dans quatre esp&#xE8;ces de Vibrio r&#xE9;cemment s&#xE9;quenc&#xE9;s de l&#x26;#39;environnement (Vibrio alginolyticus 40B, Vibrio communis 1DA3, Vibrio mimicus VM573 et Vibrio campbellii BAA-1116) en effectuant dans les recherches in silico &#xE0; l&#x26;#39;aide Infernal et Rfam pour l&#x26;#39;identification des putatifs ARNnc g&#xE8;nes codant. Cette m&#xE9;thode de recherche a permis d&#x26;#39;identifier des g&#xE8;nes 31-38 ARNnc putatifs par esp&#xE8;ce et le catalogue ARNnc totale s&#x26;#39;&#xE9;tend sur un assortiment de m&#xE9;canismes de r&#xE9;gulation (riboswitchs, cis-cod&#xE9;es ARNnc, trans-cod&#xE9;es ARNnc, les modulateurs de l&#x26;#39;activit&#xE9; des prot&#xE9;ines, des ribonucl&#xE9;oprot&#xE9;ines, les ARNnc terminaison de la transcription et inconnu). Nous avons choisi de valider exp&#xE9;rimentalement les identifications pour V. campbellii BAA-1116 en utilisant une strat&#xE9;gie bas&#xE9; sur un micror&#xE9;seau d&#x26;#39;expression profilage. Transcription d&#x26;#39;hybridation &#xE0; des sondes de tuiles ciblant annot&#xE9; V. campbellii BAA-1116 r&#xE9;gions interg&#xE9;niques a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; que 21 des 38 g&#xE8;nes pr&#xE9;dit ARNnc ont &#xE9;t&#xE9; exprim&#xE9;es &#xE0; la mi-exponentielle en phase cultures cultiv&#xE9;es dans un milieu riche en nutriments. Les r&#xE9;sultats ont &#xE9;t&#xE9; confirm&#xE9;es par puces &#xE0; tester un sous-ensemble de trois ARNnc fortement exprim&#xE9;s (6S, tmRNA et RRE-2) et trois mod&#xE9;r&#xE9;ment exprim&#xE9; (CsrB, GcvB et purine) via la transcription inverse PCR. Nos r&#xE9;sultats fournissent de nouvelles informations sur la diversit&#xE9; des ARNnc dans vibrions l&#x26;#39;environnement tout en promouvant simultan&#xE9;ment une annotation plus pr&#xE9;cise de la g&#xE9;nomique des r&#xE9;gions interg&#xE9;niques.

Identification des ARN non-codants dans vibrions de l&#x26;#39;environnement

Die Entdeckung der non-coding RNA (NcRNA) war haupts&auml;chlich auf Labor Modellsysteme und menschlichen pathogenen Bakterien beschr&auml;nkt. In dieser Studie beginnen wir, die NcRNA-Vielfalt in vier k&uuml;rzlich sequenzierte Umwelt Vibrio Arten (Vibrio Alginolyticus 40B, Vibrio Communis 1DA3, Vibrio Mimicus VM573 und Vibrio Campbellii BAA-1116) zu erkunden, indem Sie in Silico Suchvorg&auml;nge mithilfe von Infernal und Rfam f&uuml;r die Identifizierung des vermeintlichen NcRNA-Kodierung Gene ausf&uuml;hren. Diese Suchmethode f&uuml;hrte zur Identifizierung von Genen, 31-38 die vermeintliche NcRNA pro Art und insgesamt NcRNA Katalog &uuml;berspannt ein Sortiment von Regelungsmechanismen (Riboswitches, Cis-codierte NcRNAs, Trans-codierte NcRNAs Modulatoren des Protein-Aktivit&auml;t, Ribonucleoproteins, Transkription K&uuml;ndigung NcRNAs und unbekannt). Wir haben die Kennungen f&uuml;r V. Campbellii BAA-1116 mit einem Microarray-basierte Ausdruck Profilerstellung Strategie experimentell zu &uuml;berpr&uuml;fen. Transkript Hybridation zu gekachelte Sonden gezielt mit Anmerkungen V. Campbellii BAA-1116 intergenetischer Regionen ergab, dass 21 der 38 vorhergesagten NcRNA Gene in Mitte-exponential-Phase Kulturen angebaut in n&auml;hrstoffreiche Medium zum Ausdruck gebracht wurden. Die Microarray-Ergebnisse wurden best&auml;tigt durch Testen eine Teilmenge der drei stark exprimierten (6S, TmRNA und TPP-2) und drei m&auml;&szlig;ig ausgedr&uuml;ckt (CsrB, GcvB und Purin) NcRNAs per reverse Transkription PCR. Unsere Ergebnisse liefern neue Informationen &uuml;ber die Vielfalt der NcRNA in &ouml;kologische Vibrios zu f&ouml;rdern sowie gleichzeitig eine genauere Anmerkung der genomischen intergenetischer Regionen.

Identifizierung von nicht-kodierenden RNAs in &ouml;kologischen Vibrios.

La scoperta di RNA non codificanti (ncRNA) &egrave; stata principalmente limitata a sistemi di modello del laboratorio e batteri patogeni umani. In questo studio, iniziamo a esplorare la diversit&agrave; ncRNA in quattro recentemente sequenziate ambientale Vibrio species (Vibrio alginolyticus 40B, Vibrio communis 1DA3, Vibrio mimicus VM573 e Vibrio campbellii BAA-1116) eseguendo ricerche silico utilizzando infernale e Rfam per l&#39;identificazione dei geni codifica ncRNA putativi. Questo metodo di ricerca ha portato all&#39;individuazione dei geni putativi ncRNA 31-38 per specie e il catalogo di ncRNA totale si estendeva su un assortimento di meccanismi regolatori (riboswitches ncRNAs codificati in cis, trans-codifica ncRNAs, modulatori di attivit&agrave; della proteina, ribonucleoproteins, trascrizione cessazione ncRNAs e sconosciuto). Abbiamo scelto di validare sperimentalmente le identificazioni per V. campbellii BAA-1116 utilizzando un&#39;espressione basata su microarray profiling strategia. Ibridazione della trascrizione piastrellati sonde targeting annotato V. campbellii BAA-1116 intergenic regioni ha rivelato che 21 dei 38 ncRNA predetto geni erano espressi in met&agrave;-esponenziale-fase colture coltivate in terreno ricco di sostanze nutritive. Le scoperte di microarray sono state confermate da test un sottoinsieme di tre altamente espresso (6S, tmRNA e TPP-2) e tre ncRNAs (CsrB, GcvB e Purina) moderatamente espresso tramite reverse transcription PCR. I nostri risultati forniscono nuove informazioni sulla diversit&agrave; del ncRNA in vibrione ambientale mentre contemporaneamente promuove una pi&ugrave; accurata annotazione di regioni genomiche intergenic.

Identificazione delle non-coding RNAs in vibrione ambientale.

&#x975E;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;RNA&#xFF08;ncRNA&#x306E;&#xFF09;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x306F;&#x3001;&#x4E3B;&#x306B;&#x5B9F;&#x9A13;&#x5BA4;&#x3067;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x7CFB;&#x3068;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x75C5;&#x539F;&#x6027;&#x7D30;&#x83CC;&#x306B;&#x9650;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5730;&#x7344;&#x3068;Rfam&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B7;&#x30EA;&#x30B3;&#x691C;&#x7D22;&#x3067;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;4&#x6700;&#x8FD1;&#x30B7;&#x30FC;&#x30AF;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B9;&#x74B0;&#x5883;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;&#x7A2E;&#xFF08;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;alginolyticus 40B&#x3001;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30B3;&#x30E0;&#x30CB;&#x30B9;1DA3&#x3001;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;mimicus VM573&#x3068;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;campbellii BAA-1116&#xFF09;&#x3067;&#x306E;ncRNA&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x3092;&#x63A2;&#x6C42;&#x3057;&#x59CB;&#x3081;&#x308B;&#x63A8;&#x5B9A;&#x4E0A;&#x306E;ncRNA&#x306E;&#x3092;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3059;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x691C;&#x7D22;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x7A2E;&#x3054;&#x3068;&#x306B;31&#x304B;&#x3089;38&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x63A8;&#x5B9A;&#x306E;ncRNA&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x5408;&#x8A08;&#x306E;ncRNA&#x30AB;&#x30BF;&#x30ED;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x6A5F;&#x69CB;&#xFF08;&#x30EA;&#x30DC;&#x30B9;&#x30A4;&#x30C3;&#x30C1;&#x3001;&#x30B7;&#x30B9; - &#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;ncRNAs&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;ncRNAs&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x30E2;&#x30B8;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x30EA;&#x30DC;&#x6838;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;&#x8EE2;&#x5199;&#x7D42;&#x7D50;ncRNA&#x306E;&#x54C1;&#x63C3;&#x3048;&#x3092;&#x30B9;&#x30D1;&#x30F3;&#x3068;&#x4E0D;&#x660E;&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306B;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;V. campbellii BAA-1116&#x7528;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x60C5;&#x5831;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6CE8;&#x91C8;&#x4ED8;&#x304D;&#x306E;V. campbellii BAA-1116&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x9593;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x30BF;&#x30A4;&#x30EB;&#x5F35;&#x308A;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3078;&#x306E;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;38&#x306E;21&#x306E;ncRNA&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304C;&#x6804;&#x990A;&#x8C4A;&#x5BCC;&#x306A;&#x57F9;&#x5730;&#x3067;&#x751F;&#x80B2;&#x4E2D;&#x671F;&#x6307;&#x6570;&#x76F8;&#x57F9;&#x990A;&#x3067;&#x306F;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4E88;&#x6E2C;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x9006;&#x8EE2;&#x5199;PCR&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x4E09;&#x9AD8;&#x767A;&#x73FE;&#xFF08;6S&#x3001;tmRNA&#x3068;TPP-2&#xFF09;&#x3068;3&#x3064;&#x306E;&#x9069;&#x5EA6;&#x306B;&#xFF08;CsrB&#x53CA;&#x3073;&#x3001;GcvB&#x3068;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF09;&#x3092;&#x767A;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;ncRNA&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x9593;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x6CE8;&#x91C8;&#x3092;&#x63A8;&#x9032;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x74B0;&#x5883;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;ncRNA&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x60C5;&#x5831;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x74B0;&#x5883;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;&#x306E;&#x975E;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;RNA&#x306E;&#x540C;&#x5B9A;

&#xBE44; &#xCF54;&#xB529; RNA (ncRNA)&#xC758; &#xBC1C;&#xACAC; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xBAA8;&#xB378; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xACFC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xC131; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC81C;&#xD55C; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC; silico &#xAC80;&#xC0C9; &#xC0C1; ncRNA &#xC778;&#xCF54;&#xB529; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC9C0;&#xC625; &#xBC0F; Rfam&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xD589; &#xD558; &#xC5EC; 4 &#xAC1C;&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xB41C; &#xD658;&#xACBD; &#xBE44; &#xBE0C;&#xB9AC; &#xC624; &#xC885; (&#xBE0C;&#xB9AC; alginolyticus 40B, &#xBE44; &#xBE0C;&#xB9AC; &#xC624; &#xB77C;&#xACE0;&#xB3C4; 1DA3, &#xBE44; &#xBE0C;&#xB9AC; &#xC624; mimicus VM573 &#xBC0F; &#xBE0C;&#xB9AC; campbellii BAA-1116) ncRNA &#xB2E4;&#xC591;&#xC131;&#xC744; &#xD0D0;&#xD5D8; &#xD558;&#xAE30; &#xC2DC;&#xC791;. &#xC774; &#xAC80;&#xC0C9; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xACB0;&#xACFC; &#xC885; &#xB2F9; 31-38 &#xC0C1; ncRNA &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xACFC; &#xCD1D; ncRNA &#xCE74;&#xD0C8;&#xB85C;&#xADF8; &#xC2A4;&#xD32C; (riboswitches, cis &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; ncRNAs, &#xD2B8;&#xB79C;&#xC2A4; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xB41C; ncRNAs, &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294;, &#xB179;&#xC74C; &#xBC29;&#xC1A1; &#xC885;&#xB8CC; ncRNAs, ribonucleoproteins, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xBCC0;&#xC870;&#xAE30;)&#xC744; &#xADDC;&#xC81C; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC758; &#xAD6C;&#xC0C9;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; campbellii BAA-1116 microarray &#xAE30;&#xBC18; &#xC2DD; &#xC804;&#xB7B5; &#xD504;&#xB85C; &#xD30C;&#xC77C;&#xB9C1;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC2E0;&#xC6D0; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xAE30;&#xB85C; &#xACB0;&#xC815; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB300; &#xBCF8; &#xAD50; &#xC7A1; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xD305; &#xAE30;&#xC640; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB97C; campbellii BAA-1116 intergenic &#xC9C0;&#xC5ED; &#xB300; &#xC8FC;&#xC11D; 21 38 &#xC608;&#xCE21;&#xB41C; ncRNA &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC601;&#xC591;&#xBD84;&#xC774; &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; &#xB9E4;&#xCCB4; &#xC131;&#xC7A5; &#xC911;&#xC21C; &#xC9C0; &#xC218;-&#xC0C1; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC1D;&#xD614;&#xB2E4;. Microarray &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD45C;&#xD604;&#xB41C; (6S, tmRNA &#xBC0F; TPP-2)&#xC758; &#xD558;&#xC704; &#xC9D1;&#xD569;&#xC744; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xD558; &#xC5EC; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4; &#xBC0F; 3 &#xC801;&#xC808; &#xD558; &#xAC8C; &#xD45C;&#xD604;&#xB41C; (CsrB, GcvB &#xBC0F; purine) Ncrnas&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBC18;&#xC804; &#xC804;&#xC0AC; PCR. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xAC8C;&#xB188; intergenic &#xC601;&#xC5ED;&#xC758; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xC8FC;&#xC11D; &#xCD94;&#xC9C4; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xD658;&#xACBD; &#xBC00;&#xC5B4;&#xB0B4;&#xC5D0; Ncrna&#xC758; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131;&#xC5D0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBE44;-&#xCF54;&#xB529; RNAs &#xD658;&#xACBD; &#xBC00;&#xC5B4;&#xB0B4;&#xC5D0; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El descubrimiento de los ARN no codificador (ncRNA) se ha limitado principalmente a los sistemas de modelo de laboratorio y las bacterias pat&#xF3;genas humanas. En este estudio, comenzamos a explorar la diversidad ncRNA en cuatro recientemente secuenciado ambientales especies de Vibrio (Vibrio alginolyticus 40B, Vibrio communis 1DA3, Vibrio mimicus VM573 y Vibrio campbellii BAA-1116) mediante la realizaci&#xF3;n de b&#xFA;squedas en silico usando Infernal y Rfam para la identificaci&#xF3;n de putativo de codificaci&#xF3;n de los genes ncRNA. Este m&#xE9;todo de b&#xFA;squeda dio como resultado la identificaci&#xF3;n de 31-38 ncRNA genes putativos de cada especie y el cat&#xE1;logo total de ncRNA abarc&#xF3; una variedad de mecanismos de regulaci&#xF3;n (riboswitches y ncRNAs codificados, cis-trans-codificados ncRNAs, moduladores de la actividad de la prote&#xED;na, y ribonucleoproteinas ncRNAs terminaci&#xF3;n de la transcripci&#xF3;n y lo desconocido). Hemos elegido para validar experimentalmente las identificaciones de V. campbellii BAA-1116 utilizando una estrategia de microarrays de expresi&#xF3;n basada en perfiles. Transcripci&#xF3;n de la hibridaci&#xF3;n con sondas de baldosas dirigidas anotada campbellii V. BAA-1116 las regiones interg&#xE9;nicas revel&#xF3; que 21 de los 38 predijo ncRNA genes se expresaban a mediados de la fase exponencial de cultivos crecidos en medio rico en nutrientes. Los resultados de microarrays fueron confirmados por pruebas de un subconjunto de tres ncRNAs altamente expresados &#x200B;&#x200B;(6S, tmRNA y TPP-2) y tres moderadamente expresado (CsrB, GcvB y purina) a trav&#xE9;s de la transcripci&#xF3;n reversa PCR. Nuestros resultados proporcionan nueva informaci&#xF3;n sobre la diversidad de ncRNA de vibriones ambientales al mismo tiempo la promoci&#xF3;n de una anotaci&#xF3;n m&#xE1;s precisa de la gen&#xF3;mica regiones interg&#xE9;nicas.

Identificaci&#xF3;n de los RNAs no codificantes en vibrios ambientales

&#x6211;&#x4EEC;&#x4EE5;&#x524D;&#x663E;&#x793A;&#x4F7F;&#x7528;&#x9501;&#x7684;&#x6838;&#x9178; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;) &#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x4E3A;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;-&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;-&#x9C7C;) &#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x7EC6;&#x80DE; mRNA&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x6F14;&#x793A;&#x5982;&#x4F55;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x76D1;&#x89C6;&#x53D7;&#x611F;&#x67D3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2; RNA&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6BD4;&#x8F83;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;-&#x9C7C;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x4E0E;&#x5176;&#x4ED6;&#x7684;&#x91CF;&#x5316;&#x75C5;&#x6BD2;&#x590D;&#x5236;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x4F7F;&#x7528;&#x589E;&#x5F3A;&#x578B;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D; (EGFP) &#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x6784;&#x9020;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x9006;&#x8F6C;&#x5F55;-&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x63A2;&#x5934;&#x5BF9;&#x8F9B;&#x5FB7;&#x6BD5;&#x65AF;&#x75C5;&#x6BD2; RNA &#x7684;&#x8865;&#x5145;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x8DDF;&#x8E2A;&#x968F;&#x65F6;&#x95F4;&#x5728;&#x65E9;&#x671F;&#x611F;&#x67D3;&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2; RNA &#x5728;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x76F8;&#x5F53;&#x4E8E;&#x7EFF;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x654F;&#x611F;&#x6027;&#xFF0C;&#x5728;&#x6784;&#x9020;&#x4E0E;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5CF0;&#x503C;&#x7EA6; 3 h &#x548C;&#x611F;&#x67D3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x540C;&#x4E00;&#x7EA7;&#x522B;&#x7684;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#x65B9;&#x6CD5;&#x54CD;&#x5E94;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x6297;&#x75C5;&#x6BD2;&#x836F;&#x7269;&#x6CBB;&#x7597;&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2; RNA &#x6C34;&#x5E73;&#x4E0B;&#x964D;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x8868;&#x793A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x76D1;&#x6D4B;&#x75C5;&#x6BD2;&#x611F;&#x67D3;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x65B9;&#x4FBF;&#x5730;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x4EFB;&#x4F55;&#x75C5;&#x6BD2;&#x3002;

&#x76D1;&#x6D4B;&#x4E2D;&#x4E0E;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#x53D7;&#x611F;&#x67D3;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x75C5;&#x6BD2; RNA&#x3002;

We previously showed the feasibility of using locked nucleic acid (LNA) for flow cytometric-fluorescence in situ hybridization (LNA flow-FISH) detection of a target cellular mRNA. Here we demonstrate how the method can be used to monitor viral RNA in infected cells. We compared the results of the LNA flow-FISH with other methods of quantifying virus replication, including the use of an enhanced green fluorescent protein (EGFP) viral construct and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction. We found that an LNA probe complementary to Sindbis virus RNA is able to track the increase in viral RNA over time in early infection. In addition, this method is comparable to the EGFP construct in sensitivity, with both peaking around 3 h and at the same level of infected cells. Finally, we observed that the LNA flow-FISH method responds to the decrease in levels of viral RNA caused by antiviral medication. This technique represents a straightforward way to monitor viral infection in cells and is easily applicable to any virus.

Monitoring viral RNA in infected cells with LNA flow-FISH.

Nous avons pr&eacute;c&eacute;demment montr&eacute; la faisabilit&eacute; de l&#39;utilisation de l&#39;acide nucl&eacute;ique verrouill&eacute; (LNA) pour les flux par cytom&eacute;trie en flux-fluorescence in situ d&eacute;tection d&#39;hybridation (LNA flux-FISH) d&#39;une cible cellulaire ARNm. Ici, nous montrons comment la m&eacute;thode peut &ecirc;tre utilis&eacute;e pour surveiller l&#39;ARN viral dans les cellules infect&eacute;es. Nous avons compar&eacute; les r&eacute;sultats de la LNA flux-poisson avec d&#39;autres m&eacute;thodes de quantification de r&eacute;plication du virus, y compris l&#39;utilisation d&#39;une construction virale de la prot&eacute;ine fluorescente verte am&eacute;lior&eacute;e (EGFP) et quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Nous avons constat&eacute; qu&#39;une sonde LNA compl&eacute;mentaire de l&#39;ARN du virus Sindbis est en mesure de suivre l&#39;augmentation de l&#39;ARN viral dans le temps en infection pr&eacute;coce. En outre, cette m&eacute;thode est comparable &agrave; la construction EGFP dans la sensibilit&eacute;, avec les deux avec un pic vers 15 h et au m&ecirc;me niveau des cellules infect&eacute;es. Enfin, nous avons observ&eacute; que la m&eacute;thode de flux-poissons de LNA r&eacute;pond &agrave; la diminution des niveaux d&#39;ARN viral, caus&eacute;e par des m&eacute;dicaments antiviraux. Cette technique repr&eacute;sente un moyen simple de contr&ocirc;ler l&#39;infection virale dans les cellules et est facilement applicable &agrave; n&#39;importe quel virus.

Surveillance de l&#39;ARN viral dans les cellules infect&eacute;es avec LNA flux-poisson.

Zuvor zeigten wir die Machbarkeit der Verwendung von gesperrten Nukleins&auml;ure (LNA) f&uuml;r flie&szlig;en Cytometric-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (LNA Fluss Fischen) Erkennung eines Ziels zellul&auml;re mRNA. Hier zeigen wir, wie die Methode verwendet werden kann, um viralen RNA in infizierten Zellen zu &uuml;berwachen. Wir verglichen die Ergebnisse der LNA Fluss-Fische mit anderen Methoden zur Quantifizierung von Virus-Replikation, einschlie&szlig;lich der Verwendung eines verbesserten gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (EGFP) virale Konstrukt und quantitative Reverse Transkription Polymerasekettenreaktion. Wir fanden, dass eine LNA-Sonde Sindbis-Virus-RNA erg&auml;nzen die Zunahme der viralen RNA im Laufe der Zeit in der fr&uuml;hen Infektion verfolgen kann. Dar&uuml;ber hinaus ist diese Methode vergleichbar mit dem EGFP-Konstrukt in der Empfindlichkeit, mit beiden H&ouml;chststand um 3 h und auf der gleichen Ebene der infizierten Zellen. Schlie&szlig;lich beobachteten wir, dass der R&uuml;ckgang der Ebenen der viralen RNA durch antivirale Medikamente verursacht die LNA-Fluss-FISH-Methode reagiert. Diese Technik stellt eine einfache M&ouml;glichkeit, virale Infektion in den Zellen zu &uuml;berwachen und kann leicht auf Viren.

&Uuml;berwachung viralen RNA in infizierten Zellen mit LNA Fluss-fischen.

Abbiamo precedentemente dimostrato la fattibilit&agrave; dell&#39;utilizzo di acido nucleico locked (LNA) per flusso cytometric-fluorescenza in situ rilevamento ibridazione (LNA flusso-pesce) di un bersaglio cellulare mRNA. Qui dimostriamo come il metodo pu&ograve; essere utilizzato per monitorare il RNA virale nelle cellule infettate. Abbiamo confrontato i risultati del flusso-pesce LNA con altri metodi di quantificare la replicazione del virus, compreso l&#39;uso di un costrutto virale di avanzata proteina fluorescente verde (EGFP) e quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Abbiamo trovato che una sonda LNA Sindbis virus RNA complementare &egrave; in grado di monitorare l&#39;aumento di RNA virale nel tempo nell&#39;infezione iniziale. Inoltre, questo metodo &egrave; paragonabile al costrutto EGFP nella sensibilit&agrave;, con entrambi raggiungendo circa 3 h e allo stesso livello delle cellule infette. Infine, abbiamo osservato che il metodo di flusso-pesce LNA risponde ad un calo nei livelli di RNA virale causata da farmaci antivirali. Questa tecnica &egrave; facilmente applicabile a qualsiasi virus e rappresenta un modo semplice per monitorare l&#39;infezione virale nelle cellule.

Monitoraggio RNA virale nelle cellule infettate con LNA flusso-pesce.

&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x4EE5;&#x524D;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178; (LNA) &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x86CD;&#x5149; in situ &#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; (LNA &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x9B5A;&#xFF09; &#x691C;&#x51FA;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x643A;&#x5E2F;&#x96FB;&#x8A71;&#x793A;&#x3057;&#x305F; mRNA&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x611F;&#x67D3;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E; RNA &#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F; LNA &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x9B5A;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x4ED6;&#x5F37;&#x5316;&#x7DD1;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; (EGFP) &#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x9006;&#x8EE2;&#x5199;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x9023;&#x9396;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F; LNA &#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6; &#x30B7;&#x30F3;&#x30C9;&#x30D3;&#x30B9; &#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; RNA &#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; RNA &#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x611F;&#x67D3;&#x521D;&#x671F;&#x306E;&#x6642;&#x9593;&#x7D4C;&#x904E;&#x3092;&#x8FFD;&#x8DE1;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F; 3 h &#x524D;&#x5F8C;&#x3092;&#x30D4;&#x30FC;&#x30AF;&#x3068;&#x611F;&#x67D3;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x540C;&#x3058;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306B;&#x5339;&#x6575;&#x3059;&#x308B;&#x611F;&#x5EA6;, EGFP &#x30B3;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;LNA &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x9B5A;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304C;&#x306E;&#x6297;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x85AC;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; RNA &#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x306B;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E;&#x611F;&#x67D3;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x7C21;&#x5358;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3001;&#x4EFB;&#x610F;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x3092;&#x7C21;&#x5358;&#x306B;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

LNA &#x306E;&#x6D41;&#x308C; - &#x9B5A;&#x306E;&#x611F;&#x67D3;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306E; RNA &#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC0B4;&#xD3B4;&#xBCF8; &#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0; (LNA)&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xC758; &#xD0C0;&#xB2F9;&#xC131; &#xD750;&#xB984; cytometric-&#xD615;&#xAD11; &#xC81C;&#xC790;&#xB9AC; &#xAD50; &#xC7A1; (LNA &#xD750;&#xB984;-&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;) &#xAC10;&#xC9C0; &#xB300;&#xC0C1;&#xC5D0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; mRNA. &#xC5EC;&#xAE30;&#xB294; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; RNA&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xBCF5;&#xC81C;, &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xB179;&#xC0C9; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (EGFP) &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xAD6C;&#xC870; &#xBC0F; &#xC591;&#xC801; &#xC5ED; &#xC804;&#xC0AC; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC5F0;&#xC1C4; &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xCE21;&#xC815;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; LNA &#xD750;&#xB984; &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xBE44;&#xAD50;. Sindbis &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; RNA&#xC5D0; &#xBB34;&#xB8CC; LNA &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB294; &#xCD08;&#xAE30; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC5D0; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; RNA&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC99D;&#xAC00; &#xCD94;&#xC801;&#xD560; &#xC218;&#xB97C; &#xCC3E;&#xC558;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;,&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB450; &#xC815;&#xC810; 3 h &#xC8FC;&#xC704;&#xC640; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xB3D9;&#xC77C;&#xD55C; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC10;&#xB3C4;, EGFP &#xAD6C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; LNA &#xD750;&#xB984; &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xC751;&#xB2F5; &#xD56D; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC57D;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; RNA &#xC218;&#xC900;&#xC774; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558; &#xAD00;&#xCC30; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xAC10;&#xC5FC;&#xC744; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xACE0; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC801;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

LNA &#xD750;&#xB984;-&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;&#xC640; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; RNA&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Anteriormente demostramos la factibilidad del uso de &aacute;cido nucleico bloqueado (LNA) para citometr&iacute;a de flujo-fluorescencia en situ detecci&oacute;n de hibridaci&oacute;n (LNA flujo-FISH) de un objetivo celular mRNA. Aqu&iacute; demostramos c&oacute;mo el m&eacute;todo puede utilizarse para controlar el RNA viral en las c&eacute;lulas infectadas. Comparamos los resultados de los LNA flujo-peces con otros m&eacute;todos de cuantificaci&oacute;n de la replicaci&oacute;n del virus, incluyendo el uso de una construcci&oacute;n viral mayor prote&iacute;na verde fluorescente (EGFP) y reacci&oacute;n en cadena de polimerasa cuantitativa de reverso-transcripci&oacute;n. Se encontr&oacute; que una sonda LNA Sindbis virus RNA complementaria es capaz de rastrear el aumento en el RNA viral con el tiempo en la infecci&oacute;n temprana. Adem&aacute;s, este m&eacute;todo es comparable a la construcci&oacute;n EGFP en sensibilidad, con dos picos de alrededor de 3 h y en el mismo nivel de las c&eacute;lulas infectadas. Por &uacute;ltimo, observamos que el m&eacute;todo de flujo-pescado de LNA responde a la disminuci&oacute;n en los niveles de ARN viral causada por medicamentos antivirales. Esta t&eacute;cnica representa una forma sencilla de controlar la infecci&oacute;n viral en las c&eacute;lulas y es f&aacute;cilmente aplicable a cualquier virus.

Monitoreo de RNA viral en c&eacute;lulas infectadas con LNA flujo-FISH.

With a view toward developing a rugged microflow cytometer, a sheath flow system was micromachined in hard plastic (polymethylmethacrylate) for analysis of particles and cells using optical detection. Six optical fibers were incorporated into the interrogation region of the chip, in which hydrodynamic focusing narrowed the core stream to ~35 Î¼m Ã— 40 Î¼m. The use of a relatively large channel at the inlet as well as in the interrogation region (375 Î¼m Ã— 125 Î¼m) successfully minimized the risk of clogging. The device could withstand pressures greater than 100 psi without leaking. Assays using both coded microparticles and cells were demonstrated using the microflow cytometer. Multiplexed immunoassays detected nine different bacteria and toxins using a single mixture of coded microspheres. A549 cancer cells processed with locked nucleic acid probes were evaluated using fluorescence in situ hybridization.

A hard microflow cytometer using groove-generated sheath flow for multiplexed bead and cell assays.

&#x5411;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x56FD;&#x5BB6;&#x5D0E;&#x5C96;&#x5FAE;&#x6D41;&#x52A8;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x7684;&#x89C6;&#x56FE;&#xFF0C;&#x9798;&#x6D41;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5904;&#x4E8E;&#x5FAE;&#x786C;&#x5851;&#x6599; (&#x805A;&#x7532;&#x57FA;&#x4E19;&#x70EF;&#x9178;&#x7532;&#x916F;) &#x7C92;&#x5B50;&#x548C;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4F7F;&#x7528;&#x5149;&#x5B66;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x516D;&#x4E2A;&#x5149;&#x5B66;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x88AB;&#x7EB3;&#x5165;&#x7684;&#x82AF;&#x7247;&#x7684;&#x5BA1;&#x8BAF;&#x533A;&#x57DF;&#x3001; &#x5728;&#x54EA;&#x4E9B;&#x6C34;&#x52A8;&#x529B;&#x91CD;&#x70B9;&#x7F29;&#x5C0F;&#x6838;&#x5FC3;&#x6D41;&#x5230; ~ 35 &mu; m &times; 40 &mu; m&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x8F83;&#x5927;&#x901A;&#x9053;&#x4E0A;&#x7684;&#x5165;&#x6C34;&#x53E3;&#x4EE5;&#x53CA;&#x5BA1;&#x8BAF;&#x533A;&#x57DF; (375 &mu; m &times; 125 &#x5FAE;&#x7C73;) &#x7684;&#x6210;&#x529F;&#x6700;&#x5C0F;&#x5316;&#x5835;&#x585E;&#x7684;&#x98CE;&#x9669;&#x3002;&#x8BE5;&#x8BBE;&#x5907;&#x53EF;&#x4EE5;&#x627F;&#x53D7;&#x5927;&#x4E8E; 100 psi &#x7684;&#x538B;&#x529B;&#x800C;&#x4E0D;&#x6CC4;&#x6F0F;&#x3002;&#x540C;&#x65F6;&#x4F7F;&#x7528;&#x8FD9;&#x4E8C;&#x8005;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7F16;&#x7801;&#x5FAE;&#x7C92;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6F14;&#x793A;&#x4E86;&#x4F7F;&#x7528;&#x5FAE;&#x6D41;&#x52A8;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x3002;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x7684;&#x514D;&#x75AB;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5230;&#x4E5D;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x548C;&#x6BD2;&#x7D20;&#x7F16;&#x7801;&#x5FAE;&#x7403;&#x5355;&#x6DF7;&#x5408;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;A549 &#x7EC6;&#x80DE;&#x5904;&#x7406;&#x9501;&#x5B9A;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x63A2;&#x9488;&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x3002;

&#x4F7F;&#x7528;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x73E0;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x68C0;&#x6D4B;&#x69FD;&#x751F;&#x6210;&#x9798;&#x6D41;&#x786C;&#x5FAE;&#x6D41;&#x52A8;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x3002;

En vue d&#39;&eacute;laborer un cytom&egrave;tre microflow robuste, un syst&egrave;me d&#39;&eacute;coulement de gaine a &eacute;t&eacute; usin&eacute;e en plastique dur (polym&eacute;thacrylate de m&eacute;thyle) pour l&#39;analyse des particules et des cellules &agrave; l&#39;aide de d&eacute;tection optique. Six des fibres optiques ont &eacute;t&eacute; incorpor&eacute;es dans la r&eacute;gion de l&#39;interrogatoire de la puce, dans laquelle focalisation hydrodynamique r&eacute;duit le noyau flux &agrave; ~ 35 &mu;m &times; 40 &mu;m. Avec succ&egrave;s, l&#39;utilisation d&#39;un canal relativement important &agrave; l&#39;entr&eacute;e ainsi que dans la r&eacute;gion de l&#39;interrogatoire (375 &mu;m &times; 125 &mu;m) r&eacute;duit au minimum le risque d&#39;engorgement. L&#39;appareil pouvait r&eacute;sister &agrave; des pressions sup&eacute;rieures &agrave; 100 lb/po2 sans fuite. Dosages utilisant &agrave; la fois cod&eacute; microparticules et les cellules ont &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute;s &agrave; l&#39;aide du cytom&egrave;tre de microflow. Les immunoessais multiplex&eacute;s d&eacute;tect&eacute; neuf diff&eacute;rentes bact&eacute;ries et les toxines &agrave; l&#39;aide d&#39;un m&eacute;lange unique de microsph&egrave;res cod&eacute;s. A549 canc&eacute;reux trait&eacute;s avec des sondes d&#39;acide nucl&eacute;ique verrouill&eacute; ont &eacute;t&eacute; &eacute;valu&eacute;s &agrave; l&#39;aide de fluorescence in situ hybridization.

Un cytom&egrave;tre de microflow dur utilise les flux g&eacute;n&eacute;r&eacute;s par rainure gaine pour des dosages de perle et cellule multiplex&eacute;s.

Mit Blick auf die Entwicklung einer robusten Kleinstmengen Cytometer war ein Mantel-Flow-System Mikromaschinen in Hartplastik (Polymethylmethacrylat) f&uuml;r die Analyse von Partikeln und Zellen, die mit optischen Erkennung. Sechs optische Fasern wurden in der Region Verh&ouml;r des Chips aufgenommen, in welcher hydrodynamische Fokussierung den Kern verengt stream ~ 35 &mu;m &times; 40 &micro;m. Die Verwendung eines relativ gro&szlig;en Kanals am Einla&szlig; sowie Verh&ouml;r Region (375 &mu;m &times; 125 &mu;m) minimiert erfolgreich das Risiko einer Verstopfung. Das Ger&auml;t k&ouml;nnte Druck gr&ouml;&szlig;er als 100 Psi standhalten, ohne zu lecken. Assays mit beide kodiert Mikropartikel und Zellen wurden mit den Kleinstmengen Cytometer demonstriert. Multiplex Immunoassays erkannt neun verschiedene Bakterien und Toxine, die mit einer einzige Mischung aus codierten Mikrosph&auml;ren. A549 Krebszellen verarbeitet mit gesperrten Nukleins&auml;ure Pr&uuml;fspitzen wurden ausgewertet, mit Fluoreszenz in Situ Hybridisierung.

Eine harte Kleinstmengen Cytometer mit Nut generierte Scheide-Fluss f&uuml;r Multiplex Perlen und Zelle-Assays.

Con una vista verso lo sviluppo di un citometro microflusso robusto, un sistema di flusso guaina era micro in plastica dura (polimetilmetacrilato) per analisi di particelle e cellule mediante rilevamento ottico. Sei le fibre ottiche sono state incorporate nella regione interrogatorio del chip, in cui focalizzazione idrodinamica ristretto nucleo stream a ~ 35 &mu;m &times; 40 &mu;m. L&#39;utilizzo di un canale in ingresso cos&igrave; come nella regione di interrogatorio (375 &mu;m &times; 125 &mu;m) relativamente grande con successo minimizzato il rischio di intasamento. Il dispositivo potrebbe resistere a pressioni superiori a 100 psi senza perdite. Dosaggi utilizzando sia codificato microparticelle e le cellule sono state dimostrate utilizzando il citometro microflusso. Immunodosaggi multiplex rilevato nove diversi batteri e tossine usando una miscela unica di microsfere codificate. Cellule tumorali A549 elaborate con sonde di acido nucleico locked sono state valutate mediante fluorescenza l&#39;ibridazione in situ.

Un citometro microflusso duro utilizzando il flusso generato da groove guaina per multiplex assays tallone e cella.

&#x9811;&#x4E08;&#x306A;&#x591A;&#x8272;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3092;&#x8996;&#x91CE;&#x306B;&#x3001;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B9; &#x30D5;&#x30ED;&#x30FC; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x7C92;&#x5B50;&#x3068;&#x5149;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30CF;&#x30FC;&#x30C9; &#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30C1;&#x30C3;&#x30AF; &#xFF08;pmma&#xFF09; &#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x3060;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x516D;&#x3064;&#x306E;&#x5149;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30D0;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x30C1;&#x30C3;&#x30D7;&#x306E;&#x5C0B;&#x554F;&#x5730;&#x57DF;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x3069;&#x306E;&#x6D41;&#x4F53;&#x529B;&#x5B66;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x305F;&#x3001;&#x30B3;&#x30A2;&#x7D5E;&#x308A;&#x8FBC;&#x3080; ~ 35 &mu; m &times; 40 &mu; m &#x30B9;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x30E0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5C0B;&#x554F;&#x5730;&#x57DF; (375 &mu; m &times; 125 &mu;&#xFF09; &#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x5165;&#x53E3;&#x3067;&#x6BD4;&#x8F03;&#x7684;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x304C;&#x6B63;&#x5E38;&#x306B;&#x76EE;&#x8A70;&#x307E;&#x308A;&#x306E;&#x30EA;&#x30B9;&#x30AF;&#x3092;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C7;&#x30D0;&#x30A4;&#x30B9;&#x306F;&#x3001;&#x6F0F;&#x6D29;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x306A;&#x304F;&#x3088;&#x308A; 100 psi &#x306E;&#x5727;&#x529B;&#x306B;&#x8010;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5FAE;&#x7C92;&#x5B50;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x306E;&#x7B26;&#x53F7;&#x5316;&#x3057;&#x3001;&#x591A;&#x8272;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x8A8D;&#x3081;&#x305F;&#x3002;&#x591A;&#x91CD;&#x30A4;&#x30E0;&#x30CE;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4; 9 &#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7D30;&#x83CC;&#x3084;&#x6BD2;&#x7D20;&#x3092;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5FAE;&#x5C0F;&#x7403;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x6DF7;&#x5408;&#x7269;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x691C;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3067;&#x51E6;&#x7406;&#x3055;&#x308C;&#x308B; A549 &#x304C;&#x3093;&#x7D30;&#x80DE;&#x86CD;&#x5149;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x306E;&#x4EA4;&#x914D;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x8A55;&#x4FA1;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x591A;&#x91CD;&#x30D3;&#x30FC;&#x30C9;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x7528;&#x9798;&#x306E;&#x6E9D;&#x751F;&#x6210;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30CF;&#x30FC;&#x30C9;&#x591A;&#x8272;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; &#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3002;

&#xACAC;&#xACE0;&#xD55C; microflow cytometer &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCFC;, &#xCE7C; &#xC9D1; &#xD750;&#xB984; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC785;&#xC790;&#xC640; &#xAD11; &#xAC10;&#xC9C0;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC140;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD558;&#xB4DC; &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4;&#xD2F1; (polymethylmethacrylate)&#xC5D0;&#xC11C; micromachined &#xD588;&#xB2E4;. 6 &#xAC1C;&#xC758; &#xAD11;&#xD559; &#xC12C;&#xC720; &#xCE69;&#xC758; &#xC2EC;&#xBB38; &#xC601;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xD1B5;&#xD569; &#xD588;&#xB2E4;, 40 &mu; m&#xB294; &#xC720;&#xCCB4; &#xCD08;&#xC810;&#xC744; &#xC881;&#xD600; &#xD575;&#xC2EC;&#xC5D0;&#xC11C; ~ 35 &mu; m &times; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BC;. &#xC2EC;&#xBB38; &#xC9C0;&#xC5ED; (375 &mu; m &times; 125 &mu;)&#xB85C; &#xC785;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBE44;&#xAD50;&#xC801; &#xD070; &#xCC44;&#xB110; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB9C9;&#xD798;&#xC758; &#xC704;&#xD5D8;&#xC744; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD654; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7A5;&#xCE58; &#xC5C6;&#xC774; &#xC720;&#xCD9C; &#xC555;&#xB825; 100 psi &#xBCF4;&#xB2E4; &#xACAC;&#xB51C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBAA8;&#xB450;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCF54;&#xB529; &#xB41C; &#xBBF8;&#xC640; &#xC140; microflow cytometer&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; immunoassays 9 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC640; &#xB3C5; &#xC18C; &#xCF54;&#xB529;&#xB41C; microspheres &#xB2E8;&#xC77C; &#xD63C;&#xD569;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xCC98;&#xB9AC; A549 &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xD615;&#xAD11; &#xC81C;&#xC790;&#xB9AC; &#xAD50; &#xC7A1;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD3C9;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xD558;&#xB4DC; microflow cytometer &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xAD6C;&#xC2AC;&#xACFC; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCE7C; &#xC9D1; &#xADF8;&#xB8E8;&#xBE0C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xD750;&#xB984;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

Con miras a desarrollar un cit&oacute;metro de MicroFlujo robusto, un sistema de flujo de la vaina fue micro en pl&aacute;stico duro (polimetilmetacrilato) para el an&aacute;lisis de las part&iacute;culas y las c&eacute;lulas mediante detecci&oacute;n &oacute;ptica. Seis de las fibras &oacute;pticas se incorporaron a la regi&oacute;n de interrogatorio de la viruta, en qu&eacute; enfoque hidrodin&aacute;mico estrechado la base corriente ~ 35 &mu;m &times; 40 &mu;m. El uso de un canal relativamente grande en la entrada, as&iacute; como en la regi&oacute;n de interrogatorio (375 &mu;m &times; 125 &mu;m) con &eacute;xito reducir al m&iacute;nimo el riesgo de obstrucci&oacute;n. El dispositivo podr&iacute;a soportar presiones superiores a 100 psi sin que se derrame. Ensayos con cifrado de micropart&iacute;culas y c&eacute;lulas fueron demostradas con el cit&oacute;metro de MicroFlujo. Inmunoensayos multiplexados detectan nueve diferentes bacterias y toxinas con una mezcla &uacute;nica de microesferas codificadas. Las c&eacute;lulas de c&aacute;ncer A549 procesadas con sondas de &aacute;cido nucleico bloqueado se evaluaron mediante fluorescencia hibridaci&oacute;n in situ.

Un cit&oacute;metro de MicroFlujo duro con flujo generado por el surco de la vaina para ensayos multiplexados de grano y de la c&eacute;lula.

Fluoromodules &#x662F;&#x7ED9;&#x5176;&#x540C;&#x6E90;&#x751F;&#x7269;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x540C;&#x4F34;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x5927;&#x5927;&#x589E;&#x5F3A;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD;&#x67D3;&#x6599;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x91CF;&#x5B50;&#x4EA7;&#x7387;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x975E;&#x5171;&#x4EF7;&#x7ED3;&#x5408;&#x540E;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x914D;&#x5408;&#x7269;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#xFF0C;&#x51E0;&#x4E2A;&#x5355;&#x94FE;&#x3001; &#x53D8;&#x91CF;&#x7247;&#x6BB5; &#xFF08;&#x5355;&#x94FE;&#x6297;&#x4F53;) &#x6297;&#x4F53;&#x5165;&#x9009;&#x4ECE;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A;&#x5E93;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x4ECE;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x4E0D;&#x5BF9;&#x79F0;&#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#x8986;&#x76D6;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x53EF;&#x89C1;&#x5149;&#x548C;&#x8FD1;&#x7EA2;&#x5916;&#x8C31;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x3002;&#x76EE;&#x524D;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x901A;&#x8FC7;&#x9009;&#x62E9;&#x548C;&#x7279;&#x6027;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x8367;&#x5149;&#x7D2B;&#x5438;&#x6536;&#x3001; &#x84DD; fluorescing &#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5641;&#x5511;&#x5E76;&#x567B;&#x5511;&#x6742;&#x73AF;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x7684; scFvs &#x4E00;&#x7EC4;&#x6269;&#x5C55;&#x57FA;&#x56E0;&#x7F16;&#x7801;&#x7684;&#x5355;&#x94FE;&#x6297;&#x4F53;&#x67D3;&#x6599;&#x5BF9;&#x6211;&#x4EEC;&#x6C47;&#x7684;&#x8F91;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x67D3;&#x6599;&#x5C06;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A;&#x548C;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027; scFvs &#x4F4E; nanomolar K(d) &#x503C;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x67D3;&#x6599;&#x86CB;&#x767D; fluoromodules &#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x63A5;&#x8FD1;&#x6700;&#x4EAE;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7EDF;&#x4E00;&#x7684;&#x9AD8;&#x91CF;&#x5B50;&#x4EA7;&#x7387;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B; scFvs &#x4E0E;&#x5176;&#x4ED6;&#x8367;&#x5149;&#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#x7684;&#x6EE5;&#x4EA4;&#x4E5F;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x68C0;&#x67E5;&#x3002;&#x8367;&#x5149;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x6F14;&#x793A;&#x9175;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A; scFvs &#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x5F69;&#x8272;&#x6210;&#x50CF;&#x3002;405 Nm &#x6FC0;&#x5149;&#x5171;&#x805A;&#x7126;&#x6210;&#x50CF;&#x548C;&#x8840;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E0A;&#x7684;&#x6D41;&#x884C;&#x4F7F;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x65B0;&#x8BD5;&#x5242;&#x5177;&#x6709;&#x6F5C;&#x5728;&#x4EF7;&#x503C;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;

&#x84DD;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;-&#x86CB;&#x767D;&#x590D;&#x5408;&#x7269;&#x57FA;&#x4E8E;&#x8367;&#x5149;&#x83C1;&#x67D3;&#x6599;&#x548C;&#x5355;&#x94FE;&#x6297;&#x4F53;&#x7247;&#x6BB5;&#x3002;

Fluoromodules are complexes formed upon the noncovalent binding of a fluorogenic dye to its cognate biomolecular partner, which significantly enhances the fluorescence quantum yield of the dye. Previously, several single-chain, variable fragment (scFv) antibodies were selected from a yeast cell surface-displayed library that activated fluorescence from a family of unsymmetrical cyanine dyes covering much of the visible and near-IR spectrum. The current work expands our repertoire of genetically encodable scFv-dye pairs by selecting and characterizing a group of scFvs that activate fluorogenic violet-absorbing, blue-fluorescing cyanine dyes, based on oxazole and thiazole heterocycles. The dye binds to both yeast cell surface-displayed and soluble scFvs with low nanomolar K(d) values. These dye-protein fluoromodules exhibit high quantum yields, approaching unity for the brightest system. The promiscuity of these scFvs with other fluorogenic cyanine dyes was also examined. Fluorescence microscopy demonstrates that the yeast cell surface-displayed scFvs can be used for multicolor imaging. The prevalence of 405 nm lasers on confocal imaging and flow cytometry systems make these new reagents potentially valuable for cell biological studies.

Blue fluorescent dye-protein complexes based on fluorogenic cyanine dyes and single chain antibody fragments.

Fluoromodules sont des complexes qui se forment lors de la liaison non covalente de colorant fluorog&eacute;niques &agrave; son partenaire biomol&eacute;culaire apparent&eacute;s, qui am&eacute;liore consid&eacute;rablement le rendement quantique de fluorescence du colorant. Auparavant, plusieurs anticorps variable de cha&icirc;ne unique, fragment (scFv) ont &eacute;t&eacute; choisis aupr&egrave;s d&#39;une biblioth&egrave;que de surface-affiche cellule levure qui a activ&eacute; la fluorescence d&#39;une famille de colorants cyanine asym&eacute;triques couvrant la majeure partie du spectre visible et infrarouge proche. Les travaux en cours &eacute;largit notre r&eacute;pertoire de paires g&eacute;n&eacute;tiquement encodable scFv-colorant en s&eacute;lectionnant et en caract&eacute;risant un groupe de scFvs qui activent des colorants cyanine violet-absorbant, fluorescence bleue fluorog&egrave;ne, issus des h&eacute;t&eacute;rocycles oxazole et thiazole. La teinture se lie &agrave; la cellule de levure surface affich&eacute;e tant scFvs soluble avec nanomolaires faible K(d) valeurs. Ces fluoromodules colorant-prot&eacute;ines pr&eacute;sentent des rendements quantiques &eacute;lev&eacute;s, de s&#39;approcher de l&#39;unit&eacute; du syst&egrave;me plus brillants. La promiscuit&eacute; de ces scFvs avec d&#39;autres teintures de cyanine fluorog&egrave;ne a &eacute;galement &eacute;t&eacute; examin&eacute;e. La microscopie de fluorescence montre que la levure cellule-surface affich&eacute;e scFvs peut &ecirc;tre utilis&eacute; pour l&#39;imagerie multicolore. La pr&eacute;valence des lasers &agrave; 405 nm sur les syst&egrave;mes confocal imagerie et &eacute;coulement cytometry rendre ces nouveaux r&eacute;actifs potentiellement utiles pour les &eacute;tudes en biologie cellulaire.

Des complexes prot&eacute;ine-teinture fluorescente bleue issu des colorants cyanine fluorog&eacute;niques et seule cha&icirc;ne fragments d&#39;anticorps.

Fluoromodules sind komplexe gebildet, auf die-Bindung eines Farbstoffes Fluorogenic zu seinem Verwandten Biomolekulare-Partner, die die Quantenausbeute der Fluoreszenz die F&auml;rbung deutlich verbessert. Zuvor wurden mehrere Einzel-Kette, Variable Fragment (ScFv) Antik&ouml;rper aus einer Hefe-Zelle-Oberfl&auml;che angezeigt-Bibliothek ausgew&auml;hlt, die Fluoreszenz aus einer Familie von unsymmetrischer Cyanine F&auml;rbungen f&uuml;r viel des Spektrums sichtbar und in der N&auml;he von IR aktiviert. Die aktuelle Arbeit erweitert unser Repertoire an genetisch encodable ScFv-Farbstoff-Paare durch Auswahl und Charakterisierung einer Gruppe von ScFvs, die Fluorogenic violett-absorbierende, blau fluoreszierende Cyanine F&auml;rbungen, basierend auf OXAZOL und thiazol Heterozyklen aktivieren. Der Farbstoff bindet an Hefezelle Oberfl&auml;che angezeigt und l&ouml;slichen ScFvs mit niedrigen Nanomolar K(d) Werten. Dieser Farbstoff-Protein-Fluoromodules weisen hohe Quanten-Renditen, n&auml;hert sich Einheit f&uuml;r das hellste System. Au&szlig;erdem wurde die Promiskuit&auml;t der diese ScFvs mit anderen Fluorogenic Cyanine F&auml;rbungen untersucht. Fluoreszenzmikroskopie zeigt, dass die Hefe Zelle Oberfl&auml;che angezeigt ScFvs f&uuml;r multicolor-Imaging verwendet werden kann. Die Pr&auml;valenz von 405 nm Laser auf konfokalen Bildgebung und Flow Cytometry-Systemen machen diese neuen Reagenzien potentiell wertvoll f&uuml;r Zelle biologische Studien.

Blau fluoreszierenden Farbstoff-Protein-komplexen Grundlage Fluorogenic Cyanine F&auml;rbungen und einzelne Kette Antik&ouml;rperfragmenten.

Fluoromodules sono complessi formate sul legame non covalente di un colorante fluorogenic al proprio partner affine biomolecolare, che migliora sensibilmente il rendimento quantico di fluorescenza del colorante. In precedenza, diversi anticorpi catena singola, variabile frammento (scFv) sono stati selezionati da una lievito cella visualizzato superficie libreria che attivato fluorescenza da una famiglia di coloranti cianina asimmetrico che coprono gran parte dello spettro visibile e vicino IR. Il lavoro attuale espande il nostro repertorio di coppie geneticamente encodable scFv-colorante selezionando e che caratterizza un gruppo di scFvs che attivano le tinture di fluorogenic cianina viola-assorbente, che reagiscono in blu, basati su oxazole e tiazolo eterociclico. Il colorante si lega a cellule di lievito superficie visualizzata sia solubile scFvs con bassa nanomolari K(d) valori. Queste tinture-proteina fluoromodules esibiscono quantum ad alta resa, avvicinando l&#39;unit&agrave; per il sistema pi&ugrave; brillante. La promiscuit&agrave; di questi scFvs con altri coloranti cianina fluorogenic inoltre &egrave; stata esaminata. Microscopia di fluorescenza dimostra che il lievito cella visualizzato superficie scFvs pu&ograve; essere utilizzato per l&#39;imaging multicolor. La prevalenza di laser a 405 nm su confocali sistemi di imaging e flusso cytometry rendono questi nuovi reagenti potenzialmente preziosa per gli studi biologici cellulari.

Complessi di tintura-proteina fluorescente blu basato su fluorogenic cianina coloranti e singola catena frammenti di anticorpo.

Fluoromodules &#x932F;&#x4F53;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x8272;&#x7D20;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x91CF;&#x5B50;&#x53CE;&#x7387;&#x3092;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x305D;&#x306E;&#x540C;&#x65CF;&#x751F;&#x4F53;&#x5206;&#x5B50;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x306B;&#x5171;&#x6709;&#x7684;&#x7D50;&#x5408;&#x304C;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x5358;&#x4E00;&#x30C1;&#x30A7;&#x30FC;&#x30F3;&#x3001;&#x53EF;&#x5909;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8; &#xFF08;&#x7121;&#x7D30;&#x80DE;) &#x6297;&#x4F53;&#x306F;&#x53EF;&#x8996;&#x30FB;&#x8FD1;&#x8D64;&#x5916;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x306E;&#x591A;&#x304F;&#x3092;&#x30AB;&#x30D0;&#x30FC;&#x3059;&#x308B;&#x975E;&#x5BFE;&#x79F0;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20;&#x306E;&#x5BB6;&#x65CF;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x3092;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x5316;&#x3057;&#x305F;&#x9175;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x793A;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x3092;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x4F5C;&#x696D;&#x3092;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x3066;&#x86CD;&#x5149;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30EC;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x5438;&#x53CE;&#x3001;&#x9752;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x3092;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20;&#x3001;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B5;&#x30BE;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x30C1;&#x30A2;&#x30BE;&#x30FC;&#x30EB;&#x8907;&#x7D20;&#x74B0;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x5316; scFvs &#x306E;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x308B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x7121;&#x7D30;&#x80DE;&#x8272;&#x7D20;&#x306E;&#x30DA;&#x30A2;&#x306E;&#x79C1;&#x305F;&#x3061;&#x306E;&#x30EC;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x5C55;&#x958B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x67D3;&#x6599;&#x306F;&#x9175;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027; scFvs &#x4F4E;&#x30CA;&#x30CE;&#x30E2;&#x30EB; K(d) &#x5024;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x8272;&#x7D20;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; fluoromodules &#x660E;&#x308B;&#x3044;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x56E3;&#x7D50;&#x306B;&#x8FD1;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x9AD8;&#x3044;&#x91CF;&#x5B50;&#x53CE;&#x7387;&#x3092;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x3068;&#x4ED6;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x767A;&#x751F;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20; scFvs &#x306E;&#x4E71;&#x4EA4;&#x3082;&#x691C;&#x8A0E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x9175;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x793A; scFvs &#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30AB;&#x30E9;&#x30FC; &#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x8A66;&#x85AC;&#x306F; 405 nm &#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x5171;&#x7126;&#x70B9;&#x753B;&#x50CF;&#x3068;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC; &#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30AB;&#x30E9;&#x30FC;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x4E0A;&#x306E;&#x6709;&#x75C5;&#x7387;&#x3092;&#x7D30;&#x80DE;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306B;&#x8CB4;&#x91CD;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x9752;&#x8272;&#x86CD;&#x5149;&#x8272;&#x7D20;&#x86CB;&#x767D;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x86CD;&#x5149;&#x30B7;&#x30A2;&#x30CB;&#x30F3;&#x8272;&#x7D20;&#x3068;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#x6297;&#x4F53;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x304F;&#x3060;&#x3055;&#x3044;&#x3002;

Fluoromodules&#xB294; &#xD06C;&#xAC8C; &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xC591;&#xC790; &#xC218;&#xC728;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC871; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108;&#xC5D0; fluorogenic &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC758; noncovalent &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xD615;&#xC131; &#xB41C; &#xB2E8;&#xC9C0;. &#xC774;&#xC804;&#xC5D0;, &#xC5EC;&#xB7EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xCCB4;&#xC778;, &#xAC00;&#xBCC0; &#xC870;&#xAC01; (scFv) &#xD56D; &#xCCB4;&#xB294; &#xD45C;&#xC2DC;&#xC640; &#xAC00;&#xAE4C;&#xC6B4; IR &#xC2A4;&#xD399;&#xD2B8;&#xB7FC;&#xC758; &#xB9CE;&#xC740; &#xCDE8;&#xC7AC; &#xB2E8;&#xC0C1; cyanine &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC758; &#xAC00;&#xC871;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD615;&#xAD11;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xC815; &#xB410;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; &#xC791;&#xC5C5;&#xC744; &#xC120;&#xD0DD; &#xD558; &#xACE0; scFvs fluorogenic &#xD761;&#xC218; &#xD558;&#xB294; &#xBC14;&#xC774;&#xC62C;&#xB81B;, &#xBE14;&#xB8E8; fluorescing cyanine &#xC5FC;&#xB8CC;, oxazole &#xBC0F; thiazole heterocycles&#xC5D0; &#xAE30;&#xBC18;&#xC744; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC744; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC778;&#xCF54;&#xB529;&#xD560; scFv &#xC5FC;&#xB8CC; &#xC30D;&#xC758; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xB808; &#xD37C; &#xD1A0;&#xB9AC;&#xB97C; &#xD655;&#xC7A5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5FC;&#xB8CC;&#xB294; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74; &#xD45C;&#xC2DC; &#xBC0F; &#xB0AE;&#xC740; nanomolar K(d) &#xAC12;&#xC744; &#xAC16;&#xB294; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; Scfvs&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5FC;&#xB8CC; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; fluoromodules &#xB192;&#xC740; &#xC591;&#xC790; &#xC218;&#xC728;, &#xB611;&#xB611;&#xD55C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xD569; &#xC811;&#xADFC; &#xC804;&#xC2DC;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; scFvs &#xB2E4;&#xB978; fluorogenic cyanine &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC640;&#xC758; &#xC131;&#xD589;&#xC704;&#xB3C4; &#xC870;&#xC0AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95; &#xD6A8; &#xBAA8; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74; &#xD45C;&#xC2DC; scFvs &#xBA40;&#xD2F0; &#xCEEC;&#xB7EC; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. 405 Nm &#xB808;&#xC774;&#xC800; confocal &#xC601;&#xC0C1; &#xBC0F; &#xD750;&#xB984; cytometry &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xBCF4;&#xAE09;&#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC2DC; &#xC57D; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC00;&#xCE58; &#xC788;&#xB294; &#xD655;&#xC778; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Fluorogenic cyanine &#xC5FC;&#xB8CC; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xC77C; &#xCCB4;&#xC778; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xD3B8; &#xAE30;&#xBC18; &#xBE14;&#xB8E8; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC;-&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBCF5;&#xD569;&#xBB3C;.

Fluoromodules son complejos formados por la Uni&oacute;n no covalente de un tinte fluorogenic a su socio cognado biomolecular, que mejora significativamente el rendimiento cu&aacute;ntico de la fluorescencia del tinte. Anteriormente, varios anticuerpos de cadena simple, variable fragmento (scFv) fueron seleccionados de una biblioteca de levadura se muestran en superficie de c&eacute;lulas que activan la fluorescencia de una familia de tintes Cianina asim&eacute;trica que cubre gran parte del espectro visible y cercano-IR. El trabajo actual expande nuestro repertorio de pares gen&eacute;ticamente puedan codificarse con tinte scFv seleccionando y caracterizaci&oacute;n de un grupo de scFvs que activan fluorogenic tintes de Cianina absorben el violeta, azul-fluorescencia, partiendo de heterociclos oxazoles y tiazol. El tinte se une a tanto scFvs soluble con nanomolar baja K(d) valores como se muestran en superficie de la c&eacute;lula de levadura. Estos fluoromodules colorante-prote&iacute;na exhiben cu&aacute;ntica alto rendimientos, acerc&aacute;ndose a la unidad para el sistema m&aacute;s brillante. Tambi&eacute;n se examin&oacute; la promiscuidad de estos scFvs con otros tintes de Cianina fluorogenic. Microscop&iacute;a de fluorescencia demuestra que el scFvs se muestran en superficie c&eacute;lula de levadura puede utilizarse para im&aacute;genes multicolor. La prevalencia de l&aacute;seres de 405 nm en sistemas de citometr&iacute;a flujo y proyecci&oacute;n de imagen confocales hacen estos nuevos reactivos potencialmente valioso para estudios de biolog&iacute;a celular.

Complejos de prote&iacute;na-tinte fluorescente azul basan en fluorogenic Cianina tintes y cadena solo fragmentos de anticuerpos.

Les virus sont d&#39;un int&eacute;r&ecirc;t particulier comme les &eacute;chafaudages pour les applications de la biotechnologie compte tenus de leur vaste gamme de formes et de tailles et de la possibilit&eacute; de les modifier avec une vari&eacute;t&eacute; des portions fonctionnelles pour produire des nanoparticules utiles de base de virus (VNPs). Afin de d&eacute;velopper des VNPs fonctionnels pour l&#39;imagerie cellulaire et les applications de cytom&eacute;trie en flux, nous avons utilis&eacute; la t&ecirc;te du bact&eacute;riophage T4 comme un &eacute;chafaudage pour bioconjugaison des colorants fluorescents. Bact&eacute;riophage T4 est un virus &agrave; ADN double brin avec une t&ecirc;te allong&eacute;e icosa&egrave;dre et une queue contractile. La t&ecirc;te est &sim;100 nm de longueur et &sim;90 nm de large. La grande surface de la t&ecirc;te de la T4 est un avantage important pour le d&eacute;veloppement de mat&eacute;riaux fonctionnels puisqu&#39;il peut accueillir beaucoup de plus grands nombres de groupes fonctionnels, tels que des colorants fluorescents, en comparaison avec d&#39;autres VNPs. Dans cette &eacute;tude, Cy3 et Alexa Fluor 546 &eacute;taient chimiquement incorpor&eacute; dans t&ecirc;tes de T4 sans queue (nanoparticules T4) pour la premi&egrave;re fois, et les propri&eacute;t&eacute;s fluorescentes des nanoparticules colorant conjugu&eacute; ont &eacute;t&eacute; caract&eacute;ris&eacute;es. Les nanoparticules de T4 ont &eacute;t&eacute; &eacute;tiquet&eacute;s avec les colorants jusqu&#39;&agrave; 19 000, et en particulier, l&#39;utilisation de Cy3 conduit &agrave; am&eacute;liorations fluorescentes de jusqu&#39;&agrave; 90 % par rapport &agrave; Cy3 gratuit. Nous d&eacute;montrons &eacute;galement que les nanoparticules de T4 colorant conjugu&eacute; sont structurellement stables et qu&#39;ils peuvent servir comme sondes mol&eacute;culaires pour les applications des piles d&#39;imagerie et d&#39;&eacute;coulement cytometry.

Ing&eacute;nierie T4 nanoparticules virale cellulaire cytometry d&#39;imagerie et de d&eacute;bit.

&#x75C5;&#x6BD2;&#x7279;&#x522B;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x751F;&#x7269;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7ED9;&#x4E88;&#x5176;&#x8303;&#x56F4;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x5F62;&#x72B6;&#x548C;&#x5927;&#x5C0F;&#x548C;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x6765;&#x4FEE;&#x6539;&#x5B83;&#x4EEC;&#x5177;&#x6709;&#x5404;&#x79CD;&#x529F;&#x80FD;&#x4E9A;&#x80FA;&#x751F;&#x4EA7;&#x6709;&#x7528;&#x75C5;&#x6BD2;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7EB3;&#x7C73;&#x7C92;&#x5B50; (VNPs) &#x7684;&#x652F;&#x67B6;&#x6750;&#x6599;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x5F00;&#x53D1;&#x529F;&#x80FD; VNPs &#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x548C;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4F5C; T4 &#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x5934;&#x652F;&#x67B6; bioconjugation &#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x3002;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53; T4 &#x662F;&#x5E26;&#x8292;&#x4E8C;&#x5341;&#x9762;&#x4F53;&#x6536;&#x7F29;&#x5934;&#x5C3E;&#x7684;&#x53CC;&#x94FE; DNA &#x75C5;&#x6BD2;&#x3002;&#x5934;&#x662F; &sim;100 nm &#x7684;&#x957F;&#x5EA6;&#x548C;&#x5BBD;&#x5EA6;&#x5728; &sim;90 nm&#x3002;T4 &#x5934;&#x8868;&#x9762;&#x79EF;&#x5927;&#x662F;&#x529F;&#x80FD;&#x6750;&#x6599;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x4F18;&#x52BF;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5BB9;&#x7EB3;&#x5927;&#x53F7;&#x7801;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x7EC4;&#xFF0C;&#x5982;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5176;&#x4ED6; VNPs&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;Cy3 &#x548C; Alexa &#x6C1F; 546 &#x88AB;&#x5316;&#x5B66;&#x7EB3;&#x5165;&#x5C3E;&#x6B20; T4 &#x5143;&#x9996; (T4 &#x7EB3;&#x7C73;) &#x9996;&#x6B21;&#x548C;&#x67D3;&#x6599;&#x5171;&#x8F6D;&#x7EB3;&#x7C73;&#x7C92;&#x5B50;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x7279;&#x6027;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x3002;T4 &#x7EB3;&#x7C73;&#x7C92;&#x5B50;&#x6807;&#x8BB0;&#x67D3;&#x6599;&#x8FBE; 19 &#x4E07;&#x4EBA;&#xFF0C;&#x548C;&#x7279;&#x522B;&#x662F; Cy3 &#x7684;&#x4F7F;&#x7528;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x8FBE; 90%&#xFF0C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x514D;&#x8D39; Cy3 &#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x589E;&#x5F3A;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x8868;&#x660E;&#x67D3;&#x6599;&#x5171;&#x8F6D; T4 &#x7EB3;&#x7C73;&#x7C92;&#x5B50;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x7A33;&#x5B9A;&#x548C;&#x5B83;&#x4EEC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7528;&#x4F5C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x548C;&#x8840;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;&#x5E94;&#x7528;&#x5206;&#x5B50;&#x63A2;&#x9488;&#x3002;

&#x7EB3;&#x7C73;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684; T4 &#x75C5;&#x6BD2;&#x6027;&#x7C92;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6210;&#x50CF;&#x4E0E;&#x6D41;&#x5F0F;&#x3002;

Viruses are of particular interest as scaffolds for biotechnology applications given their wide range of shapes and sizes and the possibility to modify them with a variety of functional moieties to produce useful virus-based nanoparticles (VNPs). In order to develop functional VNPs for cell imaging and flow cytometry applications, we used the head of the T4 bacteriophage as a scaffold for bioconjugation of fluorescent dyes. Bacteriophage T4 is a double-stranded DNA virus with an elongated icosahedron head and a contractile tail. The head is âˆ¼100 nm in length and âˆ¼90 nm in width. The large surface area of the T4 head is an important advantage for the development of functional materials since it can accommodate significantly larger numbers of functional groups, such as fluorescent dyes, in comparison with other VNPs. In this study, Cy3 and Alexa Fluor 546 were chemically incorporated into tail-less T4 heads (T4 nanoparticles) for the first time, and the fluorescent properties of the dye-conjugated nanoparticles were characterized. The T4 nanoparticles were labeled with up to 19â€‰000 dyes, and in particular, the use of Cy3 led to fluorescent enhancements of up to 90% compared to free Cy3. We also demonstrate that the dye-conjugated T4 nanoparticles are structurally stable and that they can be used as molecular probes for cell imaging and flow cytometry applications.

Engineered T4 viral nanoparticles for cellular imaging and flow cytometry.

Viren sind von besonderem Interesse als Ger&uuml;ste f&uuml;r biotechnologische Anwendungen aufgrund ihrer Vielzahl von Formen und Gr&ouml;&szlig;en und die M&ouml;glichkeit, sie mit einer Vielzahl von funktionalen Adsorptionseigenschaften produzieren n&uuml;tzliche Virus-basierte Nanopartikel (VNPs) zu &auml;ndern. Um funktionale VNPs f&uuml;r Zelle Darstellung und Flow Cytometry-Anwendungen zu entwickeln, haben wir die Leiter der Bakteriophage T4 als ein Ger&uuml;st f&uuml;r Bioconjugation von fluoreszierenden Farbstoffen. Bakteriophage T4 ist ein Doppelstrang-DNA-Virus mit einem l&auml;nglichen Ikosaeder-Kopf und einem kontraktilen Schwanz. Der Kopf ist &sim;100 nm L&auml;nge und &sim;90 nm breit. Die gro&szlig;e Oberfl&auml;che des Kopfes T4 ist ein wichtiger Vorteil f&uuml;r die Entwicklung von funktionalen Materialien, da es erheblich gr&ouml;&szlig;ere Anzahl von funktionellen Gruppen, wie z. B. Leuchtstofff&auml;rbungen, im Vergleich zu anderen VNPs unterbringen kann. In dieser Studie Cy3 und Alexa Fluor 546 wurden chemisch einverleibt Schwanz weniger T4 K&ouml;pfe (T4-Nanopartikeln) zum ersten Mal, und die fluoreszierenden Eigenschaften der Farbstoff-konjugierten Nanopartikel waren gekennzeichnet. Die T4-Nanopartikel mit bis zu 19 000 Farbstoffe gekennzeichnet wurden, und insbesondere die Verwendung von Cy3 zu fluoreszierende Verbesserungen von bis zu 90 % im Vergleich zum freien Cy3 gef&uuml;hrt. Wir zeigen auch, dass die Farbstoff-konjugierten T4-Nanopartikel strukturell stabil sind und dass sie als molekulare Sonden f&uuml;r Zelle Bildgebung und Flow Cytometry-Anwendungen verwendet werden k&ouml;nnen.

Manipulierte T4 virale Nanopartikel f&uuml;r zellul&auml;re Bildgebung und Flow Cytometry.

I virus sono di particolare interesse come ponteggi per applicazioni della biotecnologia date loro vasta gamma di forme e dimensioni e la possibilit&agrave; di modificarli con una variet&agrave; di moiety funzionale a produrre utili virus-ha basato le nanoparticelle (VNPs). Al fine di sviluppare VNPs funzionale per imaging cellulare e applicazioni di citometria a flusso, abbiamo usato la testa del batteriofago T4 come un&#39;impalcatura per bioconjugation di tinture fluorescenti. Batteriofago T4 &egrave; un virus a DNA double-stranded con una testa allungata icosaedro ed una coda contrattile. La testa &egrave; &sim;100 nm di lunghezza e &sim;90 nm di larghezza. La grande area di superficie della testa T4 &egrave; un vantaggio importante per lo sviluppo di materiali funzionali poich&eacute; pu&ograve; ospitare significativamente pi&ugrave; grandi numeri di gruppi funzionali, come ad esempio tinture fluorescenti, rispetto ad altri VNPs. In questo studio, Cy3 e Alexa Fluor 546 chimicamente sono stati incorporati in teste di coda-di meno T4 (T4 nanoparticelle) per la prima volta, e sono state caratterizzate le propriet&agrave; delle nanoparticelle coniugata con un colorante fluorescente. Le nanoparticelle di T4 sono state etichettate con coloranti fino a 19 000, e in particolare, l&#39;uso di Cy3 port&ograve; a miglioramenti fluorescenti fino al 90% rispetto al Cy3 gratis. Abbiamo anche dimostrare che le nanoparticelle di T4 coniugato con colorante sono strutturalmente stabile e che possono essere utilizzati come sonde molecolari per applicazioni di cell imaging e flusso cytometry.

Ingegnerizzati T4 virale nanoparticelle per la citometria a flusso e imaging cellulare.

&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x306F;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306B;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3061;&#x307E;&#x3059;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; &#x30CA;&#x30CE;&#x7C92;&#x5B50; (VNPs) &#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x30DB;&#x30B9;&#x30DB;&#x30F3;&#x306E;&#x69D8;&#x3005; &#x306A;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x56F3;&#x5F62;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x3068;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x7528;&#x306E;&#x8DB3;&#x5834;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x7279;&#x306B;&#x8208;&#x5473;&#x306E;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6A5F;&#x80FD; VNPs &#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6D41;&#x308C; cytometry &#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x6211;&#x3005; T4 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x982D;&#x3092;&#x8DB3;&#x5834;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x306E;&#x5316;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;T4 &#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x7D30;&#x9577;&#x3044;&#x30A4;&#x30B3;&#x30B5;&#x30D8;&#x30C9;&#x30ED;&#x30F3;&#x982D;&#x3068;&#x53CE;&#x7E2E;&#x306E;&#x5C3E;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x4E8C;&#x672C;&#x9396; DNA &#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x982D;&#x9577; &sim;100 nm &#x3068; &sim;90 nm &#x306E;&#x5E45;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x4EE5;&#x6765;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x4ED6;&#x306E; VNPs &#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x306E;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x6570;&#x5B57;&#x3092;&#x53CE;&#x5BB9;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x8868;&#x9762;&#x7A4D; T4 &#x306E;&#x982D;&#x90E8;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x6750;&#x6599;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x5229;&#x70B9;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;, Cy3 &#x304A;&#x3088;&#x3073; Alexa &#x30D5;&#x30EB;&#x30A2;&#x30FC; 546 &#x5316;&#x5B66;&#x5C3E;&#x30EC;&#x30B9; T4 &#x982D; (T4 &#x30CA;&#x30CE;&#x7C92;&#x5B50;) &#x306B;&#x521D;&#x3081;&#x3066;&#x3001;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x3057;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x8272;&#x7D20;&#x5171;&#x5F79;&#x7CFB;&#x30CA;&#x30CE;&#x7C92;&#x5B50;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x304C;&#x3044;&#x305F;&#x3002;T4 &#x30CA;&#x30CE;&#x7C92;&#x5B50; 19 000 &#x67D3;&#x6599;&#x3067;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x4ED8;&#x3051;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x3001;Cy3 &#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x7121;&#x6599; Cy3 &#x306B;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x6700;&#x5927; 90 &#xFF05; &#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x5F37;&#x5316;&#x306B;&#x3064;&#x306A;&#x304C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x67D3;&#x6599;&#x5171;&#x5F79; T4 &#x306E;&#x30CA;&#x30CE;&#x7C92;&#x5B50;&#x304C;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x306B;&#x5B89;&#x5B9A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6D41;&#x308C; cytometry &#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x7528;&#x5206;&#x5B50;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

T4 &#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9; &#x30CA;&#x30CE;&#x7D30;&#x80DE;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x7528;&#x3002;

&#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC0DD;&#xBA85; &#xACF5;&#xD559; &#xC751;&#xC6A9; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xBAA8;&#xC591; &#xBC0F; &#xD06C;&#xAE30;&#xC640; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xAC10;&#xC548;&#xD560; &#xB54C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5; moieties &#xC720;&#xC6A9;&#xD55C; &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xAE30;&#xBC18; &#xB098;&#xB178; &#xC785;&#xC790; (VNPs)&#xC744; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC218;&#xC815;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC74;&#xC124; &#xAE30;&#xACC4; &#xC784;&#xB300;&#xB85C;&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC774; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC138;&#xD3EC; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; &#xD750;&#xB984; cytometry &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5; Vnps&#xC744; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC;&#xC758; bioconjugation&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;&#xB97C; &#xBC1C;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C; T4 &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0;&#xC758; &#xBA38;&#xB9AC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC624;&#xD30C;&#xC9C0; T4 &#xAE38;&#xCB49;&#xD55C; &#xC815;&#xC774;&#xC2ED;&#xBA74;&#xCCB4; &#xBA38;&#xB9AC;&#xC640; &#xC218;&#xCD95; &#xC131; &#xAF2C;&#xB9AC; &#xC774;&#xC911; &#xAC00;&#xB2E5; DNA &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC774;&#xB2E4;. &sim;100 nm &#xAE38;&#xC774; &#xD3ED;&#xC5D0; &sim;90 nm&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. T4 &#xBA38;&#xB9AC; &#xD070; &#xD45C;&#xBA74;&#xC801; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xB978; Vnps&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC; &#xB4F1; &#xAE30;&#xB2A5; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD788; &#xD070; &#xC22B;&#xC790;&#xB97C; &#xC218;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC131; &#xBB3C;&#xC9C8;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC7A5;&#xC810;&#xC774; &#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; Cy3 &#xBC0F; &#xC54C; &#xB809; &#xC0AC; &#xD615; &#xC11D; 546 &#xD588;&#xB2E4; &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xD1B5;&#xD569; &#xAF2C;&#xB9AC; &#xC5C6;&#xB294; T4 &#xBA38;&#xB9AC; (T4 &#xB098;&#xB178; &#xC785;&#xC790;)&#xC5D0; &#xCC98;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558; &#xACE0; &#xC5FC;&#xB8CC; conjugated &#xB098;&#xB178; &#xC785;&#xC790;&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xC18D;&#xC131; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xD588;&#xB2E4;. T4 &#xB098;&#xB178; &#xC785;&#xC790; 19 000 &#xC5FC;&#xB8CC;&#xB85C; &#xBD84;&#xB958; &#xD588;&#xB2E4; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xD788;, Cy3 &#xC0AC;&#xC6A9; &#xBB34;&#xB8CC; cy3&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xCD5C;&#xB300; 90%&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xD5A5;&#xC0C1;&#xC744; &#xC8FC;&#xB3C4;. &#xB610;&#xD55C; &#xC5FC;&#xB8CC; conjugated T4 &#xB098;&#xB178; &#xC785;&#xC790;&#xB294; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC548;&#xC815; &#xD558; &#xACE0; &#xC138;&#xD3EC; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; &#xD750;&#xB984; cytometry &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC138;&#xD3EC; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBC0F; &#xD750;&#xB984; cytometry &#xC704;&#xD574; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C; T4 &#xBC14;&#xC774;&#xB7EC;&#xC2A4; &#xC131; &#xB098;&#xB178;

Los virus son de especial inter&eacute;s como andamios para aplicaciones biotecnol&oacute;gicas dados su amplio rango de formas y tama&ntilde;os y la posibilidad de modificarlas con una variedad de grupos funcionales para producir &uacute;tiles nanopart&iacute;culas basadas en virus (VNPs). Con el fin de desarrollar el VNPs funcionales para la proyecci&oacute;n de imagen de c&eacute;lula y aplicaciones de la citometr&iacute;a de flujo, utilizamos la cabeza del bacteri&oacute;fago T4 como un andamio para bioconjugation de tintes fluorescentes. Bacteri&oacute;fago T4 es un virus de ADN de doble hebra con una cabeza de icosaedro alargada y una cola contr&aacute;ctil. La cabeza es &sim;100 nm de longitud y &sim;90 nm de ancho. La gran superficie de la cabeza de la T4 es una ventaja importante para el desarrollo de materiales funcionales, ya que puede alojar a un n&uacute;mero significativamente mayor de grupos funcionales, tales como tintes fluorescentes, en comparaci&oacute;n con otros VNPs. En este estudio, Cy3 y Alexa Fluor 546 qu&iacute;micamente se incorporaron a la cabeza de cola-less T4 (T4 nanopart&iacute;culas) por primera vez, y se caracterizaron las propiedades fluorescentes de las nanopart&iacute;culas conjugados con tinte. Las nanopart&iacute;culas de T4 fueron etiquetadas con tintes de hasta 19 000, y en particular, el uso de Cy3 condujo a fluorescentes mejoras de hasta un 90% en comparaci&oacute;n con Cy3 gratis. Tambi&eacute;n demostramos que las nanopart&iacute;culas de T4 conjugados con tinte son estructuralmente estables y que pueden ser utilizados como sondas moleculares para aplicaciones de celdas de proyecci&oacute;n de imagen y flujo cytometry.

Ingenier&iacute;a T4 virales nanopart&iacute;culas para celular citometr&iacute;a de flujo y la proyecci&oacute;n de imagen.

Descriviamo lo sviluppo e test di un metodo di alto-rendimento che consente la rilevazione di piccoli RNA non codificante (ncRNAs) da singole cellule batteriche mediante acido nucleico locked sonde (LNA) e flusso cytometry-fluorescenza l&#39;ibridazione in situ (flusso-pesce). Il metodo di flusso-pesce LNA e reverse transcription-PCR quantitativa (qRT-PCR) sono stati utilizzati per monitorare l&#39;espressione di tre ncRNAs (6S, CsrB e TPP-2) nelle colture ATCC BAA-1116 di Vibrio campbellii durante la fase di lag, met&agrave; fase e fase stazionaria. Sia LNA flusso-pesce e qRT-PCR ha rivelato che CsrB e TPP-2 erano altamente espresso durante la fase di lag ma marcatamente ridotta a met&agrave; fase e fase stazionaria, mentre 6S dimostrato no a little espressione durante la fase di ritardo ma &egrave; aumentato da allora in poi. D&#39;importanza, mentre LNA flusso-pesce e qRT-PCR ha dimostrato simili tendenze di espressione globale, solo LNA flusso-pesce, che ha permesso l&#39;individuazione di ncRNAs in singole celle in contrasto con le misurazioni basate su lisato ensemble generate da qRT-PCR, &egrave; stata in grado di catturare l&#39;eterogeneit&agrave; cellula-cellula nell&#39;espressione di ncRNA. Come tale, questo studio dimostra un nuovo metodo che contemporaneamente permette il rilevamento in situ di ncRNAs e la determinazione di eterogeneit&agrave; di espressione genica all&#39;interno di una popolazione batterica isogeni.

Bloccato l&#39;acido nucleico e flusso cytometry-fluorescenza l&#39;ibridazione in situ per la rilevazione dei batteri piccoli RNA non codificante.

&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x53D1;&#x5C55;&#x548C;&#x4ECE;&#x5355;&#x4E2A;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4F7F;&#x7528;&#x9501;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5C0F;&#x975E;&#x7F16;&#x7801; Rna &#xFF08;ncRNAs&#xFF09; &#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x63A2;&#x5934; (&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;) &#x548C;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;-&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F; &#xFF08;&#x6D41;&#x9C7C;&#xFF09;&#x3002;&#x5B9A;&#x91CF;&#x9006;&#x8F6C;&#x5F55; PCR (qRT PCR) &#x4E0E;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#x65B9;&#x6CD5;&#x88AB;&#x7528;&#x6765;&#x76D1;&#x6D4B;&#x5728;&#x6EDE;&#x540E;&#x671F;&#x3001; mid-log &#x9636;&#x6BB5;&#x4E0E;&#x56FA;&#x5B9A;&#x76F8;&#x7684;&#x5F27;&#x83CC; campbellii ATCC BAA-1116&#x5E74;&#x6587;&#x5316;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A; ncRNAs (6S&#x3001; CsrB &#x548C; TPP 2) &#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#x548C; qRT PCR &#x900F;&#x9732; CsrB &#x548C; TPP 2 &#x9AD8;&#x5EA6;&#x671F;&#x95F4;&#x8868;&#x8FBE;&#x4E86;&#x5728; mid-log &#x9636;&#x6BB5;&#x53CA;&#x5E73;&#x7A33;&#x7684;&#x9636;&#x6BB5;&#xFF0C;&#x4F46;&#x663E;&#x8457;&#x51CF;&#x5C11;&#x6EDE;&#x540E;&#x671F;&#x800C; 6S &#x8868;&#x660E;&#x4E0D;&#x6EDE;&#x540E;&#x671F;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x5F88;&#x5C11;&#x8868;&#x8FBE;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6B64;&#x540E;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;&#x9C7C;&#x548C; qRT-&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x663E;&#x793A;&#x51FA;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7684;&#x6574;&#x4F53;&#x8868;&#x8FBE;&#x8D8B;&#x52BF;&#x3001; &#x4F4E;&#x566A;&#x58F0;&#x653E;&#x5927;&#x5668;&#x6D41;-&#x9C7C;&#xFF0C;&#xFF0C;&#x53EA;&#x6709;&#x542F;&#x7528;&#x4E86; ncRNAs &#x4E2D;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#xFF0C;&#x800C;&#x4E0D;&#x662F;&#x7531; qRT-&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x751F;&#x6210;&#x57FA;&#x4E8E;&#x88C2;&#x89E3;&#x7684;&#x5408;&#x594F;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#xFF0C;&#x662F;&#x80FD;&#x591F;&#x6355;&#x83B7;&#x8FDB;&#x5C55;&#x8868;&#x8FBE;&#x5F0F;&#x4E2D;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5F02;&#x8D28;&#x6027;&#x3002;&#x4E3A;&#x6B64;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x6F14;&#x793A;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x4F7F; ncRNAs &#x539F;&#x4F4D;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x57FA;&#x56E0;&#x8868;&#x8FBE;&#x975E;&#x5747;&#x8D28;&#x6027;&#x7B49;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x7FA4;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x51B3;&#x5FC3;&#x3002;

&#x9501;&#x5B9A;&#x6838;&#x9178;&#x548C;&#x6D41;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4EEA;-&#x8367;&#x5149;&#x539F;&#x4F4D;&#x6742;&#x4EA4;&#x6280;&#x672F;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7EC6;&#x83CC;&#x5C0F;&#x975E;&#x7F16;&#x7801; Rna&#x3002;

We describe the development and testing of a high-throughput method that enables the detection of small noncoding RNAs (ncRNAs) from single bacterial cells using locked nucleic acid probes (LNA) and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (flow-FISH). The LNA flow-FISH method and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) were used to monitor the expression of three ncRNAs (6S, CsrB, and TPP-2) in Vibrio campbellii ATCC BAA-1116 cultures during lag phase, mid-log phase, and stationary phase. Both LNA flow-FISH and qRT-PCR revealed that CsrB and TPP-2 were highly expressed during lag phase but markedly reduced in mid-log phase and stationary phase, whereas 6S demonstrated no to little expression during lag phase but increased thereafter. Importantly, while LNA flow-FISH and qRT-PCR demonstrated similar overall expression trends, only LNA flow-FISH, which enabled the detection of ncRNAs in individual cells as opposed to the lysate-based ensemble measurements generated by qRT-PCR, was able to capture the cell-to-cell heterogeneity in ncRNA expression. As such, this study demonstrates a new method that simultaneously enables the in situ detection of ncRNAs and the determination of gene expression heterogeneity within an isogenic bacterial population.

Locked nucleic acid and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization for the detection of bacterial small noncoding RNAs.

Nous d&#xE9;crivons le d&#xE9;veloppement et le test d&#x26;#39;une m&#xE9;thode &#xE0; haut d&#xE9;bit qui permet la d&#xE9;tection des ARN non codants (ARNnc petites) &#xE0; partir de simples cellules bact&#xE9;riennes en utilisant des sondes d&#x26;#39;acide nucl&#xE9;ique verrouill&#xE9; (LNA) et la cytom&#xE9;trie en flux par fluorescence par hybridation in situ (FISH-d&#xE9;bit). Le flux de LNA-FISH m&#xE9;thode et quantitative de transcription inverse-PCR (qRT-PCR) ont &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;es pour contr&#xF4;ler l&#x26;#39;expression de trois ARNnc (6S, CsrB, et PPT-2) dans Vibrio campbellii ATCC BAA-1116 lors de la phase de latence des cultures, &#xE0; mi- connecter de phase, et la phase stationnaire. Les deux flux de LNA-FISH et qRT-PCR a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; que CsrB et PPT-2 ont &#xE9;t&#xE9; fortement exprim&#xE9;e au cours de la phase de latence, mais nettement r&#xE9;duite &#xE0; la mi-journal de phase et la phase stationnaire, tandis que 6S d&#xE9;montr&#xE9; aucune &#xE0; l&#x26;#39;expression peu au cours de la phase de latence, mais a augment&#xE9; par la suite. Il est important, tout en LNA d&#xE9;bit-FISH et qRT-PCR a d&#xE9;montr&#xE9; des tendances semblables &#xE0; l&#x26;#39;expression d&#x26;#39;ensemble, seulement LNA d&#xE9;bit-FISH, qui a permis la d&#xE9;tection de ARNnc dans des cellules individuelles, par opposition &#xE0; des mesures d&#x26;#39;ensemble lysat &#xE0; base g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;es par qRT-PCR, a &#xE9;t&#xE9; en mesure de saisir l&#x26;#39;h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9; de cellule &#xE0; cellule dans l&#x26;#39;expression ARNnc. En tant que tel, cette &#xE9;tude d&#xE9;montre une nouvelle m&#xE9;thode qui permet &#xE0; la fois la d&#xE9;tection in situ de ARNnc et la d&#xE9;termination de l&#x26;#39;h&#xE9;t&#xE9;rog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9; expression des g&#xE8;nes au sein d&#x26;#39;une population bact&#xE9;rienne isog&#xE9;nique.

Verrouill&#xE9; acide nucl&#xE9;ique et la cytom&#xE9;trie en flux hybridation fluorescente in situ pour la d&#xE9;tection des ARN non codant bact&#xE9;riennes petits

Wir beschreiben die Entwicklung und Pr&uuml;fung einer Hochdurchsatz-Methode, die erm&ouml;glicht die Erkennung von kleinen noncoding RNAs (NcRNAs) aus einzelne bakterielle Zellen, die mit gesperrten Nukleins&auml;ure Sonden (LNA) und flie&szlig;en Cytometry-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (Fluss-Fisch). Der LNA Fluss-FISH-Methode und quantitative reverse Transkription-PCR (qRT-PCR) dienten den Ausdruck der drei NcRNAs (6S, CsrB und TPP-2) in Vibrio Campbellii ATCC BAA-1116 Kulturen w&auml;hrend der Lag-Phase, Mittlerprotokoll Phase und station&auml;re Phase zu &uuml;berwachen. Sowohl LNA Fluss-Fisch und qRT-PCR ergab, dass CsrB und TPP-2 hoch Phase Str&auml;fling aber deutlich reduzierten in Mittlerprotokoll Phase und station&auml;re Phase, ausgedr&uuml;ckt wurden w&auml;hrend 6S Nein zu wenig Ausdruck Phase Str&auml;fling gezeigt, aber danach erh&ouml;ht. Wichtig ist, w&auml;hrend LNA Fluss-Fisch und qRT-PCR &auml;hnlichen Ausdruck Gesamttrend, nur LNA Fluss-FISH,, die Nachweis von NcRNAs in einzelnen Zellen im Gegensatz zu der lysate ans&auml;ssige Ensemble Messungen von qRT-PCR generiert aktiviert nachgewiesen, konnte die Heterogenit&auml;t von Zelle zu Zelle in NcRNA Ausdruck erfassen. So zeigt diese Studie eine neue Methode, die gleichzeitig die in-situ Detektion von NcRNAs und Bestimmung der Gen-Ausdruck-Heterogenit&auml;t innerhalb einer isogene Bakterienpopulation erm&ouml;glicht.

Nukleins&auml;ure gesperrt und flie&szlig;en Cytometry-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung zum Nachweis von bakteriellen kleine noncoding RNAs.

&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;in situ&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#xFF08;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;-FISH&#xFF09;&#x3067;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6838;&#x9178;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#xFF08;LNA&#xFF09;&#x3068;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x86CD;&#x5149;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x7D30;&#x80DE;&#x304B;&#x3089;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x975E;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C9;RNA&#xFF08;ncRNAs&#xFF09;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x6CD5;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3068;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; LNA&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;-FISH&#x6CD5;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x9006;&#x8EE2;&#x5199;-PCR&#xFF08;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30B0;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x4E2D;&#x306B;&#x30D3;&#x30D6;&#x30EA;&#x30AA;campbellii ATCC BAA-1116&#x57F9;&#x990A;&#x6DB2;&#x3067;3 ncRNA&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x3092;&#xFF08;6S&#x3001;&#x7FFB;&#x8A33;&#x578B;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;TPP-2&#xFF09;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C3;&#x30C9;&#x76F8;&#x3001;&#x56FA;&#x5B9A;&#x76F8;&#x3092;&#x8A18;&#x9332;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 6S&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30B0;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5C11;&#x3057;&#x8868;&#x73FE;&#x306B;&#x4F55;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x4E00;&#x65B9;&#x3067;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;LNA&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;-FISH&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306F;&#x3001;CsrB&#x53CA;&#x3073;TPP-2&#x306F;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x30E9;&#x30B0;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30BA;&#x4E2D;&#x306B;&#x767A;&#x73FE;&#x304C;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x4E2D;&#x671F;&#x5BFE;&#x6570;&#x5897;&#x6B96;&#x671F;&#x3068;&#x5B9A;&#x5E38;&#x671F;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x306A;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306E;&#x306F;&#x3001;LNA&#x306E;&#x6D41;&#x308C;-FISH&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x69D8;&#x306E;&#x5F0F;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x50BE;&#x5411;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x4E00;&#x65B9;&#x3067;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;RT-PCR&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BB;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30F3;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EB;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3068;&#x306F;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;ncRNA&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3057;&#x3066;&#x552F;&#x4E00;&#x306E;LNA&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;-FISH&#x306F;&#x3001;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x305F;ncRNA&#x306E;&#x767A;&#x73FE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x9593;&#x306E;&#x7570;&#x8CEA;&#x6027;&#x3092;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x305D;&#x306E;&#x5834;nc&#x200B;&#x200B;RNA&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3068;&#x540C;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D30;&#x83CC;&#x96C6;&#x56E3;&#x5185;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x4E0D;&#x5747;&#x4E00;&#x6027;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x306B;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7D30;&#x83CC;&#x30B9;&#x30E2;&#x30FC;&#x30EB;&#x30CE;&#x30F3;&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;RNA&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;in situ&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x6838;&#x9178;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x86CD;&#x5149;&#x3092;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xC124;&#xBA85; &#xD558; &#xACE0; &#xC7A0;&#xAE34;&#xB41C; &#xD575; &#xC0B0;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544; &#xC138;&#xD3EC; &#xB85C;&#xBD80;&#xD130; &#xC791;&#xC740; noncoding RNAs (ncRNAs)&#xC758; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; (LNA) &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; &#xBC0F; cytometry-&#xD615;&#xAD11; &#xC81C;&#xC790;&#xB9AC; &#xAD50; &#xC7A1; (&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xD750;&#xB984;) &#xD750;&#xB984;. LNA &#xD750;&#xB984; &#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xC640; &#xC591;&#xC801; &#xC5ED; &#xC804;&#xC0AC;-PCR (qRT PCR) &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xB798;&#xADF8; &#xB2E8;&#xACC4;, mid-log &#xC704;&#xC0C1;&#xACFC; &#xACE0;&#xC815; &#xB2E8;&#xACC4; &#xB3D9;&#xC548; &#xBE0C;&#xB9AC; campbellii ATCC BAA-1116 &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; 3 ncRNAs (6S, CsrB, &#xBC0F; TPP-2)&#xC758; &#xC2DD;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB450; LNA &#xD750;&#xB984; &#xC0DD;&#xC120;&#xACFC; qRT PCR &#xACF5;&#xAC1C;&#xB294; Csrb&#xC640; TPP-2 &#xB192;&#xC740; &#xD45C;&#xD604; &#xD588;&#xB2E4; mid-log &#xC704;&#xC0C1; &#xBC0F; &#xACE0;&#xC815; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC9C0;&#xC5F0; &#xB2E8;&#xACC4; 6S &#xB798;&#xADF8; &#xB2E8;&#xACC4; &#xB3D9;&#xC548; &#xC57D;&#xAC04; &#xC2DD; no &#xC2DC;&#xC5F0; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC774;&#xD6C4; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, LNA &#xD750;&#xB984; &#xC0DD;&#xC120;&#xACFC; qRT PCR &#xC2DC;&#xC5F0; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xC804;&#xCCB4; &#xC2DD; &#xB3D9;&#xD5A5;&#xB9CC; LNA &#xD750;&#xB984;-&#xBB3C;&#xACE0;&#xAE30;&#xB97C; qRT PCR&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xC559;&#xC0C1;&#xBE14; lysate &#xAE30;&#xBC18; &#xCE21;&#xC815; &#xBC18;&#xB300;&#xB85C; &#xAC1C;&#xBCC4; &#xC140;&#xC5D0; Ncrnas&#xC758; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; ncRNA &#xC2DD;&#xC5D0; &#xC140;&#xC774; &#xC9C8;&#xC744; &#xCEA1;&#xCC98;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;,&#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; Ncrnas&#xC758; &#xD604;&#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC80;&#xC0C9;&#xACFC; isogenic &#xC138;&#xADE0;&#xC131; &#xC778;&#xAD6C; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4; &#xC2DD; &#xC774;&#xC885;&#xC758; &#xACB0;&#xC815;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xBA74; &#xC0C8; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD575; &#xC0B0; &#xC7A0;&#xAE30;&#xACE0; cytometry-&#xD615;&#xAD11; &#xC81C;&#xC790;&#xB9AC; &#xAD50; &#xC7A1; &#xC138;&#xADE0; &#xC791;&#xC740; noncoding Rnas&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD750;&#xB984;.

Se describe el desarrollo y ensayo de un m&#xE9;todo de alto rendimiento que permite la detecci&#xF3;n de ARN no codificantes peque&#xF1;as (ncRNAs) a partir de simples c&#xE9;lulas bacterianas usando sondas de &#xE1;cido nucleico cerrado (LNA) y citometr&#xED;a de flujo, hibridaci&#xF3;n in situ fluorescente (FISH de flujo). El flujo de LNA-FISH m&#xE9;todo y cuantitativa PCR con transcripci&#xF3;n inversa (QRT-PCR) se utiliza para controlar la expresi&#xF3;n de tres ncRNAs (6S, CsrB, y TPP-2) en el Vibrio campbellii ATCC BAA-1116 culturas durante la fase de latencia, a mediados de fase logar&#xED;tmica, y la fase estacionaria. Tanto el flujo de LNA-FISH y PCR QRT-revel&#xF3; que CsrB y TPP-2 fueron altamente expresado durante la fase de latencia, pero marcadamente reducida en mitad de la fase de registro y la fase estacionaria, mientras que 6S no demostr&#xF3; que la expresi&#xF3;n poco durante la fase de latencia, pero aument&#xF3; a partir de entonces. Es importante destacar que, mientras que el flujo de LNA-FISH y PCR QRT-demostr&#xF3; tendencias similares de expresi&#xF3;n en general, s&#xF3;lo el flujo de LNA-FISH, lo que permiti&#xF3; la detecci&#xF3;n de ncRNAs en celdas individuales en oposici&#xF3;n a las medidas basadas en conjunto lisado generados por QRT-PCR, fue capaz de capturar la heterogeneidad de c&#xE9;lula a c&#xE9;lula en la expresi&#xF3;n ncRNA. Como tal, este estudio demuestra un nuevo m&#xE9;todo que permite simult&#xE1;neamente la detecci&#xF3;n in situ de ncRNAs y la determinaci&#xF3;n de la heterogeneidad de la expresi&#xF3;n g&#xE9;nica dentro de una poblaci&#xF3;n bacteriana isog&#xE9;nica.

Cerrado &#xE1;cidos nucleicos y Citometr&#xED;a de Flujo-hibridaci&#xF3;n fluorescente in situ para la detecci&#xF3;n de bacterias ARN no codificadores peque&#xF1;os

Kelly L. Robertson

Center for Bio/Molecular Science and Engineering

Naval Research Laboratory

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Kelly L. Robertson

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Naval Research Laboratory

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Center for Bio/Molecular Science and Engineering