Enquanto que a primeira etapa da glicólise requer energia para converter glicose em gliceraldeído 3-fosfato (G3P), a segunda etapa produz energia. A energia é libertada ao longo de uma sequência de reações que transformam G3P em piruvato. A etapa de libertação de energia—passos 6-10 da glicólise—ocorre duas vezes, uma vez para cada um dos dois açúcares de 3 carbonos produzidos durante as etapas 1-5.

O primeiro passo de libertação de energia—considerado o 6o passo da glicólise global—consiste em dois eventos simultâneos: oxidação e fosforilação do G3P. O portador de eletrões NAD⁺ remove um hidrogénio do G3P, oxidando o açúcar de 3 carbonos e convertendo (reduzindo) NAD⁺ para formar NADH e H⁺. A energia libertada é usada para fosforilarizar G3P, transformando-o em 1,3-bifosfoglicerato.

No passo seguinte, 1,3-bifosfoglicerato converte ADP em ATP doando um grupo fosfato, tornando-se assim 3-fosfoglicerato. O 3-fosfoglicerato é então convertido em um isómero, 2-fosfoglicerato.

Posteriormente, o 2-fosfoglicerato perde uma molécula de água, tornando-se a molécula instável 2-fosfoenolpiruvate, ou PEP. PEP perde facilmente o seu grupo fosfato para ADP, convertendo-o em uma segunda molécula de ATP e tornando-se piruvato no processo.

A fase de libertação de energia liberta duas moléculas de ATP e uma molécula de NADH por açúcar convertido. Como ocorre duas vezes—para cada açúcar de 3 carbonos produzido na etapa da glicólise que requer energia—quatro moléculas de ATP e duas moléculas de NADH são libertadas. Assim, para cada molécula de glicose, a glicólise resulta em uma produção líquida de duas moléculas ATP (4 produzidas menos 2 usadas durante a fase que requer energia) e duas moléculas de NADH.

A glicólise produz duas moléculas de piruvato de 3 carbonos a partir de uma molécula de glicose de 6 carbonos. Na presença de oxigénio, o piruvato pode ser separado em dióxido de carbono no ciclo de Krebs, libertando muitas moléculas de ATP. O NADH acumula-se na célula, onde pode ser convertido de volta em NAD⁺ e usado para mais glicólise.