Mientras que la primera fase de la glucólisis consume energía para convertir la glucosa en gliceraldehído 3-fosfato (G3P), la segunda fase produce energía. La energía se libera a través de una secuencia de reacciones que convierte G3P en piruvato. La fase de liberación de energía (pasos 6-10 de glucólisis) ocurre dos veces, una para cada uno de los dos azúcares de 3 carbonos producidos durante los pasos 1-5.

El primer paso de liberación de energía, considerado el 6o paso de la glucólisis en general, consiste en dos eventos simultáneos: oxidación y fosforilación de G3P. El portador de electrones NAD⁺ elimina un hidrógeno de G3P, oxidando el azúcar de 3 carbonos y convirtiendo (reduciendo) NAD⁺ para formar NADH y H⁺. La energía liberada se utiliza para fosforilar G3P, convirtiéndolo en 1,3-bisfosfoglicéridos.

En el siguiente paso, 1,3-bisfosfoglicéridos convierte el ADP a ATP mediante la donación de un grupo fosfato, convirtiéndose así en 3-fosfoglicéridos. El 3-fosfoglicérido se convierte en un isómero, 2-fosfoglicérido.

Posteriormente, el 2-fosfoglicérido pierde una molécula de agua, convirtiéndose en la molécula inestable 2-fosfoenolpyruvate, o PEP. PEP pierde fácilmente su grupo de fosfato a ADP, convirtiéndolo en una segunda molécula de ATP y convirtiéndose en piruvato en el proceso.

La fase de liberación de energía libera dos moléculas de ATP y una molécula de NADH por azúcar convertida. Debido a que ocurre dos veces, por cada azúcar de 3 carbono producido en la fase de glucosalílisis que requiere energía, se liberan cuatro moléculas de ATP y dos moléculas de NADH. Por lo tanto, para cada molécula de glucosa, la glucólisis da como resultado una producción neta de dos moléculas de ATP (4 producidas menos 2 utilizadas durante la fase de consumo de energía) y dos moléculas de NADH.

La glucólisis produce dos moléculas de piruvato de 3 carbonos a partir de una molécula de glucosa de 6 carbonos. En presencia de oxígeno, el piruvato se puede descomponer en dióxido de carbono en el ciclo Krebs, liberando muchas moléculas de ATP. NADH se acumula en la célula, donde se puede convertir de nuevo en NAD⁺ y se utiliza para la glucolisis adicional.