Las aminoacil-ARNt sintetasas están presentes tanto en eucariotas como en bacterias. Aunque los eucariotas tienen 20 aminoacil-ARNt sintetasas diferentes para acoplarse a 20 aminoácidos, muchas bacterias no tienen genes para todas estas aminoacil-ARNt sintetasas. A pesar de ello, siguen utilizando los 20 aminoácidos para sintetizar sus proteínas. Por ejemplo, algunas bacterias no tienen el gen que codifica la enzima que acopla la glutamina con su ARNt asociado. En estos organismos, una enzima agrega ácido glutámico a todas las moléculas de ARNt de ácido glutámico, así como a todas las moléculas de ARNt de glutamina. Luego, una segunda enzima modifica químicamente el ácido glutámico en glutamina en las últimas moléculas de ARNt, formando así el par adecuado.

La importancia igual del ARNt y la aminoacil-ARNt sintetasa se estableció mediante una serie de experimentos en los que un aminoácido se convirtió químicamente en un aminoácido diferente después de unirse a su ARNt emparejado. En un experimento de síntesis de proteínas in vitro, estas moléculas "híbridas" de aminoacil-ARNt insertaron el aminoácido incorrecto en cada punto de la cadena peptídica donde se utilizó ese ARNt. Los resultados mostraron que tanto el ARNt como la enzima son igualmente necesarios para la correcta traducción de la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm.

En las células, las aminoacil-ARNt sintetasas utilizan la complementariedad estructural y química para identificar el ARNt correcto que debe acoplarse al aminoácido unido en su sitio activo. La mayoría de las sintetasas de ARNt contienen tres bolsas de unión a nucleótidos adyacentes, cada una de las cuales es complementaria en forma y carga a un nucleótido en el anticodón. Si bien estas bolsas reconocen los nucleótidos específicos en el bucle anticodón del ARNt, los aminoácidos adicionales interactúan con el brazo receptor de aminoácidos, lo que permite que el ARNt correcto encaje en el sitio de síntesis de la enzima.